外泌体携带的非编码RNA作为竞争性内源性RNA参与创面修复的研究进展

Abstract

In recent years, non-coding RNAs (ncRNAs) carried by exosomes have been shown to play an important regulatory role in multiple stages of wound healing. Exosomes can transport ncRNAs to different target cells or tissue and regulate the expression of target genes and downstream molecules. The proposed competing endogenous RNA (ceRNA) hypothesis suggests that RNAs can build a more sophisticated and complex gene regulatory network by competing for common response elements. Therefore, this review focuses on the long ncRNAs and circular RNAs carried by exosomes, discusses their regulatory roles as ceRNAs in the stages of inflammation, cell proliferation, and tissue remodeling in wound repair, respectively, and summarizes the feasibility of ncRNAs carried by exosomes as cell-free therapy, in order to provide a theoretical basis for clinical treatment of wounds.

作为人体中面积最大的器官，皮肤是保护内部组织免受机械损伤、微生物感染、紫外线辐射和极端温度影响的关键结构，这使得它极易受伤。创面修复是创伤后维护皮肤完整性的重要生理过程，主要分为止血、炎症、增殖、重塑这4个反应阶段^[1]。

竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）假说由Salmena等^[2]在2011年提出：假基因、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和环状RNA（circular RNA，circRNA）可以通过共享共同的微小RNA（microRNA，miRNA）反应元件来充当miRNA的海绵，通过抑制miRNA活性来发挥作用。这种借由miRNA的桥梁作用将mRNA与非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）结合起来的调控网，被称为ceRNA调控网络（competing endogenous RNA regulatory network，ceRNET）。

在过去的几十年里，由细胞分泌的外泌体作为一种无细胞替代物受到了广泛的关注。特别是由外泌体递送的ncRNA可以通过ceRNET影响创面修复各个阶段的进程，这将有助于准确定位创面修复的特定生物标志物和潜在的分子靶标，并为如何将目标转录本稳定运送到靶组织提供实验基础与崭新思路。因此，本综述着重阐述lncRNA、circRNA经由外泌体递送后，作为ceRNA在创面修复的炎症、细胞增殖和组织重塑等阶段中所起的调控作用。

1. 外泌体

外泌体是直径为30~150 nm的纳米量级膜性小囊泡，几乎可由所有细胞，包括免疫细胞（如B细胞、T细胞、肥大细胞、树突状细胞）、血小板、癌细胞、上皮细胞、间充质细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等分泌^[3]。外泌体包含供体细胞的许多成分，包括细胞表面蛋白、脂质、代谢物和遗传物质（如DNA、mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA等），这些成分赋予外泌体丰富多样的功能特性^[4-5]。其中，ncRNA作为活性成分，能够从基因组转录并在RNA水平上执行其生物学功能，以调节人类发育、免疫反应、抗原呈递、细胞分化、肿瘤生长和侵袭等多种生物学过程^[3]。

2. ceRNET的形成机制

2.1. 概述

ceRNA通过充当miRNA的海绵以降低靶mRNA的可用miRNA水平，从而影响蛋白合成。miRNA作为ceRNET的核心组分，属内源性表达的小单链RNA（20~25个核苷酸）。miRNA通过不完全结合靶RNA转录物的3′-非翻译区上的miRNA反应元件来抑制其靶基因，并通过分解mRNA或抑制mRNA翻译导致mRNA靶蛋白的表达减少^[6]。由此可见，ceRNET参与到一系列生理病理进程中，如调节血管生成及细胞的增殖、侵袭、转移等，在诸多疾病的发生和发展中发挥重要作用。

2.2. lncRNA-miRNA-mRNA

lncRNA是一组松散分类的长RNA转录物，没有明显的蛋白质编码作用，长度 > 200个核苷酸。lncRNA在基因组位点的印记、染色体形状的塑造和酶功能的变构控制等重要的生物学过程中发挥作用，可通过支架、诱饵、信号、导向等不同机制调控靶基因发挥功能^[7]。lncRNA可包含1个或多个miRNA的结合位点，在lncRNA-miRNA-mRNA网络中通过吸附miRNA，竞争性影响靶基因mRNA的丰度，从而影响其对应的蛋白质水平，调节基因表达。其中，位于lncRNA上的miRNA结合位点越多，竞争关系就越强^[8]。

2.3. circRNA-miRNA-mRNA

ceRNA的另一个新兴类型是circRNA。结构上，circRNA通过在3′和5′末端共价结合形成外显子和/或内含子的闭环^[9-10]。由于呈封闭环状结构，因此circRNA不受核酸外切酶的影响，具有组织细胞选择性、结构稳定性和序列保守性，并在哺乳动物细胞中广泛表达^[11]。功能上，circRNA是ceRNA的组成部分，可以通过充当miRNA的海绵来调节转录和转录后亲本基因的水平，其吸附的miRNA不能与靶mRNA结合，可解除miRNA对下游mRNA的抑制作用，导致靶mRNA表达增加^[11]。

3. 外泌体携带的ncRNA通过ceRNET参与创面修复的作用机制

越来越多的研究表明，lncRNA-miRNA-mRNA和circRNA-miRNA-mRNA在创面修复中起到了重要的调节作用，而外泌体则是这些核酸的递送者，并由此调节靶基因以及下游分子的表达（图 1）。

图 1.

外泌体携带的非编码RNA在创面修复中的作用机制

注：VEGF为血管内皮生长因子，FGF为成纤维细胞生长因子，KLF2为Krüppel样因子2，circRNA为环状RNA，lncRNA为长链非编码RNA，miRNA为微小RNA，SOX9为性别决定区Y框蛋白9，Fb为成纤维细胞，KC为角质形成细胞，PTEN为人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物，ECM为细胞外基质；图中黑色箭头表示促进，蓝色箭头表示分泌，绿色箭头表示结合，红色箭头表示抑制，黄色箭头表示极化

3.1. 外泌体携带的lncRNA通过ceRNET参与创面修复的作用机制

3.1.1. 炎症阶段

lncRNA可通过多种途径调节创面修复的炎症反应。许多研究表明，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B途径作为一个关键的信号通路，可以在糖尿病肾病背景下对高葡萄糖引起的细胞凋亡起到保护作用，而人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN）的缺失可能导致蛋白激酶B的异常磷酸化^[12]。有研究表明PTEN是miRNA-152-3p的靶基因，而lncRNA H19是影响miRNA-152-3p水平的转录反义RNA^[13]。在糖尿病足溃疡小鼠的Fb中miRNA-152-3p高表达，lncRNA H19和PTEN低表达。在一项体外实验中，用源自过表达lncRNA H19的小鼠间充质干细胞的外泌体处理糖尿病足溃疡患者的Fb后，lncRNA H19通过与miRNA-152-3p竞争性结合，使人Fb中PTEN含量升高以抑制Fb的凋亡和创面的炎症反应，同时促进Fb的增殖和迁移^[13]。因此，lncRNA可通过影响氧化应激相关的信号通路来调节创面炎症。

此外，外泌体中的lncRNA可以通过调节巨噬细胞状态来抑制创面炎症，从而促进创面修复。根据活性，巨噬细胞分为2个主要亚群。M1型巨噬细胞促进炎症和抑制细胞增殖，而M2型巨噬细胞抑制炎症和促进细胞增殖，巨噬细胞由M1型向M2型转变，从而调节炎症反应，是促进创面修复的关键因素^[7]。肺腺癌转录相关转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是一种lncRNA，Kuang等^[14]在体外研究中得出，源自人类KC的外泌体携带的MALAT1与miRNA-1914-3p竞争性结合，提高乳脂球表皮生长因子8的表达，从而通过增强人巨噬细胞的吞噬作用、促进人巨噬细胞转化为促创面修复的表型、减少人巨噬细胞凋亡来促进创面修复。与此同时，此研究还证明在糖尿病小鼠创面的在体模型中，MALAT1可通过该ceRNET抑制TGF-β₁/Smad 3信号通路，从而抑制小鼠ECM沉积和异常胶原蛋白积累，进而减少创面修复过程中的瘢痕形成。以上证据表明，lncRNA可由外泌体运载以加速创面修复的炎症进程。

3.1.2. 细胞增殖阶段

3.1.2.1. 调节Fb和KC增殖

Fb可通过分泌ECM来促进肉芽组织的形成^[15]。研究表明，源自人脂肪间充质干细胞的外泌体中的lncRNA H19，可通过吸附miRNA-19b以上调性别决定区Y框蛋白9的表达，从而加速小鼠的创面修复^[16]。另一项研究提出了细胞外囊泡模拟纳米囊泡的递送方式，证明了具有较高lncRNA H19含量的细胞外囊泡模拟纳米囊泡可在体外促进糖尿病大鼠模型上皮细胞增殖、迁移和血管形成，并通过恢复蛋白激酶B的活力促进大鼠的再上皮化和体内血管生成^[17]。MALAT1相关研究多集中在癌症方面，其在创面修复中的作用机制研究尚处于起步阶段。He等^[18]证实源自人脂肪间充质干细胞的外泌体中的MALAT1通过靶向miRNA-124从而激活Wnt/β连环蛋白通路，在过氧化氢造成的人体外皮肤病变模型中促进人类永生化表皮细胞和人皮肤Fb的增殖和迁移。同样地，源自人脂肪间充质干细胞的外泌体中的MALAT1还可以通过miRNA-378a/FGF2轴调节小鼠的创面修复，其中MALAT1沉默导致miRNA-378a过表达，进而下调FGF2表达，最终抑制小鼠Fb的迁移和增殖^[19]。此外，MALAT1还可源自人富血小板血浆的外泌体，MALAT1可通过充当miRNA-374a-3p的海绵以上调DNA甲基转移酶3a，进而增加糖尿病足患者Fb的活性并抑制Fb凋亡^[20]。在全层皮肤缺损创面小鼠模型中，源自小鼠脂肪间充质干细胞的外泌体通过递送lncRNA X染色体失活特异性转录本作为miRNA-96-5p的海绵以靶向盘状结构域受体2，从而促进小鼠真皮Fb的增殖和迁移，加速小鼠的创面修复^[21]。上述均属于MALAT1促进Fb增殖的相关机制，进一步探索MALAT1的下游调控机制可能会为外泌体相关创面治疗提供理论支持。

此外，KC可通过大量增殖和有序迁移逐步完成创面皮肤组织的再上皮化过程，是创面修复细胞增殖阶段的关键细胞。KC自噬的活化可通过促进KC的增殖和迁移来改善小鼠的创面。有研究者在小鼠背部创面模型中观察到lncRNA核富集转录体1/miRNA-17-5p/unc-51样自噬激活激酶这一调节轴，源自小鼠脂肪间充质干细胞的外泌体通过释放lncRNA核富集转录体1以负调控miRNA-17-5p表达，从而激活下游的自噬调节因子，提高小鼠KC的自噬活性^[22]。该研究首次将源自小鼠脂肪间充质干细胞的外泌体与自噬联系起来，为外泌体在创面修复中的应用提供了新的线索。这些研究表明，外泌体携带的lncRNA可作为有前景的辅助药物，经由ceRNET来增强细胞增殖以促进创面修复。

3.1.2.2. 调节血管生成

血管生成是创面修复中的关键过程，而外泌体中携带的lncRNA也有参与。研究人员采用免疫功能低下的裸鼠模型来评估源自小鼠骨髓间充质干细胞的外泌体对体内血管生成的作用，证明外泌体释放的lncRNA H19可吸附miRNA-106并上调靶基因血管生成素1的表达，从而促进小鼠内皮血管的生成^[23]。另一项研究显示，源自人骨髓间充质干细胞的外泌体携带的lncRNA Krüppel样因子3-反义RNA1可充当miRNA-383的海绵，上调靶因子VEGF的水平来加速糖尿病小鼠皮肤创面的修复^[24]。另外，Shyu等^[25]研究证明，源自人冠状动脉内皮细胞的外泌体中的MALAT1可以在高压氧条件下作为miRNA-92的海绵，上调Krüppel样因子2的水平，显著增强后肢缺血大鼠模型中血管内皮细胞的增殖能力，提示含有MALAT1的外泌体可作为高压氧条件下促进血管生成的重要治疗分子。

3.1.3. 组织重塑阶段

组织重塑是创面修复后期的重要阶段，ECM在此阶段为细胞提供合适的微环境，Ⅲ型胶原蛋白逐步转化为Ⅰ型胶原蛋白^[26]。研究人员在细胞共培养系统中，观察到源自人M2型巨噬细胞的外泌体可通过释放lncRNA核骨架与细胞骨架复合物01605负调控miRNA-493-3p的分泌，上调蛋白激酶B的表达，从而增加人真皮Fb的纤维化，促进增生性瘢痕的形成^[27]。类似地，在另一项模拟瘢痕微环境实验中，研究者观察到反义lncRNA5088富集在源自人M2型巨噬细胞的外泌体中，该lncRNA可以作为miRNA-200c-3p的海绵，从而上调小鼠创面中谷氨酰胺酶和α平滑肌肌动蛋白的表达，以促进小鼠Fb活化和ECM的产生^[28]。上述2个研究中均用到了外泌体分泌抑制剂GW4869，其是一种可逆的中性鞘磷脂酶抑制剂，在瘢痕形成后期局部注射GW4869可阻断lncRNA有效递送到Fb中，减少纤维化和瘢痕增生。

3.2. 外泌体携带的circRNA通过ceRNET参与创面修复的作用机制

3.2.1. 炎症阶段

在源自缺氧预处理的人脂肪间充质干细胞的外泌体中，circRNA小核仁RNA宿主基因可以通过调节miRNA-144-3p/缺氧诱导因子1α来促进糖尿病小鼠在高糖条件下的M2型巨噬细胞极化，即通过作用于炎症阶段的这一主要效应细胞来加速创面修复^[29]。在另一项相似研究中，研究者针对上述同样的ceRNET进行研究，考虑到递送circRNA的外泌体生物活性低、作用持续时间短等因素，开发了负载源自缺氧预处理的小鼠脂肪间充质干细胞的外泌体的甲基丙烯酸酐化水凝胶，从而适应不规则的糖尿病创面^[30]。这不仅可以作为糖尿病创面修复的潜在治疗策略，还可为烧伤治疗和残肢修复的临床应用提供新思路。

3.2.2. 细胞增殖阶段

关于circRNA作为ceRNA在创面修复增殖阶段的相关机制研究仍然较少，多未提及外泌体的运载作用。在一项中医药治疗糖尿病创面的研究中，研究人员观察到“生肌化瘀方”可降低糖尿病小鼠创面组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的产生，且circRNA角蛋白13/miRNA-665-3p/整合素α3和circRNA角蛋白14/miRNA-706/肌球蛋白轻链激酶4通路可能在糖尿病小鼠创面修复的再上皮化中发挥重要作用，但其具体机制与外泌体递送方式仍有待明晰^[31]。

circRNA在血管形成方面也有重要作用。有研究者采用红色诺卡菌细胞壁骨架预处理人脐带间充质干细胞后，观察到源自人脐带间充质干细胞的外泌体中的circRNA异亮酰胺-转运RNA合成酶1表达增加，该circRNA可通过吸附miRNA-4782-5p正向调控VEGFA，促进小鼠内皮细胞的血管生成^[32]。源自人脐带间充质干细胞的外泌体富含circRNA同源结构域相互作用蛋白激酶3（homeodomain interacting protein kinase 3，HIPK3），HIPK3可充当miRNA-20b-5p的海绵并上调核因子E2相关因子2以增加VEGFA的表达，显著促进糖尿病小鼠的血管再生和创面修复^[33]。上述研究都为无细胞疗法治疗糖尿病创面提供了一定参考。在创面修复进程中，氧化应激反应会引发中性粒细胞炎性浸润、蛋白酶释放增加和大量氧化中间产物产生，最终导致细胞死亡，是慢性创面难愈的重要因素之一。有研究显示在源自缺氧预处理的小鼠心肌细胞的外泌体内，HIPK3通过充当miRNA-29a的海绵，负调控miRNA-29a以增加胰岛素样生长因子Ⅰ的表达，从而减少在体外氧化应激条件下诱导的小鼠心脏微血管内皮细胞功能障碍，加速创面修复^[34]。因此，circRNA对创面修复中血管内皮细胞生成的调节也可能与氧化应激调节有关。还有研究表明在源自小鼠脂肪间充质干细胞的外泌体中，circRNA_0001052通过下调miRNA-106a-5p并靶向升高FGF4以促进小鼠血管内皮细胞的增殖、迁移和血管生成^[35]。而在Shi等^[36]研究中，从circRNA_0000250调节的脂肪间充质干细胞中分离的外泌体在体外通过诱导miRNA-128-3p/沉默信息调节因子1介导的自噬，可抑制高糖诱导的糖尿病大鼠血管内皮祖细胞的凋亡，并促进大鼠血管内皮祖细胞增殖和血管生成，以加速糖尿病创面修复。因此，外泌体携带的circRNA可通过ceRNET在细胞增殖和血管生成中发挥关键作用，有望成为相关创面治疗的潜在靶点。

4. 总结与展望

本文总结了ceRNA参与炎症的发生以及细胞的增殖、凋亡和自噬等过程，通过调控下游分子的表达以加剧或延缓创面修复的进展，显示出ceRNA作为治疗靶点的潜力。需要指出的是，ceRNET在创面修复领域中仍处于起步阶段，目前对ceRNET的研究还主要集中在单个ceRNA的鉴定和验证上，且研究主要集中于细胞增殖和血管生成两大阶段中，在止血、炎症和组织重塑等阶段的研究仍有待进一步完善。

与此同时，目前大部分关于ncRNA在创面修复中的研究都是基于裸核酸的作用，而裸核酸存在稳定性差、靶向性差等不足。相反，含有核酸的外泌体可以在体内停留更长时间，且稳定性高、来源广泛，具有较好的临床应用前景。然而，针对外泌体的提纯成本高、靶向性较弱等问题，仍需开展更加深入的研究，也需要交叉学科的融入和新型复合材料的助力。鉴于外泌体在体内存留时间较短，可考虑将外泌体包裹在水凝胶等生物材料中，且该联合应用已被证实比单独使用外泌体或敷料表现出更好的修复效果，提示将生物材料与生物大分子有机结合可能是创面修复的新兴方向。综上，外泌体携带的ncRNA作为无细胞疗法在创面修复中具有良好前景，在未来研究中应聚焦于ceRNET作用通路的完善和外泌体分离、纯化与提取技术的改良，为实际临床应用奠定基础。

Funding Statement

国家自然科学基金青年科学基金项目（82301577）；上海市青年科技英才扬帆计划（21YF1418800）

Youth Science Fund Program of National Natural Science Foundation of China (82301577); Shanghai Sailing Program (21YF1418800)