皮肤γδT细胞各亚群在创面再上皮化过程中的调控作用及其相关机制

Abstract

再上皮化过程是决定皮肤创面愈合进程的核心环节之一。表皮干细胞增殖分化形成新生表皮组织是再上皮化的组织学基础, 而表皮干细胞—前体细胞—终末细胞这一细胞分化过程顺利进行是新生表皮组织不断形成的细胞学基础。表皮干细胞增殖及分化为前体细胞是新生表皮组织增殖潜力的决定因素, 而前体细胞扩增及分化为终末细胞是决定新生表皮组织形成速度的关键因素。组织微环境在创面再上皮化过程中发挥关键的调控作用, 而细胞生长因子和炎症介质是构成创面组织微环境的2个重要组成成分, 分别在表皮干细胞增殖分化的不同环节发挥调节作用, 协同促进创面再上皮化顺利进行。γδT细胞是皮肤免疫系统中的重要组成部分, 其不同亚群分别通过分泌生长因子和炎症因子在动态塑造早期创面微环境中起关键作用。本文从创面免疫微环境的角度出发, 简要论述皮肤γδT细胞在维持表皮干细胞增殖分化平衡以及调控创面再上皮化中的作用, 为难愈性创面的预防及治疗提供新方向。

皮肤是机体重要的屏障, 来自环境不同强度、不同类型的刺激和压力, 如化学刺激、微生物刺激、紫外线刺激等都会对皮肤的稳态造成影响^[1-2]。受损情况下, 皮肤进行快速有效的修复是维持其完整性的重要过程。创面修复过程可分为凝血、炎症、增殖和重塑4个阶段^[3], 而不同阶段又存在交叉和重叠。创面中包括KC、表皮干细胞、免疫细胞等各种细胞之间的交互和影响是创面修复的保障, 其中免疫细胞可通过构建免疫微环境调控表皮干细胞的增殖分化来影响皮肤再上皮化进程, 进而在创面愈合中发挥重要作用。基于此, 本文立足免疫微环境对创面愈合的重要调节作用, 对皮肤内最主要的免疫细胞——γδT细胞调控表皮干细胞的作用进行系统归纳。

1. 表皮干细胞的增殖分化平衡是创面愈合的关键

皮肤创面迅速再上皮化形成新生表皮组织的过程在创面愈合中起关键作用。新生表皮组织维持的旺盛增殖潜能和较高抗凋亡能力是其不断扩增并完成再上皮化的必要条件, 而表皮干细胞及其前体细胞数量是其中的关键因素^[4-5], 而这一关键因素又取决于表皮干细胞自身增殖及其向前体细胞和终末细胞分化之间的平衡。因此, 表皮干细胞增殖—分化为前体细胞—分化为终末细胞各环节之间的平衡和有序进行是再上皮化顺利完成的细胞基础^[6]。此外, 创缘表皮组织免疫微环境在创面再上皮化过程中也发挥关键的调节作用, 而各种细胞因子的动态变化在塑造免疫微环境中起至关重要的作用^[7-8]。本研究把影响表皮干细胞增殖分化的细胞因子大致分为2类：EGF和炎症因子^[9]。EGF主要通过增强表皮干细胞增殖和分化为前体细胞进而使表皮干细胞在保证增殖潜能的基础上促进再上皮化^[10-11], 炎症因子则通过强烈刺激表皮前体细胞扩增和分化为终末细胞促进再上皮化^[9]。EGF不足或过度炎症导致的炎症介质过度累积, 均会引起表皮干细胞增殖速度严重滞后于前体细胞增殖和分化为终末细胞的速度, 最终导致新生表皮组织增殖潜能耗竭, 再上皮化过程障碍^[12-13]；而炎症介质不足则会引起表皮前体细胞扩增并分化为终末细胞的速度下降, 进而导致新生表皮组织增生速度下降, 最终导致再上皮化过程减缓^[13-14]。糖尿病患者急性创面早期愈合速度慢的一个重要原因, 是创面早期炎症反应低下引起炎症介质分泌减少, 导致新生表皮组织生长缓慢^[14]；而糖尿病难愈性创面后期往往伴随过度炎症, 引起创面炎症介质过度积累导致新生表皮组织增殖潜能耗竭, 创面迁延不愈^[15-16-17]。

2. 皮肤内γδT细胞的基本特性和分布

γδT细胞是构成皮肤黏膜免疫系统的重要免疫细胞之一, 具有先天免疫细胞和获得性免疫细胞的双重特性, 是连接先天免疫和后天免疫的桥梁, 在皮肤损伤早期可通过提供生长因子和炎症介质在塑造皮肤创面免疫微环境中发挥关键作用。与αβT细胞不同, γδT细胞不需要专职抗原呈递细胞辅助就能够通过其膜表面T细胞受体γδ分子直接识别应激性抗原、磷酸化抗原以及热激蛋白同源分子等多种形式的抗原而被迅速激活, 主要在创面免疫反应早期发挥作用^{[2, 18-19]}。皮肤免疫系统中γδT细胞主要由Vγ5T细胞和Vγ4T细胞这2种T细胞亚群构成, 其中Vγ5T细胞又被称为树突状表皮T细胞（dendritic epidermal T cell, DETC）, 特异性地分布于小鼠表皮组织中；而Vγ4T细胞则广泛分布于小鼠淋巴结、脾脏、外周循环系统以及皮肤真皮组织中。皮肤受损后, Vγ5T细胞、Vγ4T细胞迅速被激活并分别分泌大量胰岛素样生长因子（IGF）等EGF和IL-17/γ干扰素等炎症因子, 共同在创面愈合早期免疫微环境的调节中起关键作用^[10]。

3. DETC对表皮干细胞增殖分化过程的调控作用以及对创面再上皮化的影响

生理情况下, 树突状结构的DETC主要通过黏附分子定植于表皮组织基底层并形成密集网络^[20]。皮肤受损后, 创面周围的DETC通过T细胞受体识别表皮细胞目前未知配体而迅速活化, SKINT、JAML、NKG2D、CD100等共刺激信号受体也在DETC活化过程中起重要作用^[17]。值得注意的是T细胞生长因子IL-15, 而不是IL-2, 在DETC完全活化过程中是必不可少的^[21]。DETC活化后, 迅速失去树突状结构变成圆形并下调表面黏附分子αEβ4的表达, 导致DETC与表皮细胞黏附性下降顺利完成脱黏附过程；同时活化的DETC可上调包括趋化因子受体6（CCR6）等CCR的表达, 在创面中的包括CCL20在内的高浓度炎症趋化因子诱导下, 迅速迁移到创缘表皮组织中^[22-23]。激活后的DETC可产生大量IGF-Ⅰ等EGF, 这些生长因子与作用于表皮干细胞上的包括IGF-Ⅰ受体、ins受体等生长因子受体结合后, 可迅速招募并直接激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白C2（mTORC2）信号通路；同时, 激活后的DETC通过磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和mTORC2 2条途径直接磷酸化下游信号分子Akt激酶并进一步激活mTORC1信号通路, 从而形成IGF-Ⅰ-mTORC2-mTORC1轴信号通路^[24-25]。mTORC1信号活化后, 其下游分子Grb10、S6K可通过不同途径反过来抑制mTORC2信号, 形成生理性负反馈, 防止细胞内mTOR信号通路过度活化^[26-27]。以mTORC2活化为主导的mTOR信号通路极有可能是生长因子促进表皮干细胞增殖分化而同时抑制表皮前体细胞向终末细胞过度分化的关键机制。这保证了创面新生表皮组织在维持增殖潜能基础上实现再上皮化过程的可持续性。DETC并非单向调控表皮细胞的增殖分化, 表皮细胞也可以反向调控DETC。本研究团队观察到, 表皮细胞在IGF-Ⅰ等生长因子作用下可激活以mTORC2为主导的mTOR信号通路并分泌大量IL-15, IL-15又反过来增强DETC的活化增殖功能, 最终形成IGF-Ⅰ-IL-15正反馈环路, 放大DETC促再上皮化作用^[10]。综上, DETC能够通过功能性分泌IGF-Ⅰ等EGF与表皮细胞分泌的IL-15形成正反馈环路, 不断强化DETC对表皮干细胞增殖与分化之间平衡的调控作用, 促进皮肤创面愈合过程顺利进行。此外, 活化后的DETC能通过增加CCL3、CCL4、CCL5、单核细胞趋化蛋白1和XCL1的表达^[28], 诱导包括中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞的迁移, 从而使创面中形成足够强度的免疫反应。

4. Vγ4T细胞对表皮干细胞增殖分化的调节作用及对创面再上皮化的影响

皮肤真皮组织中的γδT细胞包括Vγ1T细胞、Vγ5T细胞、Vγ6T细胞和Vγ7T细胞等^[29]亚群, 其中Vγ4T细胞占50%左右^[10]。在小鼠中Vγ4T细胞位于二级淋巴器官, 其从胸腺迁出后即获得干细胞的特性, 如长时间存活、自我更新和放射抵抗等。皮肤受损后, 表皮中将近一半的IL-17A阳性细胞是Vγ4T细胞, 位于真皮组织中的Vγ4T细胞被激活后可分泌IL-17A、γ干扰素、IL-17F、IL-22等细胞因子^[30], 同时Vγ4T细胞在表皮组织中高表达炎症趋化因子CCL20的作用下被招募到创缘表皮组织中, 与高表达IL-1β/IL-23等促炎因子的受损表皮细胞形成IL-1β/IL-23-IL-17A正反馈环路, 从而不断放大表皮组织炎症反应^[24]。IL-17A作为一种重要的促炎因子在炎症反应的启动和放大中发挥重要作用, 也是皮肤创面有效愈合所必需的^[1]。IL-17A敲除小鼠的创面愈合延迟, 但可通过外源性给予重组IL-17A或IL-17A阳性的Vγ4T细胞得到恢复。此外, 将IL-17A阳性的Vγ4T细胞转移到创基也可以改善创面愈合效果。然而, IL-17A等炎症因子在皮肤创面修复中的作用一直存在争议, 有研究者观察到抑制IL-17A等炎症因子的表达也可显著促进创面愈合^[31]。为理解IL-17A在皮肤创面愈合中矛盾的客观现象, 本研究系统性观察了IL-17A对表皮干细胞增殖分化的影响。与EGF类似, 许多炎症因子如IL-17A/TNF-α等都具有强烈的刺激表皮细胞增殖的作用, 其中核因子κB信号通路的活化更是起了十分重要的作用^[32]；但与EGF主要刺激表皮细胞自我增殖和向前体细胞分化不同, 炎症因子主要通过刺激表皮前体干细胞迅速增殖并分化为终末细胞实现表皮细胞的扩增^[9], 最终导致炎症因子在实现刺激表皮前体干细胞快速增殖的同时使表皮干细胞迅速耗竭以及终末细胞比例急性增加。对于小面积创面, 机体不必动员表皮干细胞增殖潜能, 而表皮组织只需在炎症因子的刺激下进行快速增殖分化即可完成创面封闭^[33]；对于大面积创面, 机体则不得不动员表皮干细胞的增殖潜能, 通过表皮干细胞增殖—分化为前体细胞—分化为终末细胞各环节之间的平衡来完成创面封闭；当创面长期处于过度炎症环境时, 上述增殖分化平衡会被打破, 导致新生表皮组织增殖潜能耗竭, 创面再上皮化障碍^[17]。这就比较好地解释了糖尿病患者皮肤损伤早期缺乏炎症以及后期过度炎症都导致创面愈合延迟及障碍^{[13-14, 16]}。此外, 创面中活化的Vγ4T细胞可通过淋巴引流的方式向淋巴结迁移, 然后在淋巴结内大量增殖并通过上调CCR2和S1PA的表达又迁移进入创面^[34-35], 进一步增强创面局部的炎症反应。在咪喹莫特诱导的小鼠模型中观察到, Vγ4T细胞具有类似记忆细胞的特性, 在二次接触后能快速启动相关反应^[34]。

5. 小结与展望

γδT细胞是表皮及真皮内主要的T淋巴细胞, 它参与了抗菌屏障的维持、自身免疫性皮肤疾病的发生发展、皮肤移植后排斥及肿瘤的干预^{[10, 36]}, 在皮肤受损后可通过模式识别的方式快速识别相关抗原、及时发出信号、募集炎症细胞并使之迁移至创面, 协同产生足够强度的炎症反应, 因此被认为是创伤早期重要的参与细胞。近期的研究显示, γδT细胞在创面愈合中的作用是持续的, 是贯穿炎症期和增殖修复期的, DETC与表皮细胞相互作用形成IGF-Ⅰ-IL-15正反馈环路, 通过产生大量EGF, 调控表皮干细胞增殖—分化为前体细胞这一环节；而Vγ4T细胞与表皮细胞相互作用形成的IL-1β/IL-23-IL-17A正反馈环路, 通过产生大量炎症因子调控表皮前体细胞—分化为终末细胞环节, EGF和炎症因子相互协同达成表皮干细胞增殖—分化为前体细胞—分化为终末细胞各环节之间的平衡来顺利完成创面再上皮化过程^[10]。进一步研究表明, 持续的炎症介质积累能够诱导DETC从分泌生长因子为主转变成分泌炎症因子为主, 这会导致创面免疫微环境中生长因子与炎症介质之间的动态平衡被进一步打破, 创面再上皮化障碍。而创面过度炎症导致创面炎症介质过度积累是烧伤创面不同于普通皮肤创面的一个重要特点, 这也可能是烧伤后创面过度炎症引起创面迁延不愈乃至形成难愈性创面的一个重要原因。

上述研究结果潜在的科学意义包括：（1）表皮干细胞增殖—分化为前体细胞—分化为终末细胞的平衡是再上皮化的关键, 维持各环节的平衡能促进创面的高效修复, 各环节的失衡是慢性创面、难愈性创面形成的基础；（2）免疫微环境的失衡是导致上述各环节失衡的关键因素, 及时恢复免疫微环境的平衡, 是恢复干细胞增殖分化平衡的保障, 因此临床上常观察到单独补充表皮干细胞无法获得良好的创面修复效果^[37], 如果能合并改善免疫微环境, 创面修复的效果可能会得到明显改善；（3）γδT细胞是表皮干细胞功能失衡的重要参与细胞, 通过调控γδT细胞的功能, 可以控制创面愈合的效率, 但具体作用的靶点和方式仍需进一步研究。可以肯定的是, γδT细胞不是唯一导致表皮干细胞功能失衡的因素, 进一步开展研究发掘导致表皮干细胞增殖分化失衡的原因, 包括细胞和细胞因子等, 将对后期促进创面愈合提供更多新的方法。

Funding Statement

国家自然科学基金面上项目（31872742、82172232）；军队医学科技青年培育计划（20QNPY024）；陆军军医大学科技创新能力提升专项（2019XQY12）

General Program of National Natural Science Foundation of China (31872742, 82172232); Military Medical Science and Technology Youth Training Program (20QNPY024); Science and Technology Innovation Capability Improvement Project of Army Military Medical University (2019XQY12)