瘢痕疙瘩中的成纤维细胞特性研究进展

Abstract

In re-cent 20 years, the development of cell biology technology has promoted the research of keloid. Keloid fibroblasts (KFbs) are the main effector cells in keloid, which are closely related to the occurrence and development of keloid. It is significantly different in terms of biological characteristics and gene expression between KFbs and normal fibroblasts. This articles reviews the characteristics of KFbs from multiple perspectives, describing its biological characteristics in details including microstructures, metabolic characteristics, and proliferation properties, and introducing the main characteristics of heterogeneity and genomics of KFbs. The further research on KFbs will help to elucidate the pathogenesis of keloids and provide valuable strategies for the prevention and treatment of keloids.

瘢痕疙瘩是一种皮肤内结缔组织异常增生所致的病理性瘢痕，自发形成或继发于皮肤外伤。瘢痕疙瘩影响患者外观，发病部位存在疼痛、瘙痒等症状，给患者身心带来伤害，但其发病机制尚不明确。该病多发于亚洲人种，缺乏有效的治疗手段且极易复发^[1]。瘢痕疙瘩Fb（KFb）是瘢痕疙瘩中的主要效应细胞，可合成大量胶原等ECM，是目前瘢痕疙瘩中研究较广的细胞。本文从多个角度对KFb的特性进行了综述，详细描述了其生物学特性如显微结构、代谢特点、增殖性质等情况，并介绍了KFb的异质性与基因组学等方面的主要特征，旨在为瘢痕疙瘩的基础研究与临床治疗提供参考。

1. KFb的生物学特性

1.1. 显微结构与分泌功能

1960年，有学者首次成功在体外培养了人Fb，并将其分为3个类型：Ⅰ型细胞呈长菱形排列，占多数；Ⅱ型细胞呈扁平样，胞体较大；Ⅲ型细胞为正常Fb（NFb），呈卵圆形，核仁较大。这一研究开启了体外研究瘢痕疙瘩的新阶段，其后的研究分别对KFb的显微结构进行了不同程度阐述。光学显微镜下，KFb呈多角形或长梭形、胞核大、胞质多、核质比高；透射电镜下，KFb细胞器发达、线粒体数量多，高尔基体分泌泡多、核糖体密集、内质网数量多、粗面内质网占比高、胞质内胶原含量高，这些结构与KFb旺盛的合成与分泌功能密切相关，也与病理上瘢痕疙瘩中ECM的过度沉积现象一致。此外，KFb排列紊乱，虽然仍具有NFb的纺锤形结构，但极性消失且有明显的交叉重叠现象。

ECM由纤维性结构分子、非纤维性结构分子和基质蛋白组成，其中胶原蛋白是ECM三维结构的主要组分。大量研究证实，KFb分泌ECM功能发生异常，主要表现为胶原过度合成^[2-3]、Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原比值上升^[4]、纤维连接蛋白^[5]、弹性蛋白、黏多糖的合成增加等。Ashcroft等^[6]利用原代KFb培养液培养NFb，结果显示NFb增殖率升高、迁移性增强、合成Ⅰ型胶原与纤维连接蛋白的能力大幅提高，这提示KFb可以通过旁分泌功能分泌多种生长因子如IL-6、抑瘤素M等^[7]。KFb的旺盛分泌能力和细胞间结构关系的变化表明，KFb已具有部分肿瘤细胞特征。

1.2. 代谢

2005年有学者观察到，人KFb中的DNA及蛋白质合成速率较增生性瘢痕及正常皮肤明显加快。此外，瘢痕疙瘩患病人群中KFb摄取葡萄糖的速率较周围组织细胞明显加快。Vincent等^[8]测定了人KFb中糖代谢相关酶的活性，结果表明KFb较NFb具有更高的糖酵解酶（己糖激酶、GAPDH和乳酸脱氢酶）活性；该研究同时观察到糖酵解抑制剂可呈剂量依赖性地降低KFb的增殖活性，且KFb代谢过程中生成较多乳酸，提示糖酵解可能是KFb的主要供能方式。这与肿瘤细胞的供能方式，即Warburg效应^[9-10]一致。近年的研究也证实了人KFb中确实存在Warburg效应，但KFb代谢模式形成的具体原因仍不明确。部分研究认为，KFb与肿瘤细胞类似，可通过糖酵解途径满足细胞快速增殖的需要，为细胞合成蛋白质、脂类、核酸等提供大量碳源；同时，KFb可以避免有氧氧化所产生的氧自由基对自身的损害，进而逃避细胞凋亡。国内学者观察到，人KFb线粒体超微结构发生了明显改变，细胞内存在巨线粒体，该线粒体中的融合及分裂相关基因表达均明显增高，线粒体存在融合分裂紊乱和功能缺陷，因此，该研究从线粒体缺陷的角度解释了KFb选择Warburg效应作为主要代谢模式的原因^[11]。

1.3. 增殖、衰老与凋亡

正常状态下，细胞的增殖、衰老与凋亡受到基因的精密调控，机体通过及时清除衰老及受损细胞维持内环境稳态。而瘢痕疙瘩不会自然消退且呈现不受控生长，这一特性与肿瘤细胞的无限制生长、逃避凋亡相似，提示KFb与肿瘤细胞类似，具有原癌基因与抑癌基因的表达失衡及信号分子调节异常。有研究证实人KFb增殖能力较NFb高^[12-13]。细胞增殖分化过程中，细胞周期由G1期向S期转换过程中有3个主要的负向调控通路相互连接，即p16INK4a-细胞周期素D/细胞周期蛋白依赖性激酶4-Rb、p14生长素响应因子-E3泛素连接酶2-p53-p21CIP1、p27KIP1-细胞周期素E-细胞周期蛋白依赖性激酶2。季江等^[14]证实在人KFb中，细胞周期相关基因p16、p21、p27的mRNA表达低于NFb，这导致KFb增殖的负向调控受阻。此外，p53基因突变、p53蛋白功能失活也被认为与KFb具有较高的增殖活性有关^[15]。

细胞衰老与DNA端粒进行性缩短有关。端粒酶是一种特殊的核蛋白转录酶，可通过延长缩短的端粒而增强细胞增殖能力。端粒酶在多数体细胞中低表达或不表达，而在肿瘤细胞中端粒酶因被激活而呈高表达状态，参与细胞的恶性转化。研究证实，人KFb中同样存在端粒酶高表达^[16]。Wnt信号通路是由配体蛋白质Wnt和膜蛋白受体结合激发的一组多下游通道的信号转导途径，是一条高度保守的信号通路。其中Wnt/β-连环蛋白被称为经典通路，以β-连环蛋白向核内聚集转移、在核内激活目的基因为标志。该信号通路中关键蛋白的突变可导致Wnt/β-连环蛋白信号通路异常活化，从而诱导各种肿瘤发生。2012年，有学者观察到β-连环蛋白可直接活化小鼠胚胎干细胞中端粒酶的限速成分——端粒酶逆转录酶，从而促进细胞增殖，这一研究建立了Wnt/β-连环蛋白信号通路与端粒酶的联系^[17]。Yu等^[16]也证实，在人KFb中存在Wnt/β-连环蛋白信号通路的活化与端粒酶活性的增强；同时该研究通过抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路观察到，端粒酶活性明显降低，KFb衰老与凋亡加速，这解释了KFb抵抗衰老与凋亡的部分机制。

B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）家族蛋白是定位于核膜、部分内质网和线粒体外膜的癌蛋白，可保护细胞使其免于凋亡。P53则是一种肿瘤抑制蛋白，定位于细胞核内，通过抑制细胞增殖维持基因组的稳定。在KFb中，Bcl-2和P53的此消彼长造成KFb凋亡减少，即KFb较NFb表现出明显的凋亡抵抗能力。1998年，有学者报道了人体瘢痕疙瘩组织中KFb的p53基因失活与Bcl-2蛋白激酶B基因上调。脂肪酸合成酶（FAS）基因是另一介导细胞凋亡的基因。2006年，国内研究人员报道了KFb中的FAS基因外显子8有杂合丢失和基因突变的现象，提示KFb的FAS蛋白存在功能缺陷，从而不能发挥介导细胞凋亡的作用。此外，Li等^[18]和郭洪耀等^[19]构建真核表达质粒pcDNA3.0-Dickkopf相关蛋白（DKK）3，然后将其转入KFb中以上调DKK基因表达，结果显示细胞凋亡增加。

微小RNA（miR）是一类存在于动植物体内、大小为21~25 bp的内源性非编码单链小分子RNA，对生物体转录后的基因表达调控起关键作用。目前，国内外关于miR在瘢痕疙瘩发病机制中的研究尚处于起步阶段，但已有研究证实KFb中存在多种miR的表达异常。与NFb相比，miR-1224-5p在体外培养的人KFb中呈显著低表达；转染miR-1224-5p后，KFb凋亡明显加快^[20]。还有研究报道了人体中miR-21的过表达可通过人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因/蛋白激酶B和TGF-β₁信号通路促进KFb增殖，并抑制线粒体介导的细胞凋亡过程^[21]。长链非编码RNA（lncRNA）较高级真核生物细胞转录组中长度超过200 bp且不编码蛋白质的线性RNA。lncRNA可竞争性吸附细胞内大量miR，像海绵一样缓冲并削减其干涉靶基因mRNA编码蛋白的能力，发挥对miR的调控作用。在KFb中，存在多种lncRNA的表达异常如lncRNA CACNA1G-AS1的表达上调^[22]、lncRNA H19的表达增加^[23-24]，这些过表达的lncRNA均可通过竞争性结合下游miR的方式，抑制miR诱导的凋亡。

1.4. 迁移

瘢痕疙瘩的生长无自限性，可超出创缘向周围组织迁移浸润，迁移主要依赖KFb降解ECM的能力。ECM的降解主要依靠丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶（MMP）4类蛋白水解酶的作用，其中MMP可降解ECM中多种蛋白成分，破坏组织学屏障，在肿瘤的侵袭性生长中已得到广泛研究^[25]。有研究表明，人KFb中MMP表达明显升高，同时由于内源性MMP抑制剂——金属蛋白酶组织抑制物不能成比例升高，造成胶原蛋白降解加剧，从而促进KFb迁移^[26]。徐志山等^[27]和Hsu等^[5]报道，人KFb中miR-194-3p和血清小窝蛋白1表达下调均可造成Runt相关转录因子2上调，从而促进MMP表达，最终使KFb迁移性增强。此外，KFb还可通过改变内在骨架结构以适应其迁移增强的特性。KFb中自分泌运动因子（AMF）通常与AMF受体结合后，调控细胞内的各种信号通路，改变构成细胞内骨架蛋白微丝的解离聚合状态与细胞膜结构，并释放可溶性酶，影响周围正常细胞与组织，从而加速细胞运动。当人KFb中AMF表达上调时，KFb的迁移能力提高^[28]。

2. KFb的异质性

既往观点认为KFb是一类高度保守、同质性强的细胞。近年来研究表明，即使同一个体的KFb在生物学特性、基因表达等方面也有较高异质性^[29]。KFb存在异质性为寻找新的治疗靶点提供了理论基础，定位寻找瘢痕疙瘩发病过程中的主要驱动细胞也有助于阐明KFb的发病机制。KFb的异质性不仅存在于不同类型的Fb间，还存在于同一瘢痕疙瘩组织内不同部位、不同层次的Fb之间^[30]。真皮组织中，深层KFb的Ⅰ型胶原α、TGF-β、骨膜蛋白、纤溶酶原激活物抑制物1的表达量较浅层KFb更高，可产生更多ECM。

瘢痕疙瘩外周与中央部位存在肉眼可见的形态学差异，因此目前多数研究集中于报道瘢痕疙瘩外周与中央部位KFb的异质性。在瘢痕疙瘩中，边缘部位KFb向周围正常组织浸润，中央部位的KFb处于静止状态且有老化趋向，二者之间部位为持续增生部。研究者采用全基因组芯片技术证实人体瘢痕疙瘩组织边缘部KFb存在凋亡抑制基因上调，而中央浅层老化部KFb则存在凋亡诱导基因（解整合素样金属蛋白酶12、细胞周期及凋亡调节蛋白1、膜联蛋白A1）的上调^[31]。细胞周期分析表明，人体瘢痕疙瘩组织边缘部位KFb中约有60%的细胞处于增殖期（G2和S期），中央部位KFb则多数处于G0和G1期^[32-33]。除增殖活性有明显差异外，人体瘢痕疙瘩组织中央部位的KFb产生ECM的能力也显著低于边缘部位的KFb^[34]。这些研究提示KFb具有不同的细胞表型，一方面原因为KFb为多种细胞（间充质干细胞、表皮干细胞等）的混合体；另一方面，这种异质性可能源于不同部位KFb所处的微环境的差异，而瘢痕疙瘩中可能存在诱导并适合若干群不同表型KFb生存的微环境，从而能够保持KFb具有不断增殖和浸润的能力。

3. KFb的基因组学研究

不同人群的瘢痕疙瘩发病率、表现形式及治疗效果差异很大^[35-37]，提示多基因参与了瘢痕疙瘩的发生发展过程。全基因组微阵列研究的应用为寻找大量异常表达、涉及各种生物学通路的基因提供了重要手段。在微阵列芯片技术的发展中，对KFb目标基因的测量数目也从早期的1 000个左右增加到全基因表达谱的约54 000个。多位研究者也利用微阵列芯片对不同地区瘢痕疙瘩发病人群进行了检测，结果显示KFb与ECM的合成分解、胞内运输蛋白、细胞信号转导蛋白、免疫调节及炎症反应等密切相关的基因存在上调及下调；将微阵列芯片技术用于KFb中miR的检测，鉴定出异常表达的miR，如miR-194-3p、miR-199a-5p等^{[5，31，35，38-47]}，这些异常表达的miR同样与KFb的增殖、迁移密切相关，见表 1。

表 1.

13篇文献的瘢痕疙瘩成纤维细胞微阵列芯片研究结果

第1作者	年份	类别	微阵列芯片分析
注：miR为微小RNA, lncRNA为长链非编码RNA；↑表示上调，↓表示下调
Hsu[5]	2018	基因	345种基因↑，86种基因↓
Inui[38]	2011	基因	374种基因↑，758种基因↓
Wong[39]	2014	基因	250种基因差异表达
Satish[40]	2006	基因	43种基因↑，5种基因↓
Seifert[31]	2008	基因	97种基因↑，26种基因↓
Hahn[41]	2013	基因	12种基因↑，13种基因↓
Li[42]	2016	基因	196种基因↑，462种基因↓
郭晓瑞[43]	2011	miR	1种miR↑，11种miR↓
Wu[35]	2014	miR	3种miR↑，14种miR↓
Wu[44]	2019	miR	63种miR↑，76种miR↓
Yan[45]	2020	miR	14种miR↑，15种miR↓
Liang[46]	2015	lncRNA	1 731种lncRNA↑，782种lncRNA↓
Guo[47]	2016	lncRNA	1 290种lncRNA↑，778种lncRNA↓

尽管已证实KFb中存在多基因突变，但这些突变具有高度异质性，不同的人可能存在不同的变异组合，如不同的突变可能发生在相同的基因位点。因此，这些基因突变是否作用于共同的信号通路受到一些关注。已有研究证实，IL-6信号通路与TGF-β/Smads信号通路在瘢痕疙瘩的发病机制中起重要作用。而IL-6信号通路参与干细胞功能基因表达，与细胞的更新与增殖密切相关；TGF-β则是组织纤维化过程中的重要信号分子，参与KFb增殖、分化及ECM的形成^[37]。

4. 小结与展望

综上所述，作为瘢痕疙瘩中的主要效应细胞，KFb的生物学特性、基因表达都与NFb有显著差异。此外，由于瘢痕疙瘩与肿瘤细胞都具有侵袭生长的特性，瘢痕疙瘩发病过程有与肿瘤类似的基因表达异常，且治疗肿瘤的方法如化学疗法药物5-氟尿嘧啶、环磷酰胺、丝裂霉素等或放射治疗可能在一定程度上使瘢痕疙瘩好转，因此瘢痕疙瘩与肿瘤细胞具有相似性；也有学者从遗传、分子标志物等方面系统阐明了瘢痕疙瘩的肿瘤倾向^[48]。目前，KFb的相关研究繁多，但仍难以阐明瘢痕疙瘩发病机制并实现瘢痕疙瘩的有效治愈。肿瘤学与基因组学是未来瘢痕疙瘩研究中的2个重要方向。利用基因组学的研究思路与方法，将有助于阐明瘢痕疙瘩的发病机制。此外，临床医师也应当积极关注肿瘤治疗的进展并借鉴肿瘤治疗的方法，探讨瘢痕疙瘩的防治新思路。