Abstract
目的
探讨复合人表皮干细胞（ESC）的猪脱细胞真皮基质（ADM）对裸鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响。
方法
采用实验研究方法。采用数码相机拍照观察猪ADM形态, 采用苏木精-伊红（HE）染色观测猪ADM中细胞残留, 采用扫描电子显微镜观察猪ADM表面结构, 采用红外光谱仪分析猪ADM二级结构, 采用动态光散射粒度分析仪分析猪ADM粒径, 采用纳米粒度电位仪分析猪ADM电位。采用倒置荧光显微镜观察猪ADM在培养基中放置30 min、1 d、5 d的形态（样本数为2）；采用随机数字表法（分组方法下同）将猪ADM分为5 min组、10 min组、20 min组、30 min组、60 min组、120 min组, 常温静置相应时间, 称量法计算吸水量（样本数为3）；将Swiss小鼠胚胎成纤维细胞（Fb）分为仅有培养基的空白对照组和另加入相应终质量浓度的ADM浸提液的50.0 g/L ADM浸提液组、37.5 g/L ADM浸提液组、25.0 g/L ADM浸提液组、12.5 g/L ADM浸提液组、6.5 g/L ADM浸提液组, 分别于培养24、48、72 h, 采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖率并进行细胞毒性分级（样本数为5）；将1只6周龄雄性SD大鼠红细胞分为生理盐水组、超纯水组及添加相应终质量浓度猪ADM浸提液的5 mg/mL ADM浸提液组、10 mg/mL ADM浸提液组、15 mg/mL ADM浸提液组, 于反应3 h, 采用酶标仪检测血红蛋白的吸光度值代表猪ADM血液相容性（样本数为3）。从陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院泌尿外科2020年7月收治的1名6岁健康男童包皮环切术后废弃包皮中分离培养ESC并采用流式细胞术鉴定。混合培养法构建复合ESC的猪ADM（以下简称ESC/ADM）颗粒, 培养3 d后采用HE染色和激光扫描共聚焦显微镜观察ESC/ADM复合效果。将36只7~8周龄雄性无胸腺裸鼠分成单纯磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组, 每组9只, 并建立全层皮肤缺损创面模型, 伤后即刻, 创面均一次性采用相应试剂处理。分别于伤后1、7、11、15 d, 观察创面愈合情况并计算创面愈合率（样本数为3）；伤后7 d, 行HE染色观察创面上皮化情况并测量未上皮化长度（此处及以下样本数均为4）；伤后11 d, 行Masson染色观察创面胶原沉积和真皮化情况并计算创面切面真皮面积, 行免疫荧光染色并计算创面表达ESC特异性标志物CD49f的细胞数, 行实时荧光定量反转录PCR检测创面移植ESC的3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的mRNA表达。对数据行独立样本t检验、单因素方差分析、重复测量方差分析、LSD-t检验。
结果
猪ADM为白色微粒状, 内部无细胞存在, 由网状结构组成, 结构排列无序, 表面粗糙；猪ADM分别在1 659、1 549、1 239 cm-1波数处出现吸收峰；猪ADM在溶液中主要粒径分布在500~700 nm；猪ADM表面带负电荷。放置30 min、1 d、5 d, 猪ADM均形态相对稳定；放置30~120 min猪ADM吸水量保持相对高水平。6.5 g/L ADM浸提液组、12.5 g/L ADM浸提液组、25.0 g/L ADM浸提液组小鼠胚胎Fb在培养24 h细胞毒性分级为1级, 其余各组各时间点细胞毒性分级均为0级。反应3 h, 超纯水组红细胞中血红蛋白的吸光度值明显高于生理盐水组和15 mg/mL ADM浸提液组（t值分别为8.14、7.96, P < 0.01）。第4代细胞常规培养3 d形态呈鹅卵石样且低表达CD71和高表达CD49f的被鉴定为ESC。猪ADM颗粒上有ESC附着、生长。伤后1 d, 单纯PBS组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面大小基本一致。伤后7、11、15 d, 各组裸鼠创面收缩, 其中单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面收缩明显。伤后7 d, 单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面愈合率明显高于单纯PBS组（t值分别为2.83、4.72, P < 0.05或P < 0.01）；伤后11 d, ESC/ADM组裸鼠创面愈合率明显高于单纯PBS组（t=4.86, P < 0.01）；伤后15 d, 单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面愈合率均明显高于单纯PBS组（t值分别为2.71、2.90、3.23, P < 0.05）。伤后7 d, 单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面未上皮化长度分别为（816±85）、（635±66）、（163±32）μm, 明显短于单纯PBS组的（1 199±43）μm（t值分别为5.69、10.19、27.54, P < 0.01）。伤后11 d, 单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面切面真皮面积明显大于单纯PBS组（t值分别为27.14、5.29、15.90, P < 0.01）；单纯ADM组和ESC/ADM组裸鼠创面的胶原生成比单纯PBS组明显, 单纯ESC组和单纯PBS组相近。伤后11 d, 单纯ESC组和ESC/ADM组裸鼠创面中CD49f表达阳性数量分别为（135±7）、（185±15）个, GAPDH的mRNA表达阳性；单纯PBS组、单纯ADM组裸鼠创面均无CD49f、GAPDH的mRNA表达。
结论
ESC/ADM颗粒能够促进裸鼠全层皮肤缺损创面愈合, 这可能与其提高了ESC移植后的存活率和ADM促进了真皮结构重排、血管新生有关。
Keywords: 伤口愈合, 干细胞研究, 皮肤, 表皮干细胞, 复合基质
Abstract
Objective
To explore the effects of porcine acellular dermal matrix (ADM) combined with human epidermal stem cells (ESCs) on wound healing of full-thickness skin defect in nude mice.
Methods
The morphology of porcine ADM was analyzed by photograph of digital camera, the cell residues in porcine ADM were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining, the surface structure of porcine ADM was observed by scanning electron microscope, the secondary structure of porcine ADM was analyzed by infrared spectrometer, the porcine ADM particle size was analyzed by dynamic light scattering particle size analyzer, and the porcine ADM potential was analyzed by nano-particle size potentiometer. The morphology of porcine ADM was observed by inverted fluorescence microscope when it was placed in culture medium for 30 min, 1 d, and 5 d (n=2). The porcine ADM was divided into 5 min group, 10 min group, 20 min group, 30 min group, 60 min group, and 120 min group according to the random number table (the same grouping method below) in static state at normal temperature for the corresponding time to calculate the water absorption by weighing method (n=3). Swiss white mouse embryonic fibroblasts (Fbs) were divided into blank control group (culture medium only), and 50.0 g/L ADM extract group, 37.5 g/L ADM extract group, 25.0 g/L ADM extract group, 12.5 g/L ADM extract group, and 6.5 g/L ADM extract group which were added with the corresponding final concentrations of ADM extract respectively. At post culture hour (PCH) 24, 48, and 72, the cell survival rate was detected by cell counting kit 8 and the cytotoxicity was graded (n=5). The erythrocytes of a 6-week-old male Sprague-Dawley male rat were divided into normal saline group, ultra-pure water group, and 5 mg/mL ADM extract group, 10 mg/mL ADM extract group, and 15 mg/mL ADM extract group which were treated with the corresponding final concentrations of porcine ADM extract respectively. After reaction for 3 h, the absorbance value of hemoglobin was detected by microplate reader to represent the blood compatibility of porcine ADM (n=3). ESCs were isolated and cultured from the discarded prepuce of a 6-year-old healthy boy who was treated in the Department of Urology of the First Affiliated Hospital of Army Medical University (the Third Military Medical University) in July 2020, and then identified by flow cytometry. The porcine ADM particles of composite ESC (hereinafter referred to as ESC/ADM) were constructed by mixed culture. After 3 days of culture, the composite effect of ESC/ADM was observed by HE staining and laser scanning confocal microscope. Thirty-six 7-8-week-old male non-thymic nude mice were divided into phosphate buffer solution (PBS) alone group, ADM alone group, ESC alone group, and ESC/ADM group, with 9 mice in each group, and the wound model of full-thickness skin defect was established. Immediately after injury, the wounds were treated with the corresponding reagents at one time. On post injury day (PID) 1, 7, 11, and 15, the wound healing was observed and the wound healing rate was counted (n=3). On PID 7, the epithelialization of wounds was observed by HE staining and the length of un-epithelialized wound was measured (with this and the following sample numbers of 4). On PID 11, the dermal area and collagen deposition of wounds were observed by Masson staining and the dermal area of wound section was calculated, the number of cells expressing CD49f, a specific marker of ESC, was calculated with immunofluorescence staining, the mRNA expression of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) in ESC after wound transplantation was detected by real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction. Data were statistically analyzed with independent sample t test, one-way analysis of variance, analysis of variance for repeated measurement, and least significant difference t test.
Results
The porcine ADM was white particles and composed of reticular structure, with no cells inside, disordered structure, and rough surface. The absorption peak of porcine ADM appeared at the wave numbers of 1 659, 1 549, and 1 239 cm-1, respectively. The main particle size distribution of porcine ADM in solution was 500 to 700 nm, with negative charge on the surface. The morphology of porcine ADM in static state at 30 min and on 1 and 5 d was relatively stable. The water absorption of porcine ADM remained relatively high level in static state from 30 min to 120 min. The cytotoxicity of mouse embryonic Fbs in 6.5 g/L ADM extract group, 12.5 g/L ADM extract group, and 25.0 g/L ADM extract group was grade 1 at PCH 24, and the cytotoxicity of the other groups was 0 grade at each time point. After reaction for 3 h, the absorbance value of hemoglobin of erythrocytes in ultra-pure water group was significantly higher than the values in normal saline group and 15 mg/mL ADM extract group (with t values of 8.14 and 7.96, respectively, P < 0.01). After 3 days of culture, the cells of the fourth passage showed pebble-like morphology, with low expression of CD71 and high expression of CD49f, which were identified as ESCs. There was ESC attachment and growth on porcine ADM particles. On PID 1, the wound sizes of nude mice were almost the same in PBS alone group, ADM alone group, ESC alone group, and ESC/ADM group. On PID 7, 11, and 15, the wound contraction of nude mice in each group was observed, especially in ADM alone group, ESC alone group, and ESC/ADM group. On PID 7, the wound healing rates of nude mice in ESC alone group and ESC/ADM group were significantly higher than the rate in PBS alone group (with t values of 2.83 and 4.72 respectively, P < 0.05 or P < 0.01). On PID 11, the wound healing rate of nude mice in ESC/ADM group was significantly higher than that in PBS alone group (t=4.86, P < 0.01). On PID 15, the wound healing rates of nude mice in ADM alone group, ESC alone group, and ESC/ADM group were significantly higher than the rate in PBS alone group (with t values of 2.71, 2.90, and 3.23 respectively, P < 0.05). On PID 7, the length of un-epithelialized wound of nude mice in ADM alone group, ESC alone group, and ESC/ADM group was (816±85), (635±66), and (163±32) μm, respectively, which were significantly shorter than (1 199±43) μm in PBS alone group (with t values of 5.69, 10.19, and 27.54 respectively, P < 0.01). On PID 11, the dermal areas of wound section of nude mice in ADM alone group, ESC alone group, and ESC/ADM group were significantly larger than the area in PBS alone group (with t values of 27.14, 5.29, and 15.90 respectively, P < 0.01); the collagen production of nude mice in ADM alone group and ESC/ADM group was more obvious than that in PBS alone group, and the collagen production of nude mice in ESC alone group and PBS alone group was similar. On PID 11, in the wounds of nude mice in ESC alone group and ESC/ADM group, the cells with positive expression of CD49f were respectively 135±7 and 185±15, and the mRNA expressions of GAPDH were positive; while there were no expressions of CD49f nor mRNA of GAPDH in the wounds of nude mice in PBS alone group and ADM alone group.
Conclusions
ESC/ADM particles can promote the wound healing of full-thickness skin defects in nude mice, which may be related to the improved survival rate of ESCs after transplantation and the promotion of dermal structure rearrangement and angiogenesis by ADM.
Keywords: Wound healing, Stem cell research, Skin, Epidermal stem cells, Composite matrix
重度烧伤创面修复一直是烧伤医学研究的难点, 皮源匮乏是其根本问题[1]。目前使用的微粒皮移植[2]、Meek微型皮片移植[3]及镶嵌移植等技术临床应用可达到1∶14（取皮面积1%TBSA可扩增覆盖14%TBSA创面）创面封闭的效果[4]。但是重度烧伤往往需要进行多次植皮手术才能封闭创面, 这种“拆东墙补西墙”的治疗策略需要牺牲大量正常皮肤[5], 使皮源少甚至几乎无皮源的患者救治十分困难。为此, 避免牺牲正常皮肤同时提供足够皮源的创面封闭方式是现代烧伤医学的研究重点。
表皮干细胞（ESC）在自体皮肤更新、创面愈合过程中发挥重要作用。虽然将离体ESC移植于损伤创面可以局部解决创面修复需求, 但是离体ESC数量和活性得不到保障, 从而阻碍了创面修复的速率和质量。ADM是一种可用于创面的生物敷料, 同时也是细胞依附生长的良好支架。本研究拟构建复合人ESC的猪ADM颗粒, 探索其对裸鼠全层皮肤缺损创面愈合是否具有促进作用, 为临床烧创伤创面修复提供新方案。
1. 材料与方法
本研究经陆军军医大学（第三军医大学）动物实验伦理委员会审批通过, 批号：AMUWEC20200861, 遵循陆军军医大学（第三军医大学）和国家有关实验动物管理和使用的相关规定。
1.1. 动物及主要材料来源
1只6周龄健康无特殊病原体级体重200 g雄性SD大鼠与36只7~8周龄健康无特殊病原体级体重15~20 g雄性无胸腺裸鼠购自陆军军医大学（第三军医大学）实验动物中心, 许可证号：SYXK（渝）2017-0002。Swiss小鼠胚胎Fb购自中国科学院细胞库/干细胞库。空载体腺病毒购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司。猪ADM购自江苏优创生物医学科技有限公司。40 g/L多聚甲醛溶液、细胞计数试剂盒8（CCK-8）、花青素3标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体购自上海碧云天生物技术有限公司, KC无血清培养基（K-SFM）购自美国Thermo Fisher公司, 中性蛋白酶购自美国Roche公司, Ⅳ型胶原购自美国Sigma公司, 藻红蛋白标记的兔抗人CD49f多克隆抗体、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的兔抗人CD71多克隆抗体购自美国Abcam公司, 兔抗人CD49f多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司, 去基因组DNA反转录试剂盒、TB Green定量PCR酶购自日本Takara公司。FEI Inspect-f型扫描电子显微镜购自荷兰Philips公司, 傅里叶变换红外光谱仪购自美国Nicolet公司, 马尔文2000型动态光散射（DLS）粒度分析仪、Zetasizer Nano ZSP型纳米粒度电位仪购自英国马尔文仪器公司, M2e型多波长酶标仪购自美国Molecular Devices公司, Attune型声波聚焦流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司, CFX Connect型实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司, 倒置荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司, LSM780型激光扫描共聚焦显微镜购自德国Zeiss公司。
1.2. 猪ADM物理特性分析
1.2.1. 数码相机拍照观察猪ADM的常规形态
取0.5 g猪ADM, 用数码相机拍照观察记录它的颜色、形态。
1.2.2. HE染色观察猪ADM中细胞残留
将0.5 g猪ADM浸泡在40 g/L的多聚甲醛溶液中固定12 h, 之后常规脱水、包埋、切片（厚度为5 μm）, 行HE染色[6], 在200倍倒置荧光显微镜下观察猪ADM中是否有细胞残留。
1.2.3. 扫描电子显微镜观察猪ADM表面结构
取适量猪ADM放置于-40 ℃冰箱中冷冻, 然后使用冷冻干燥机干燥12 h, 将猪ADM黏附于导电胶带并进行60 s喷金处理, 随后在1 000倍扫描电子显微镜下观察猪ADM表面结构。
1.2.4. 红外光谱仪分析猪ADM二级结构
取5 mg猪ADM于玛瑙研钵中充分研磨至粉末状态, 再按照猪ADM与溴化钾的质量比为1∶100的量将两者混合均匀研磨。使用压片机对适量的样品进行压片后采用傅立叶变换红外光谱仪测试样品的透光率, 波数扫描范围400~4 000 cm-1, 光谱分辨率为4 cm-1, 每个样品扫描6次。测定吸收峰进一步确定猪ADM的二级结构。
1.2.5. DLS粒度分析仪和纳米粒度电位仪分析猪ADM粒径和电位
将100 mg的猪ADM分散于1 mL去离子水中, 分别置于粒径样品池和Zeta电位样品池。使用DLS粒度分析仪和纳米粒度电位仪分别对样品的粒径和Zeta电位进行测试。
1.3. 猪ADM生物学性能分析
1.3.1. 在培养基中观察猪ADM的稳定性
将0.5 g猪ADM均匀分散在10 mL K-SFM中, 收集100 μL前述混合液再次用K-SFM以1∶10比例稀释。将稀释液滴加到96孔板中, 每孔1.8 mg猪ADM, 共6孔。将培养板放置在37 ℃、体积分数5%二氧化碳培养箱中, 分别于放置30 min、1 d、5 d取2孔在40倍倒置荧光显微镜下观察猪ADM形态。
1.3.2. 在细胞培养环境中测定猪ADM的吸水性
将2.0 g猪ADM置于直径10 cm平皿中, 37 ℃恒温条件下干燥24 h。称取18份干燥的100 mg猪ADM分别滴加到含有1 mL K-SFM的离心管中, 采用随机数字表法（分组方法下同）分成5 min组、10 min组、20 min组、30 min组、60 min组、120 min组（每组3份）, 常温静置相应时间后收集样品, 用滤纸吸去表面过多的水分, 称量湿猪ADM的重量, 计算猪ADM的吸水量, 以此分析其吸水性。吸水量=猪ADM湿重-猪ADM干重（100 mg）。本实验重复3次, 结果选取最具代表性的1次数据进行展示, 下同。
1.3.3. 猪ADM细胞毒性实验
将0.5 g猪ADM浸泡在10 mL含体积分数10%胎牛血清的无菌DMEM培养基中24 h制备猪ADM浸提液, 然后用孔径0.4 μm的滤膜过滤浸提液。将小鼠胚胎Fb以1×104个/mL的浓度接种于96孔板中, 每孔100 μL, 分为空白对照组、50.0 g/L ADM浸提液组、37.5 g/L ADM浸提液组、25.0 g/L ADM浸提液组、12.5 g/L ADM浸提液组、6.5 g/L ADM浸提液组, 每组15孔。空白对照组细胞仅采用K-SFM常规培养, 其余5组细胞分别采用含有相应终质量浓度的猪ADM浸提液的K-SFM常规培养。分别于培养24、48、72 h, 每组取5孔添加10 μL CCK-8溶液, 然后继续常规培养2 h之后采用酶标仪测定450 nm波长处吸光度值, 计算细胞增殖率, 各组细胞各时间点细胞增殖率=（各组细胞各时间点吸光度值÷空白对照组细胞相应时间点吸光度值）×100%。按细胞增殖率进行细胞毒性评价分级：≥100%为0级, 75%~99%为1级, 50%~74%为2级, 25%~49%为3级, 1%~24%为4级, < 1%为5级。本实验重复3次。
1.3.4. 猪ADM血液相容性实验
取1只大鼠腹腔注射10 g/L的戊巴比妥钠溶液50 mg/kg麻醉后, 采集5 mL心脏全血置于肝素抗凝管中摇匀。于离心半径8.0 cm、1 500 r/min常温离心15 min, 取下层沉淀（红细胞）用生理盐水洗涤至上清液不显红色为止, 将所得红细胞用2 mL生理盐水重新悬浮至浓度为2.5×107个/mL。将细胞分为生理盐水组、超纯水组、5 mg/mL ADM浸提液组、10 mg/mL ADM浸提液组、15 mg/mL ADM浸提液组, 每组3管（规格：1.5 mL EP管）。每管100 μL红细胞悬液添加900 μL对应的溶液, 然后置于37 ℃恒温箱反应3 h, 于离心半径8.0 cm、12 000 r/min常温离心15 min之后, 吸取每组每管上清液100 μL至96孔板中, 采用酶标仪测定上清液中血红蛋白在540 nm波长处的吸光值[7]。本实验重复3次。
1.4. 构建复合ESC的猪ADM（以下简称ESC/ADM）颗粒
1.4.1. ESC分离培养及纯度鉴定
取陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院泌尿外科2020年7月收治的1名健康6岁男童包皮环切术后废弃包皮（经患儿父母同意）。参照本课题组前期研究方法[8]分离培养ESC, 采用10 min快速贴壁法分离培养到第6代。取第4代细胞常规培养3 d, 于200倍倒置荧光显微镜下观察记录细胞形态。将常规培养的第4代细胞用PBS调整浓度为1×106个/mL并收集到流式细胞管中, 每管1 mL。分别加入2 μL FITC标记的兔抗人CD71多克隆抗体、藻红蛋白标记的兔抗人CD49f多克隆抗体（稀释比均为1∶1 000）, 4 ℃条件下避光反应30 min, 采用流式细胞仪检测CD71、CD49f的表达情况。若CD49f呈阳性且表达率 > 90%, CD71呈阴性且表达率 < 5%, 则提示培养的细胞是ESC。本实验重复3次。
1.4.2. ESC/ADM复合情况观察
取0.5 g猪ADM用10 mL Ⅳ型胶原溶液于4 ℃浸泡过夜后, 第2天复温30 min制得50 mg/mL的猪ADM溶液。然后在48孔板的各孔中分别加入5 μL猪ADM溶液和500 μL的K-SFM混匀, 于离心半径8.0 cm、1 200 r/min离心10 min后小心去除上清液备用。将1.4.1分离的第2代ESC用K-SFM调整细胞浓度为3×105个/mL, 并接种到6孔板中, 每孔1.5 mL, 共3孔, 然后各孔均加入10 μL空载体腺病毒[9]。转染24 h, 更换新的K-SFM继续常规培养48 h, 之后收集被腺病毒转染的ESC, 以每孔2.5×105个接种到含有猪ADM的48孔板中, 继续常规培养3 d得到ESC/ADM（规格为1 mg猪ADM复合2.5×105个ESC, ESC质量忽略不计）。取ESC/ADM, 行HE染色[6], 于200倍倒置荧光显微镜下观察猪ADM颗粒上是否有ESC附着、生长；另在200倍激光扫描共聚焦显微镜下观察猪ADM颗粒上是否有ESC附着、生长。
1.5. ESC/ADM对裸鼠全层皮肤缺损创面的作用
1.5.1. 动物建模与分组处理
将36只裸鼠分成单纯PBS组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组, 每组9只, 同前麻醉。使用直径6 mm打孔器于背部制作无菌全层皮肤缺损创面模型, 每只鼠2个创面。伤后即刻, 单纯PBS组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠每个创面分别滴加10 μL PBS、含2 mg猪ADM的PBS、含5.0×105个ESC的PBS、含2 mg ESC/ADM的PBS。均为一次性创面覆用给药, 用无菌医用胶布封闭所有创面, 裸鼠单笼饲养。
1.5.2. 创面愈合情况观察
每组选定3只裸鼠分别于伤后1、7、11、15 d用数码相机记录创面愈合情况, 采用Image J 1.52a图像分析软件（美国国立卫生研究院）统计创面面积, 并计算创面愈合率。创面愈合率＝（原始创面面积-未愈合创面面积）÷原始创面面积×100%。
1.5.3. 组织化学和免疫荧光法观察
分别于伤后7、11 d, 每组各另取3只裸鼠行二氧化碳安乐死。手术剪取各组1.0 cm×1.0 cm大小创周皮肤组织标本, 采用40 g/L多聚甲醛溶液固定24 h、脱水、石蜡包埋、切片（厚度为6 μm）。取伤后7 d每组4张切片用于HE染色, 在200倍倒置荧光显微镜下观察各组裸鼠创面上皮化情况, 另每张切片选取4个视野, 采用Image J 1.52a图像分析软件测算创面未上皮化长度。取伤后11 d每组4张切片用于Masson染色[10], 在200倍倒置荧光显微镜下观察各组裸鼠创面胶原沉积和切面真皮化情况, 另每张切片选取4个视野, 同前测算创面切面真皮面积。取伤后11 d每组6张切片用于免疫荧光染色计数创面表达ESC特异性标志物CD49f的细胞数。切片在脱蜡、抗原修复、灭活、山羊血清封闭后加入兔抗人CD49f多克隆抗体（稀释比为1∶250）, 4 ℃反应过夜, 第2天用花青素3标记的羊抗兔IgG多克隆抗体（稀释比为1∶2 000）常温反应2 h, 之后用含有4', 6-二脒基-2-苯基吲哚封片剂封片后, 在200倍激光扫描共聚焦显微镜下每张切片选择4个视野, Image J 1.52a图像分析软件分析CD49f表达阳性（红色）细胞数量。
1.5.4. 创面移植ESC的GAPDH的mRNA表达定性检测
取1.5.3中伤后11 d各组裸鼠创周皮肤组织标本, 各组样本数为6。采用Trizol法提取总RNA, 实时荧光定量RT-PCR法检测GAPDH的mRNA表达。根据基因文库序列, 自行采用Prime5软件在线设计引物, 委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成, 合成的引物基因序列：上游引物为5'-CCTTCCGTGTCCCCACT-3', 下游引物为5'-GCCTGCTTCACCACCTTC-3', 产物大小为412 bp。GAPDH的循环阈值在18.0~35.0被认为是阳性结果。
1.6. 统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布, 以x±s表示。2组组间比较行独立样本t检验；单一时间点单一指标组间整体比较采用单因素方差分析, 多个时间点组间整体比较采用重复测量方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 猪ADM物理特性
猪ADM实物为白色微粒状, 见图 1A。猪ADM的HE染色结果显示无细胞存在, 见图 1B。扫描电子显微镜结果显示, 猪ADM由网状结构组成, 结构排列无序, 表面粗糙, 见图 1C。红外光谱仪分析显示, 猪ADM分别在1 659、1 549、1 239 cm-1波数处出现吸收峰, 见图 1D。粒径分析结果显示, 猪ADM在溶液中主要粒径分布在500~700 nm, 粒径 < 50 nm的约有6.3%, 见图 1E。Zeta电位分布显示, 猪ADM表面带负电荷, 见图 1F。
图 1.
猪脱细胞真皮基质（ADM）物理特性分析结果。1A.数码相机下猪ADM呈白色；1B.猪ADM中无细胞成分存在苏木精-伊红×200, 图中标尺为200 μm；1C.猪ADM表面呈细丝状扫描电子显微镜×1 000, 图中标尺为2 μm；1D.红外光谱仪分析显示猪ADM在1 659、1 549、1 239 cm-1波数处出现吸收峰；1E.动态光散射粒度分析仪分析显示, 猪ADM粒径主要为500~700 nm；1F.纳米粒度电位仪分析显示, 猪ADM表面带负电荷
注：图 1D中横坐标a、b、c、d、e、f、g、h分别为波数4 000、3 500、2 500、2 000、1 500、1 000、500 cm-1; 图 1E为经lg处理的数据形成的描记图, 坐标轴数据为未经lg处理的原始数据
2.2. 猪ADM在细胞培养环境中的稳定性
放置30 min、1 d、5 d, 猪ADM均形态不规则, 呈网状, 且有细丝分布, 相对稳定。见图 2。
图 2.
猪脱细胞真皮基质（ADM）在角质形成细胞无血清培养基中放置各时间点形态倒置荧光显微镜×40, 图中标尺为500 μm。2A.放置30 min, 猪ADM形态不规则, 呈网状；2B、2C.分别为放置1、5 d, 猪ADM大小和形态与图 2A相近
2.3. 在细胞培养环境中猪ADM的吸水性
5 min组、10 min组、20 min组、30 min组、60 min组、120 min组猪ADM吸水量分别为（2 367±85）、（3 350±601）、（4 033±494）、（4 250±464）、（4 333±379）、（4 367±340）mg。
2.4. 猪ADM细胞毒性和血液相容性
培养24 h, 37.5 g/L ADM浸提液组、50.0 g/L ADM浸提液组小鼠胚胎Fb增殖率均明显高于空白对照组（P < 0.05或P < 0.01）；培养48 h, 6.5 g/L ADM浸提液组、12.5 g/L ADM浸提液组、25.0 g/L ADM浸提液组、37.5 g/L ADM浸提液组、50.0 g/L ADM浸提液组小鼠胚胎Fb增殖率均明显高于空白对照组（P < 0.01）；培养72 h, 12.5 g/L ADM浸提液组、25.0 g/L ADM浸提液组、37.5 g/L ADM浸提液组、50.0 g/L ADM浸提液组小鼠胚胎Fb增殖率均明显高于空白对照组（P < 0.01）。6.5 g/L ADM浸提液组、12.5 g/L ADM浸提液组、25.0 g/L ADM浸提液组在培养24 h细胞毒性分级为1级, 其余各组各时间点细胞毒性分级均为0级。见表 1。
表 1.
6组小鼠胚胎成纤维细胞培养各时间点增殖率比较（%, x±s）
| 组别 | 样本数 | 24 h | 48 h | 72 h |
| 注：各组各时间点样本数为5；处理因素主效应, F=106.10, P < 0.001；时间因素主效应, F=63.87, P < 0.001；两者交互作用, F=8.44, P < 0.001；F值、P值为各时间点组间总体比较所得；t1值、P1值, t2值、P2值, t3值、P3值, t4值、P4值, t5值、P5值分别为6.5 g/L ADM浸提液组、12.5 g/L ADM浸提液组、25.0 g/L ADM浸提液组、37.5 g/L ADM浸提液组、50.0 g/L ADM浸提液组与空白对照组各时间点比较所得 | ||||
| 空白对照组 | 15 | 100 | 100 | 100 |
| 6.5 g/L ADM浸提液组 | 15 | 97.7±3.4 | 110.8±2.8 | 101.7±2.5 |
| 12.5 g/L ADM浸提液组 | 15 | 99.7±0.8 | 148.3±2.8 | 135.1±2.8 |
| 25.0 g/L ADM浸提液组 | 15 | 97.3±4.2 | 163.3±1.6 | 168.7±2.8 |
| 37.5 g/L ADM浸提液组 | 15 | 110.2±4.3 | 171.9±1.4 | 181.3±3.9 |
| 50.0 g/L ADM浸提液组 | 15 | 117.0±3.2 | 184.8±5.1 | 189.4±2.5 |
| F值 | 13.31 | 299.20 | 430.10 | |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | |
| t1值 | 0.93 | 5.48 | 0.96 | |
| P1值 | 0.401 | 0.005 | 0.391 | |
| t2值 | 0.59 | 24.15 | 17.44 | |
| P2值 | 0.585 | < 0.001 | < 0.001 | |
| t3值 | 0.90 | 54.37 | 34.17 | |
| P3值 | 0.418 | < 0.001 | < 0.001 | |
| t4值 | 3.37 | 72.68 | 29.64 | |
| P4值 | 0.028 | < 0.001 | < 0.001 | |
| t5值 | 7.53 | 23.36 | 51.16 | |
| P5值 | 0.002 | < 0.001 | < 0.001 | |
反应3 h, 生理盐水组、5 mg/mL ADM浸提液组、10 mg/mL ADM浸提液组、15 mg/mL ADM浸提液组、超纯水组红细胞中血红蛋白的吸光度值分别为0.057 9±0.001 1、0.062 5±0.001 0、0.063 6±0.000 5、0.063 6±0.001 3、0.319 4±0.045 4, 组间总体比较, 差异有统计学意义（F=64.13, P < 0.001）。超纯水组红细胞中血红蛋白的吸光度值明显高于生理盐水组和15 mg/mL ADM浸提液组（t值分别为8.14、7.96, P < 0.001）, 而生理盐水组红细胞中血红蛋白的吸光度值与15 mg/mL ADM浸提液组相近（t=4.71, P=0.195）。
2.5. 复合ESC的猪ADM颗粒构建
第4代细胞常规培养3 d, 细胞伸展、呈多角形、鹅卵石样排列, 细胞核大, 可见细胞内细胞核及细胞器, 见图 3A。反应30 min, 细胞表面表达CD71-CD49f+的细胞比例约为97%, 见图 3B, 细胞鉴定为ESC。培养3 d, HE染色和激光扫描共聚焦显微镜观察显示猪ADM颗粒上有ESC附着、生长, 见图 3C、3D。
图 3.
复合人表皮干细胞（ESC）的猪脱细胞真皮基质（ADM）颗粒构建结果。3A.第4代细胞呈多角形、细胞核大, 鹅卵石样排列倒置荧光显微镜×200, 图中标尺为200 μm；3B.表达CD71-CD49f+的细胞比例约97%；3C.培养3 d, ADM中有ESC生长苏木精-伊红×200, 图中标尺为200 μm；3D.培养3 d, ADM上有ESC生长激光扫描共聚焦显微镜×200, 图中标尺为200 μm
注：图 3B中Q1示CD71+CD49f-细胞, Q2示CD71+CD49f+细胞, Q3示CD71-CD49f+细胞, Q4示CD71-CD49f-细胞；图 3C中红色箭头示ESC；图 3D中绿色荧光示ESC
2.6. ESC/ADM对裸鼠全层皮肤缺损创面的作用
2.6.1. 创面愈合情况
伤后1 d, 4组裸鼠创面大小基本一致, 可见直径6 mm的圆形全层皮肤缺损创面。伤后7、11、15 d, 各组裸鼠创面收缩, 其中单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面收缩明显。见图 4。
图 4.
4组裸鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面愈合情况。4A、4B、4C、4D.分别为单纯PBS组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组伤后1 d创面情况, 大小均与参照卡片相近；4E、4F、4G、4H.分别为单纯PBS组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组伤后7 d创面情况, 图 4F、4G、4H创面较图 4E明显缩小；4I、4J、4K、4L.分别为单纯PBS组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组伤后15 d创面情况, 图 4J、4K、4L创面较图 4I明显缩小
注：图中浅蓝色卡片为参照物, 直径6 mm；PBS为磷酸盐缓冲液、ADM为脱细胞真皮基质、ESC为表皮干细胞; ESC/ADM为复合ESC的ADM
伤后7 d, 单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面愈合率明显高于单纯PBS组（P < 0.05或P < 0.01）, 单纯ADM组裸鼠创面愈合率与单纯PBS组相近（P > 0.05）。伤后11 d, 单纯ADM组以及单纯ESC组裸鼠的创面愈合率均与单纯PBS组相近（P > 0.05）, ESC/ADM组裸鼠创面愈合率明显高于单纯PBS组（P < 0.01）。伤后15 d, 单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面愈合率均明显高于单纯PBS组（P < 0.05）。见表 2。
表 2.
4组裸鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面愈合率比较（%, x±s）
| 组别 | 创面数（个） | 7 d | 11 d | 15 d |
| 注：PBS为磷酸盐缓冲液、ADM为脱细胞真皮基质、ESC为表皮干细胞; ESC/ADM为复合ESC的ADM；各组各时间点创面数为6个；处理因素主效应, F=877.40, P < 0.001；时间因素主效应, F=506.20, P < 0.001；两者交互作用, F=84.90, P=0.611；F值、P值为各时间点组间总体比较所得；t1值、P1值, t2值、P2值, t3值、P3值分别为单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组与单纯PBS组各时间点比较所得 | ||||
| 单纯PBS组 | 18 | 31.3±4.8 | 47.9±5.3 | 67.0±6.4 |
| 单纯ADM组 | 18 | 38.0±5.5 | 54.2±6.5 | 77.6±2.4 |
| 单纯ESC组 | 18 | 44.8±6.7 | 59.0±7.6 | 79.1±3.4 |
| ESC/ADM组 | 18 | 51.4±5.6 | 69.8±5.7 | 81.2±4.2 |
| F值 | 6.97 | 6.39 | 6.39 | |
| P值 | 0.006 | 0.008 | 0.008 | |
| t1值 | 1.57 | 1.30 | 2.71 | |
| P1值 | 0.167 | 0.242 | 0.035 | |
| t2值 | 2.83 | 2.06 | 2.90 | |
| P2值 | 0.030 | 0.085 | 0.027 | |
| t3值 | 4.72 | 4.86 | 3.23 | |
| P3值 | 0.003 | 0.003 | 0.018 | |
2.6.2. 组织化学观察
伤后7 d, 4组裸鼠创面上皮化不完全, 各组创面均有厚薄不一的肉芽组织形成, 同时创面伴有一定程度血管化和大量炎症细胞浸润。单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面未上皮化长度明显短于单纯PBS组（P < 0.01）。伤后11 d, 4组裸鼠创面切面均观察到肉芽组织形成的部分真皮, 其中单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面的切面真皮面积明显大于单纯PBS组（P < 0.01）。伤后11 d, 4组裸鼠创面切面均有胶原成分生成, 单纯ADM组和ESC/ADM组的胶原生成比单纯PBS组明显, 单纯ESC组和单纯PBS组情况相近。见图 5、表 3。
图 5.
4组裸鼠伤后7 d全层皮肤缺损创面上皮化情况和伤后11 d创面胶原沉积和切面真皮化情况。5A、5B、5C、5D.分别为单纯PBS组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组创面上皮化情况, 其中图 5B、5C、5D上皮化较图 5A明显更快, 苏木精-伊红×200, 图中标尺为200 μm。5E、5F、5G、5H.分别为单纯PBS组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组伤后11 d创面胶原沉积和切面真皮化情况, 图 5F和5H创面胶原沉积较图 5E多, 图 5F、5G、5H创面切面真皮面积较图 5E大, Masson×200, 图中标尺为200 μm
注：红色箭头示创面上皮化位置, 黄色虚线区域为创面切面真皮面积；PBS为磷酸盐缓冲液、ADM为脱细胞真皮基质、ESC为表皮干细胞; ESC/ADM为复合ESC的ADM
表 3.
4组裸鼠全层皮肤缺损创面伤后7 d未上皮化长度和伤后11 d创面切面真皮面积（x±s）
| 组别 | 样本数 | 未上皮化长度（μm） | 创面切面真皮面积（mm2） |
| 注：PBS为磷酸盐缓冲液、ADM为脱细胞真皮基质、ESC为表皮干细胞; ESC/ADM为复合ESC的ADM；F值、P值为各指标4组间总体比较所得；t1值、P1值, t2值、P2值, t3值、P3值分别为单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组与单纯PBS组比较所得 | |||
| 单纯PBS组 | 4 | 1 199±43 | 0.86±0.05 |
| 单纯ADM组 | 4 | 816±85 | 2.70±0.08 |
| 单纯ESC组 | 4 | 635±66 | 1.38±0.13 |
| ESC/ADM组 | 4 | 163±32 | 2.57±0.14 |
| F值 | 103.40 | 138.50 | |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 | |
| t1值 | 5.69 | 27.14 | |
| P1值 | 0.005 | < 0.001 | |
| t2值 | 10.19 | 5.29 | |
| P2值 | 0.001 | 0.006 | |
| t3值 | 27.54 | 15.90 | |
| P3值 | < 0.001 | < 0.001 | |
2.6.3. 创面移植ESC/ADM后ESC存活情况
伤后11 d, 单纯ESC组和ESC/ADM组裸鼠创面中CD49f表达阳性, 单纯PBS组、单纯ADM组裸鼠创面中无CD49f表达, 且单纯ESC组和ESC/ADM组裸鼠创面中CD49f表达阳性数量分别为（135±7）、（185±15）个, 见图 6。单纯ESC组和ESC/ADM组裸鼠创面GAPDH的mRNA表达均为阳性, 循环阈值分别为29.13±0.04、31.28±0.11；另2组裸鼠创面无GAPDH的mRNA表达。
图 6.
免疫荧光法检测4组裸鼠伤后11 d全层皮肤缺损创面处ESC特异性标志物CD49f表达情况。6A、6B、6C、6D.分别为单纯PBS组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组, 红框为各组创面上皮化位置花青素3-4', 6-二脒基-2-苯基吲哚×40, 图中标尺为200 μm；6E、6F、6G、6H.分别为单纯PBS组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组, 图 6E、6F中无CD49f表达, 图 6G、6H中CD49f表达阳性花青素3-4', 6-二脒基-2-苯基吲哚×200, 图中标尺为50 μm
注：ESC为表皮干细胞、PBS为磷酸盐缓冲液、ADM为脱细胞真皮基质, ESC/ADM为复合ESC的ADM；第2行各图分别为正上方图中红框处放大图, 黄色箭头示CD49f表达阳性
3. 讨论
创面修复的根本是创面上皮化, 创面上皮化的功能细胞是表皮细胞[11]。1952年, Billingham和Reynolds[12]首次报道可以运用皮肤细胞移植修复创面。经Rheinwald和Green[13]进一步改进, 促进创面细胞治疗技术在国际上逐步被重视, 其被视为避免牺牲正常皮肤的希望[14]。如临床采用Recell技术[15-16], 取自体皮肤、经胰蛋白酶消化获得全层皮肤细胞, 然后以喷雾形式再给回创面。然而, 创面细胞治疗最大的问题是单层细胞在炎症创面中存活率低, 因缺乏真皮组织, 后期瘢痕增生非常严重。ESC是皮肤中的干细胞, 能够自我更新和定向分化为表皮、毛囊和皮脂腺, 表皮中的ESC是实现创面快速上皮化的关键。微粒皮移植是目前最常用于修复烧伤创面的手术方式, 但是微粒皮移植仍然不能满足特重度烧伤创面修复的需求[17]。研究表明, 真皮基质是决定烧伤创面后期瘢痕增生的关键[18]。ADM是由动物皮肤制备成无细胞成分的胶原基质, 具有三维网状结构, 能吸收、聚集人体细胞（具有黏附性）以其为基底和支架进行繁殖再生和促进细胞增殖[19-21]。目前已有采用皮肤Fb[22]、脐带间充质干细胞[23-24]、多能干细胞[25]和ADM混合培养后修复创面的研究, 但这些研究结果都没有解决临床特重症烧伤患者的实际需求[26]。为此, 本课题组拟采用体外扩增ESC与猪ADM混合培养, 构建一种含有ESC的猪ADM复合颗粒, 然后将其重新移植回裸鼠全层皮肤缺损创面, 观察其对创面修复是否具有促进作用。
临床研究显示, ADM治疗Ⅱ度烧伤创面时能够显著减少瘢痕产生, 而且对于严重烧伤患者手部深部伤口的修复, 猪ADM也具有减轻瘢痕增生效果[27-28]。本研究将猪ADM作为ESC附着、生长的支架, 希望在创面修复过程中因猪ADM的使用能够减少引发瘢痕的因素。首先, 本课题组对猪ADM的物理特性进行观察, 结果显示, 猪ADM为白色, 表面由网状结构组成, 结构排列无序, 表面粗糙, 其二级结构保存良好, 脱细胞处理未导致这些特征峰位移, 猪ADM粒径主要集中在500~700 nm, 表面带负电荷。这些特征表明猪ADM能够作为细胞生长的支架材料。进一步分析猪ADM的稳定性和吸水性显示, 猪ADM在细胞培养环境中其形态保持稳定、吸水充分, 理论上说明猪ADM支架吸收足够量的水后且不发生降解, 能够为ESC较长时间附着在猪ADM上提供物理空间条件。猪ADM颗粒无细胞成分残留, 表明其用作组织生物材料时机体的免疫排斥反应可能较小。ADM在作为生物材料使用时直接与创面组织接触, 因此考察其生物安全性至关重要。6.5 g/L ADM浸提液组、12.5 g/L ADM浸提液组、25.0 g/L ADM浸提液组在培养24 h时细胞毒性分级为1级, 其余各组各时间点细胞毒性分级均为0级, 表明猪ADM溶液无细胞毒性, ESC与猪ADM共培养时猪ADM不会对ESC产生抑制作用。超纯水组红细胞中血红蛋白的吸光度值明显高于生理盐水组和15 mg/mL ADM浸提液组, 而生理盐水组红细胞中血红蛋白的吸光度值与15 mg/mL ADM浸提液组相近, 说明猪ADM不会与红细胞发生相互作用, 其生物安全性较高, 理论上可将ESC/ADM颗粒皮下注射到创伤部位。ESC的特异性标志物主要包括整合素β1、CD49f、CD200、细胞角蛋白19等[29-31]。因此从包皮中分离培养的表面低表达CD71同时高表达CD49f的细胞被认为是ESC[32]。本研究结果显示本课题组获得的第4代细胞呈多角形、细胞核比例大, 鹅卵石样排列, 低表达CD71且高表达CD49f细胞比例高达97%, 结合细胞形态可知分离得到的细胞为高纯度ESC, 可进行后续研究。本课题组将腺病毒载体感染的ESC与猪ADM颗粒共培养后, 显示ESC在猪ADM颗粒上附着、生长, 以此说明复合ESC/ADM颗粒构建成功, 可以用于后续的创面修复研究。
本研究构建一种ESC/ADM颗粒来修复创面, 目的是解决单纯在创面移植ESC存活率低和单纯生物敷料对创面的愈合效果差问题。因此, 将构建的ESC/ADM颗粒移植到裸鼠全层皮肤缺损模型中观察创面愈合速率和质量。伤后7、15 d, 各组裸鼠创面收缩, 其中单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面收缩现象明显。伤后7 d, 单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面愈合率明显高于单纯PBS组；伤后11 d, ESC/ADM组裸鼠创面愈合率明显高于单纯PBS组；伤后15 d, 单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面愈合率均高于单纯PBS组。组织形态学分析显示, 伤后7 d单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面上皮化速度比单纯PBS组明显更快；伤后11 d, 单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面的切面真皮面积明显大于单纯PBS组；伤后11 d, 单纯ADM组和ESC/ADM组的胶原表达量均比单纯PBS组和单纯ESC组高。以上结果表明, ESC和猪ADM对裸鼠全层皮肤缺损创面修复具有促进作用。此外, 本研究显示单纯ESC组和ESC/ADM组中裸鼠创面有CD49f阳性表达, 进一步检测到人源GAPDH的mRNA阳性表达, 说明本课题组移植的ESC成分的确存在于创面处, 参与了创面的修复。分析ESC/ADM促进创面修复的原因, 本课题组认为, ESC/ADM复合颗粒形式移植更能促进ESC在创面的存活及生长；ESC/ADM复合颗粒本身对创面真皮组织胶原生成及结构重排、血管生成有促进作用等。虽然本课题组研制的ESC/ADM复合颗粒对创面的修复具有促进作用, 但是其对创面皮肤复层结构重塑、ESC分化等的作用还需要进一步深入研究。
综上, 本研究通过将体外分离制备的人ESC与ADM复合成一种ESC生长良好的猪ADM颗粒, 本课题组的研究成功实现了细胞与真皮基质的高效融合, 解决了ESC在支架材料上融合效率低下的问题。构建的ESC/ADM复合颗粒具有快速促进创面愈合, 恢复表皮复层结构, 提高创面愈合质量, 重建皮肤真皮组织结构的作用；同时为解决创面细胞治疗相关瓶颈提供了一种新方法, 该方法是一种快速、有效封闭严重烧伤创面的一种新方式, 有望解决临床重症烧伤患者皮源短缺的问题。本课题组下一步考虑将ESC/ADM颗粒用于构建组织工程皮肤, 推动创面临床治疗的发展。
Funding Statement
重庆市2020年科卫联合医学科研项目（2020MSXM001）；陆军军医大学军事医学高新技术培育项目（CX2019JS206）
Joint Science and Health Medical Research Project of Chongqing in 2020 (2020MSXM001); Military Medical High-tech Cultivation Project of Army Medical University(CX2019JS206)
Footnotes
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献声明 赵小红：设计实验、实施研究、采集数据、分析/解释数据、文章撰写；郭熠城、陈泓豪、李雪：实施研究、采集数据、解释数据, 王颖、倪文强、张锐：实施研究、采集数据、统计分析, 邢孟秋（加拿大籍）、余时沧、潘银根：对文章的知识性内容作批评性审阅、技术和材料支持；詹日兴、罗高兴：酝酿和设计实验、研究过程指导、研究经费支持、对文章的知识性内容作批评性审阅
References
- 1.Jeschke MG, van Baar ME, Choudhry MA, et al. Burn injury. Nat Rev Dis Primers. 2020;6(1):11. doi: 10.1038/s41572-020-0145-5. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.Zheng XP, Li X, Chen TS, et al. Effect of the orientation of microskin on the survival rate of transplantation and improving the method. Int J Clin Exp Pathol. 2021;14(2):186–195. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.张 高飞, 刘 文军, 王 迪, et al. 微粒皮和Meek微型皮片移植修复大面积深度烧伤创面临床效果的荟萃分析. 中华烧伤杂志. 2020;36(7):560–567. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20190521-00249. [DOI] [Google Scholar]
- 4.潘 博涵, 孙 瑜, 汤 焘, et al. 脱抗原猪腹膜作为自体微粒皮移植载体在大面积深度烧伤患者中的应用. 中华烧伤杂志. 2020;36(9):861–864. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20190725-00311. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.Greenwood JE, Damkat-Thomas L, Schmitt B, et al. Successful proof of the 'two-stage strategy' for major burn wound repair. Burns Open. 2020;4(3):121–131. doi: 10.1016/j.burnso.2020.06.003. [DOI] [Google Scholar]
- 6.Qi YJ, Dong ZX, Chu HZ, et al. Denatured acellular dermal matrix seeded with bone marrow mesenchymal stem cells for wound healing in mice. Burns. 2019;45(7):1685–1694. doi: 10.1016/j.burns.2019.04.017. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.陈 暕, 黄 琳清, 郑 富香, et al. 介孔硅纳米材料负载中药成分三七素的止血性能研究. 时珍国医国药. 2020;31(11):2661–2665. doi: 10.3969/j.issn.1008-0805.2020.11.028. [DOI] [Google Scholar]
- 8.Zhao XH, Bian RY, Wang F, et al. GDF-5 promotes epidermal stem cells proliferation via Foxg1-cyclin D1 signaling. Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):42. doi: 10.1186/s13287-020-02106-7. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.Li HS, Yao ZH, He WF, et al. P311 induces the transdifferentiation of epidermal stem cells to myofibroblast-like cells by stimulating transforming growth factor β1 expression. Stem Cell Res Ther. 2016;7(1):175. doi: 10.1186/s13287-016-0421-1. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.Xiao D, Zhang Y, Wang R, et al. Emodin alleviates cardiac fibrosis by suppressing activation of cardiac fibroblasts via upregulating metastasis associated protein 3. Acta Pharm Sin B. 2019;9(4):724–733. doi: 10.1016/j.apsb.2019.04.003. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Green H, Kehinde O, Thomas J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76(11):5665–5668. doi: 10.1073/pnas.76.11.5665. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.Billingham RE, Reynolds J. Transplantation studies on sheets of pure epidermal epithelium and on epidermal cell suspensions. Br J Plast Surg. 1952;5(1):25–36. doi: 10.1016/s0007-1226(52)80004-9. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.Rheinwald JG, Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 1975;6(3):331–343. doi: 10.1016/s0092-8674(75)80001-8. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 14.Li Z, Maitz P. Cell therapy for severe burn wound healing[J/OL]. Burns Trauma, 2018, 6: 13[2020-09-20]. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29854856/. DOI:10.1186/s41038-018-0117-0.
- 15.Peirce SC, Carolan-Rees G. ReCell® Spray-On Skin system for treating skin loss, scarring and depigmentation after burn injury: a nice medical technology guidance. Appl Health Econ Health Policy. 2019;17(2):131–141. doi: 10.1007/s40258-018-00457-0. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 16.Moris V, Cristofari S, Stivala A. Recell in post-traumatic cases: preliminary results. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2020;73(10):1897–1916. doi: 10.1016/j.bjps.2020.03.009. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 17.沈丛墨, 李毅. 微粒皮在烧伤创面应用中的研究进展[J/CD]. 临床医药文献电子杂志, 2019, 6(61): 188. DOI:10.16281/j.cnki.jocml.2019.61.168.
- 18.Przekora A. A concise review on tissue engineered artificial skin grafts for chronic wound treatment: can we reconstruct functional skin tissue in vitro? Cells. 2020;9(7):1622. doi: 10.3390/cells9071622. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 19.Gravina PR, Pettit RW, Davis MJ, et al. Evidence for the use of acellular dermal matrix in implant-based breast reconstruction. Semin Plast Surg. 2019;33(4):229–235. doi: 10.1055/s-0039-1696986. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 20.Zang J, Yang B, Feng S, et al. Repair effect of xenogeneic acellular dermal matrix during external auditory canal reconstruction after canal wall down mastoidectomy. Acta Otolaryngol. 2020;140(2):110–115. doi: 10.1080/00016489.2019.1701705. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 21.杨 荣强, 崔 正军. 异种脱细胞真皮基质临床应用研究与进展. 中国美容医学. 2017;26(9):132–135. doi: 10.15909/j.cnki.cn61-1347/r.001966. [DOI] [Google Scholar]
- 22.张 军, 黄 晓元, 王 凌峰. 羊脱细胞真皮基质的体内外毒性实验. 中南大学学报(医学版) 2016;41(10):1069–1074. doi: 10.11817/j.issn.1672-7347.2016.10.010. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 23.Cho GW, Moon C, Song A, et al. Effect of growth factor-loaded acellular dermal matrix/MSCs on regeneration of chronic tympanic membrane perforations in rats. J Clin Med. 2021;10(7):1541. doi: 10.3390/jcm10071541. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 24.Fu JP, Zhang Y, Chu J, et al. Reduced graphene oxide incorporated acellular dermal composite scaffold enables efficient local delivery of mesenchymal stem cells for accelerating diabetic wound healing. ACS Biomater Sci Eng. 2019;5(8):4054–4066. doi: 10.1021/acsbiomaterials.9b00485. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 25.王晓. 诱导多能干细胞源性间充质干细胞联合微孔化脱细胞真皮基质构建人工复合皮的初步研究[D]. 南昌: 南昌大学, 2018.
- 26.曹 胜军, 王 凌峰, 巴 特, et al. 异体小鼠脂肪源性间充质干细胞-微孔化羊脱细胞真皮基质对小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及相关机制. 中华烧伤杂志. 2018;34(12):901–906. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2018.12.015. [DOI] [Google Scholar]
- 27.郭 海雷, 凌 翔伟, 刘 政军, et al. 刃厚头皮与异体脱细胞真皮基质复合移植修复特大面积烧伤患者手部深度创面. 中华烧伤杂志. 2019;35(12):876–878. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2019.12.009. [DOI] [Google Scholar]
- 28.Chen XD, Ruan SB, Lin ZP, et al. Effects of porcine acellular dermal matrix treatment on wound healing and scar formation: role of Jag1 expression in epidermal stem cells. Organogenesis. 2018;14(1):25–35. doi: 10.1080/15476278.2018.1436023. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 29.Lenkiewicz AM. Epidermal stem cells. Adv Exp Med Biol. 2019;1201:239–259. doi: 10.1007/978-3-030-31206-0_12. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 30.Yang RH, Yang S, Zhao JL. Progress in studies of epidermal stem cells and their application in skin tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 2020;11(1):303. doi: 10.1186/s13287-020-01796-3. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 31.Li YY, Zhang JM, Yue JP, et al. Epidermal stem cells in skin wound healing. Adv Wound Care(New Rochelle) 2017;6(9):297–307. doi: 10.1089/wound.2017.0728. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 32.Li F, Yuan CW, Xu SY, et al. Loss of the epigenetic mark 5-hmc in psoriasis: implications for epidermal stem cell dysregulation. J Invest Dermatol. 2020;140(6):1266–1275.e3. doi: 10.1016/j.jid.2019.10.016. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]