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. 2024 Sep 20;44(9):1712–1719. [Article in Chinese] doi: 10.12122/j.issn.1673-4254.2024.09.11

天麻素经PI3K/AKT通路改善新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后小胶质细胞介导的炎症反应

Gastrodin improves microglia-mediated inflammatory response after hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats via PI3K/AKT pathway

Hanjun ZUO 1, Zhaoda DUAN 1, Zhao WANG 1, Tao GUO 1, Jinsha SHI 1, Haolong SHI 1, Juanjuan LI 1,*
PMCID: PMC11744087  PMID: 39505339

Abstract

Objective

To investigate the mechanism of gastrodin for inhibiting microglia-mediated inflammation after hypoxicischemic brain damage (HIBD) in neonatal rats.

Methods

Thirty-nine 3-day-old SD rats were randomly divided into sham group, HIBD group and gastrodin treatment group. Western blotting was used to detect the expressions of TNF-α, IL-1β, IL-10 and TGF- β1 in the corpus callosum of the rats. The potential targets of gastrodin for treatment of HIBD were screened by network pharmacology analysis. The expressions of PI3K/AKT signaling pathway proteins following HIBD-induced microglial activation in the rats and in cultured microglial BV-2 cells with oxygen-glucose deprivation (OGD) were detected with Western blotting. The effects of LY294002 (a specific inhibitor of the PI3K/AKT pathway) and gastrodin on TNF-α and TGF-β1 mRNA levels in BV-2 cells with OGD was detected with RT-qPCR.

Results

In the neonatal rats with HIBD, gastrodin treatment significantly decreased TNF-α and IL-1β expressions and enhanced IL-10 and TGF-β1 expressions in the ischemic corpus callosum. Network pharmacology analysis showed significant enrichment of the PI3K/AKT signaling pathway and a strong binding between gastrodin and PI3K. Gastrodin significantly promoted PI3K and AKT phosphorylation in neonatal rats with HIBD and in BV-2 cells exposed to OGD. In BV-2 cells with OGD, gastrodin obviously suppressed OGD-induced increase of TNF-α and reduction of TGF-β1 mRNA expressions, and this effect was strongly attenuated by LY294002 treatment.

Conclusion

Gastrodin can inhibit microglia-mediated inflammation in neonatal rats with HIBD by regulating the PI3K/AKT signaling pathway.

Keywords: hypoxic-ischemic brain damage, gastrodin, inflammatory response, oxygen and sugar deprivation, microglia, PI3K/AKT

缺氧缺血性脑损伤（HIBD）通常由脑血流和氧气供应不足引起，易造成新生儿严重的神经功能损伤，约24%的新生儿出现死亡[1-4]。目前，在新生儿出生后进行的低温治疗被证明具有神经保护作用[5, 6]。然而，接受低温治疗的婴儿中仍有近一半死亡或出现明显的神经功能障碍[7, 8]。越来越多的报道证实，脑缺氧缺血引起的神经炎症是围产期脑损伤的主要因素[9, 10]。而小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞，也是导致神经炎症的重要介质[11]。因此，抑制小胶质细胞活化引起的神经炎症反应被认为是一种治疗HIBD的重要策略。

天麻素是传统中药材天麻的主要活性成分之一，其具有抗炎、减少氧化应激[12, 13]、减少神经细胞凋亡[14]、调节神经自噬等神经保护作用[15]。据报道，天麻素可以减少小胶质细胞引起的大脑炎症和细胞凋亡[16]，同时天麻素还能调节小胶质细胞的表型变化[17]。此外，课题组前期研究发现天麻素可以通过Notch通路和Sirtuin3蛋白调控小胶质细胞的激活[18]。然而发生HIBD时，天麻素通过调节激活小胶质细胞介导的炎症反应，发挥保护作用的具体分子机制尚未完全阐明。

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）作为一种脂质激酶，可诱导蛋白激酶B（AKT）磷酸化，响应细胞外信号调节细胞存活、生长和血管生成[19]。有研究表明，PI3K/AKT信号在神经元中具有抗炎、抗氧化应激和抗凋亡的特性[20, 21]。然而，PI3K/AKT信号通路在HIBD中能否参与调控小胶质细胞介导的炎症反应还需进一步验证。因此，本研究旨在通过体内和体外实验探讨天麻素是否通过PI3K/AKT信号通路改善HIBD后小胶质细胞介导的神经炎症，为天麻素作为治疗HIBD的潜在治疗药物提供一些分子作用机制基础。

1. 材料和方法

1.1. 动物与细胞

39只SPF级雌雄不限的新生3日龄SD大鼠与母鼠同笼饲养，提供充足的食物及水，每日光照与黑暗时间各12 h。其中健康成年SD大鼠购于昆明医科大学动物饲养和使用委员会[许可证：SYXK（滇）2015-0002]。本研究对实验动物的饲养和处理严格遵守国际动物研究指导原则，实验操作过程严格执行实验动物福利及伦理各项规定。以最大限度地减少实验动物痛苦和使用的动物数量，所有动物实验均按照昆明医科大学伦理委员会（伦理审批号：kmmu20211454）的要求批准并进行。BV-2小胶质细胞系由新加坡国立大学人体解剖学、组织学和胚胎学系（ATCC，CRL-2005TM）馈赠。

1.2. 药物与试剂

天麻素（纯度99.7%，云南省昆明制药厂）；LY294002（PI3K/AKT通路抑制剂，Selleck）；CCK-8试剂盒（白鲨生物）；DMEM高糖培养基、DMEM无糖培养基（BI）；Trizol（Ambion）；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒（Takara）；PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、TGF-β1、IL-1β、β-actin（OREGENE）；TNF‑α（Milipore）；IL-10（Abcam）。

1.3. 仪器

金属浴（杭州瑞成仪器），超净工作台（珠海市再鑫仪器），恒温细胞培养箱（上海博讯实业），Western blotting电泳仪、Western blotting转膜仪、化学发光成像仪、Real Time PCR扩增仪（BIO-RAD），酶标仪（Thermo Fisher scientific）。

1.4. 方法

1.4.1. 动物造模

将出生后3 d SD大鼠随机分为假手术组（sham，n=9）、HIBD组（n=15）和HIBD +天麻素预处理组（HIBD+G，n=15），七氟烷麻醉，暴露结扎左侧颈总动脉。随后，将其置于含8% 氧气、92% 氮气、28~30 ℃的缺氧装置中2 h。假手术组仅暴露左侧颈总动脉，不进行结扎。HIBD + G组分别于颈动脉结扎前1 h、结扎后1 h、缺氧后12 h，腹腔注射天麻素（溶解于生理盐水中），剂量为100 mg/kg。根据实验目的分别在HIBD后不同时间点（1、3、7 d）麻醉处死老鼠并取下大脑组织，用镊子分离脑组织提取出缺血侧胼胝体，用于Western blotting实验。

1.4.2. 细胞培养、氧糖剥夺（OGD）处理及抑制剂LY294002处理

使用含有10% 的胎牛血清和1% 双抗的完全培养基将BV-2细胞培养于6孔板中，观察板内的细胞生长状态良好，密度约为80%时开始处理。弃去培养基用PBS清洗2次，根据分组（Control、OGD、OGD+G 0.17 mmol/L、OGD+G 0.34 mmol/L）将需要进行OGD处理的细胞培养基换成无血清、无糖培养基后，置于缺氧小室中，通气（95% N2、5% CO2）4 min，在恒温箱（37 ℃）中继续培养2 h。在OGD处理之前先进行天麻素干预（0.17、0.34 mmol/L）1 h，本实验中天麻素浓度依据课题组前期研究结果[22]而定。PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002预处理BV-2小胶质细胞的分组为Control、OGD、OGD+LY294002、OGD+LY294002+G。在OGD处理之前，将细胞用LY294002（15 µmol/L）预处理1 h，之后提取RNA进行RT-qPCR实验。

1.4.3. CCK-8法检测LY294002对BV-2小胶质细胞的细胞毒性作用

将BV-2小胶质细胞于96孔板中培养24 h，每孔细胞用LY294002（0~120 μmol/L）处理1 h，取出细胞，在Cell Counting Kit-8（CCK-8溶液：培养基=1∶100）溶液中继续于37℃的培养箱中孵育3 h。酶标仪测定细胞相应的吸光度值A450nm，根据试剂盒说明书计算细胞活力。

1.4.4. Western blotting检测HIBD大鼠脑组织和OGD诱导活化的BV-2小胶质细胞中相关因子的表达

收集经药物处理后的脑组织和细胞样本，加入蛋白裂解液后收集上清，用BCA试剂盒测定脑组织缺血侧胼胝体和BV-2细胞蛋白浓度，金属浴加热变性，电泳，转膜，封闭，一抗孵育过夜，洗膜后孵育二抗，用凝胶成像分析系统显影，以β-actin为内参，分析目的蛋白表达水平。

1.4.5. 网络药理学分析及分子对接

利用PharmMapper和SwissTargetPrediction数据库对天麻素潜在作用靶标进行筛选；利用生物信息学和化学信息学（DrugBank）数据库、人类孟德尔遗传（OMIM）数据库和人类基因综合数据库（GeneCards）获取HIBD疾病相关潜在靶点；通过蛋白质数据库（Uniprot）对靶点标准去重，导入韦恩（Venny）在线平台，得到两者交集靶点；利用基因间功能关联（STRING）数据库和Cytoscape 3.7.1软件对交集靶点进行蛋白相互作用（PPI）可视化分析，构建互作可视化图；利用Metascape平台对二者交集靶点分别进行GO和KEGG富集分析。运用微生信在线平台进行作图；通过AutoDock Vina1.5.6软件对天麻素与通路上游蛋白PI3K进行分子对接验证并实现对接结果的可视化。

1.4.6. RT-qPCR检测PI3K/AKT信号通路在天麻素调节活化BV-2小胶质细胞介导炎症反应中的作用

使用Trizol从BV-2小胶质细胞中提取总RNA，进行定量后根据逆转录试剂盒的说明，逆转录合成cDNA。将cDNA用作qPCR步骤的模板，根据试剂盒说明书配制反应混合物进行RT-qPCR实验。检测炎性因子TNF-α和转化生长因子TGF-β1的mRNA表达水平。目的基因相对mRNA表达量采用2−△△Ct法计算，实验独立进行3次，引物生工生物序列见表 1。

表 1.

引物序列

Primer sequence for RT-qPCR

Primer Sequence (5'-3')
TGF-β1 F GCTGAACCAAGGAGACGGAA
TGF-β1 R TCTTCTCTGTGGAGCGTTGAT
TNF-α F ACCCTCACACTCACAAACCA
TNF-α R GGCAGAGAGGAGGTTGACTTT
β-actin F GTGGGAATGGGTCAGAAGGA
β-actin R TACATGGCTGGGGTGTTGAA
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1.5. 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析。方差齐性检验后，采用单因素方差分析（ANOVA）进行多重比较。所有实验均独立重复3次，p < 0.05认为差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. 天麻素对新生HIBD大鼠炎症反应的影响

Western blotting结果显示，与sham组相比，HIBD 1、3和7 d新生大鼠中，炎性因子TNF-α、IL-1β的蛋白表达明显增加（P < 0.05），而抗炎因子IL-10和TGF-β1的蛋白表达显著降低（P < 0.05），使用天麻素干预后TNF-α、IL-1β的蛋白表达明显降低（P < 0.05），而IL-10和TGF-β1的蛋白表达显著增加（P < 0.05，图 1）

图 1.

图 1

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蛋白印迹法检测HIBD后天麻素对炎性因子TNF-α、IL-1β、抗炎因子IL-10和转化生长因子TGF-β1蛋白表达的影响

Effect of gastrodin on expressions of TNF-α, IL-1β, IL-10 and TGF-β1 proteins in the in brain tissue of neonatal rats at 1 day, 3 days, and 7 days after HIBD detected by Western blotting. A, C, E: Protein blots of TNF-α, IL-1β, IL-10, and TGF-β1. B, D, F: Quantification of TNF-α, IL-1β, IL-10, and TGF-β1 expression levels. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 (n=3).

2.2. 天麻素治疗HIBD疾病的网络药理学结果

获取天麻素潜在作用靶点266个，HIBD疾病相关靶点398个，二者的交集靶点28个。通过PPI网络可视化分析，根据度值大小筛选出排名前五的核心基因：NF-κB、IL-1β、AKT1、MMP9和IL-6均和炎症反应密切相关（图 2）。KEGG富集到TNF信号通路、MAPK信号通路等炎症反应相关通路。对MAPK信号通路进一步进行KEGG富集，发现PI3K/AKT信号通路显著富集（图 3）。将天麻素与PI3K进行分子对接，发现二者之间的结合能为-6.6 kcal/mol，能较好的结合（图 4）。

图 2.

图 2

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天麻素治疗HIBD潜在核心靶点的PPI网络图和GO富集分析

PPI network diagram and GO enrichment analysis of potential core target of gastrodin treatment of HIBD. A: PPI network diagram.B: GO enrichment analysis.

图 3.

图 3

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天麻素治疗HIBD潜在核心靶点的KEGG富集分析

KEGG enrichment analysis of potential core targets for gastrodin treatment of HIBD. A, B: KEGG pathway enrichment analysis.

图 4.

图 4

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天麻素与PI3K信号通路蛋白分子对接

Gastrodin and PI3K signaling pathway visualization protein molecular docking.

2.3. 天麻素促进HIBD后活化小胶质细胞中PI3K/AKT通路的表达

Western blotting结果显示，与sham组相比，HIBD 1、3和7d新生大鼠中，PI3K/AKT通路相关因子PI3K、AKT磷酸化水平明显降低（p < 0.05），而天麻素干预后PI3K、AKT磷酸化水平明显增加（p < 0.05，图 5），总蛋白PI3K和AKT的蛋白表达无显著变化。

图 5.

图 5

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蛋白印迹法检测HIBD后天麻素对活化小胶质细胞中PI3K/AKT信号通路表达的影响

Effect of gastrodin on expressions of PI3K/AKT signaling pathway in activated microglia of neonatal rats at 1 day, 3 days, and 7 days after HIBD detected by Western blotting. A, C, E: Western blots of the related proteins in PI3K/AKT signaling pathway. B, D, F: Quantification of P-PI3K, PI3K, P-AKT, and AKT protein levels. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 (n=3).

2.4. 天麻素促进OGD诱导活化的BV-2小胶质细胞中PI3K/AKT通路的表达

Western blotting结果显示，与Control组相比，OGD组PI3K/AKT通路相关因子PI3K、AKT磷酸化水平明显降低（P < 0.05），而天麻素干预后PI3K、AKT磷酸化水平明显增加（P < 0.05，图 6），总蛋白PI3K和AKT的蛋白表达无显著变化。

图 6.

图 6

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蛋白印迹法检测OGD后天麻素对活化小胶质细胞中PI3K/AKT信号通路表达的影响

Effect of gastrodin on expression of PI3K/AKT signaling pathway in activated microglia BV-2 cells after OGD detected by western blotting. A: Western blots of the related proteins in PI3K/AKT signaling pathway in BV-2 cells. B: Quantification of P-PI3K, PI3K, P-AKT, and AKT protein levels. *P < 0.05, **P < 0.01(n=3).

2.5. PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002对BV-2小胶质细胞的细胞毒性作用

CCK8结果显示，0~120 μmol/L内的LY294002对BV-2小胶质细胞无明显毒性作用（图 7）。

图 7.

图 7

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CCK8法检测LY294002对BV-2细胞细胞毒性作用的影响

The cytotoxic effect of LY294002 on BV-2cells was detected by CCK8 kit.

2.6. 天麻素通过PI3K/AKT信号通路抑制炎性因子TNF-α的表达，促进TGF-β1的表达

RT-qPCR结果显示，与Control相比，OGD组炎症因子TNF-α的mRNA水平增加，转化生长因子TGF-β1的mRNA水平明显降低（P < 0.05）；与OGD相比，天麻素干预（OGD+G）后TNF-α的mRNA水平显著降低，TGF-β1的mRNA水平显著增加（P < 0.05）；与OGD相比，LY294002处理（OGD+LY294002）后TNF- α的mRNA水平进一步升高，TGF-β1的mRNA水平进一步降低（P < 0.05）；然而与OGD+LY294002组相比，天麻素和LY294002联合作用（OGD+LY294002+G）时TNF-α和TGF-β1的mRNA表达无明显变化（图 8）。

图 8.

图 8

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RT-qPCR检测OGD后天麻素通过PI3K/AKT信号通路对活化小胶质细胞中炎症因子TNF-α和转化生长因子TGF-β1 mRNA水平表达变化的影响

Effect of gastrodin and LY294002 on TNF-α (A) and TGF-β1 mRNA (B) expressions in BV-2 cells with OGD detected by RT-qPCR.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 (n=3).

3. 讨论

缺氧缺血性脑病（HIE）是婴幼儿急性死亡和慢性神经系统疾病的主要原因。脑缺氧缺血后数小时内发生的一系列神经毒性事件，如氧化应激、炎症反应等，导致广泛的神经元死亡和脑功能障碍[23]。越来越多的证据表明，中枢神经系统的各种病理改变可引起神经炎症。其中，小胶质细胞和星形胶质细胞是神经炎症的主要因子[24, 25]。值得注意的是，小胶质细胞的激活和聚集是新生儿HIBD的主要病理标志。活化的小胶质细胞产生多种细胞毒性因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6和NO导致神经炎症和神经元功能障碍的发生[26]。研究表明，HIE模型中小胶质细胞的耗竭会增加脑损伤，提示小胶质细胞在组织修复中起着重要作用[27, 28]。在一项模拟炎症敏感性缺氧缺血性脑损伤的研究中，结果显示损伤后24 h小胶质细胞中促炎细胞因子表达上调[29]。这表明小胶质细胞在炎症敏感性缺氧缺血后被激活，并表现为促炎表型，加重炎症反应。因此，研究HIBD后活化小胶质细胞介导的炎症反应可能是治疗HIBD至关重要的一个环节。

天麻素具有多种药理作用，包括抗炎、抗缺氧和抗氧化作用。天麻素能不同程度地增加脑血流量，降低血管阻力，抑制神经细胞凋亡，对缺氧培养的皮层神经元具有神经保护作用。此外，天麻素能抑制脂多糖（LPS）刺激的小胶质细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶-2和促炎细胞因子的表达[30]。据报道，天麻素能下调创伤后应激障碍模型大鼠海马区IL-6和IL-1β表达水平，抑制p38 MAPK的磷酸化[31]，提示天麻素可能抑制炎症相关的信号通路。综上，我们推断天麻素能对HIBD发挥一定神经保护作用。为了验证这一猜测，我们通过建立新生大鼠HIBD模型和OGD诱导BV-2小胶质细胞模型，分别进行了体内和体外实验研究，进一步探讨天麻素对HIBD疾病的神经保护作用。本研究结果显示，HIBD 1、3和7 d新生大鼠缺血侧胼胝体内炎性因子TNF-α、IL-1β的蛋白表达显著增加，而抗炎因子IL-10和转化生长因子TGF-β1的蛋白表达明显降低。天麻素干预后，抑制了促炎因子TNF-α和IL-1β的蛋白表达，并显著上调抗炎细胞因子IL-10和转化生长因子TGF-β1的蛋白表达。因此，我们得出结论天麻素能抑制HIBD后炎症因子的表达，促进抗炎因子的表达，发挥其神经保护作用。

已有研究发现天麻素对HIBD的神经保护作用涉及多种信号通路，如Notch信号通路[18]、肾素-血管紧张素系统[22]等。然而，天麻素通过调节小胶质细胞介导的炎症反应来治疗HIBD的具体分子机制尚不清楚。因此，为了筛选潜在的靶点和通路，本研究采用网络药理学分析，筛选出28个可能参与天麻素治疗HIBD疾病过程的潜在靶基因。其中排名前五的核心靶点分别是NF-κB、IL-1β、AKT1、MMP9和IL-6。此外，KEGG富集到TNF信号通路、MAPK信号通路等多条通路，其中PI3K/AKT信号通路显著富集。接着，我们将天麻素与PI3K进行分子对接，发现二者之间具有较好的结合能力。

PI3K/AKT通路是控制细胞多种过程的重要途径，包括细胞分裂、分化和存活[32]。已知PI3K是一个保守的信号转导酶家族，在调节细胞存活和凋亡中发挥关键作用[33]。PI3K及其下游丝氨酸/苏氨酸激酶AKT，也称为蛋白激酶B（PKB），调节众多细胞过程，如炎症、凋亡和细胞激活[34]。有研究发现，PI3K/AKT激活可能在缺血性脑卒中引起的神经损伤和神经炎症中发挥促生存作用[35]。值得注意的是，天麻素可以通过PI3K-AKTmTOR途径抑制细胞自噬，从而对LPS刺激的星形胶质细胞起到保护作用[36]。基于此，我们猜想当发生HIBD时，PI3K/AKT信号通路是否也存在一定影响。本研究体内体外实验结果验证发现，在HIBD和OGD诱导活化的小胶质细胞中，PI3K/AKT通路关键蛋白PI3K和AKT的磷酸化水平显著降低，而天麻素干预后二者磷酸化水平显著增加。该结果说明天麻素能促进活化小胶质细胞中PI3K/AKT通路的表达。然而，天麻素通过该信号通路发挥作用的具体分子机制还尚未探明。因此，我们在体外实验加入PI3K/AKT信号通路的特异性抑制剂LY294002，结果显示，该抑制剂在一定浓度范围内不会影响BV-2小胶质细胞的细胞活力。此外，与对照组相比，OGD诱导BV-2小胶质细胞后炎症因子TNF-α的mRNA水平增加，转化生长因子TGF-β1的mRNA水平降低；天麻素干预后显著抑制TNF-α的表达，促进TGF-β1的表达。而LY294002预处理后，TNF-α的mRNA水平进一步显著增加，TGF-β1的mRNA水平仍然降低。值得注意的是，阻断PI3K/AKT通路后天麻素干预对二者的mRNA水平无明显影响。

综上，本研究的实验结果表明，在HIBD和OGD诱导活化的小胶质细胞中，天麻素能促进PI3K/AKT信号通路的表达，且天麻素通过PI3K/AKT通路降低炎性因子的表达，抑制炎症反应，发挥神经保护作用。

Biography

左涵珺，在读博士研究生，E-mail: zhj2020320@163.com

Funding Statement

国家自然科学基金（31960194）

Supported by National Natural Science Foundation of China (31960194)

Contributor Information

左 涵珺 (Hanjun ZUO), Email: zhj2020320@163.com.

李 娟娟 (Juanjuan LI), Email: lijuanjuan@kmmu.edu.cn.

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