石墨烯及其衍生物在骨修复中的应用及展望

Abstract

目的

总结石墨烯及其衍生物（graphene and its derivatives，GDs）在骨修复领域的最新研究进展。

方法

广泛查阅近年来国内外相关研究文献，对GDs在骨修复材料中的性能表现（包括力学性能、导电性能和抗菌性能等）进行系统总结，探讨其在材料制备、功能化和应用方面的独特优势，以及对骨组织工程的贡献和挑战。

结果

GDs在骨修复材料中的应用具有广泛前景，功能化和改性技术有效提升了GDs的成骨活性和材料性能。GDs可通过特定信号通路诱导干细胞成骨分化，并通过免疫调节机制促进成骨活性。此外，GDs的参数对细胞毒性和降解行为具有显著影响。

结论

GDs凭借优异的物理化学特性和生物学性能，在骨修复领域具有巨大潜力。然而，仍需针对其细胞毒性、生物降解性及功能化策略展开进一步研究，以实现GDs在骨组织工程领域的更广泛应用。

近年来，创伤或手术导致的骨缺损发生率不断上升，骨移植手术已成为仅次于输血的第二大组织移植手术^[1-2]。自体骨移植被认为是骨修复的“金标准”，然而自体骨来源有限且容易导致供骨部位二次缺损^[3]，目前多采用人造骨修复材料替代自体骨。经过对材料、实验方法、表征技术等领域的不断探索，纳米材料因结构、物理性能等特征与天然骨相似，逐渐成为骨修复材料的研究热点^[4-5]。

石墨烯及其衍生物（graphene and its derivatives，GDs）是纳米材料的典型代表，具有优异的力学性能、电导率等特点，在骨修复领域具有广阔应用前景^[6]。然而，纯石墨烯颗粒易团聚，难以形成单质三维支架，将纯石墨烯颗粒与其他材料复合用于骨修复治疗是主要研究方向，而其复合方式是主要难点^[7]。因此，使用前功能化处理GDs至关重要^[8]。首先，需制备氧化石墨烯（graphene oxide，GO）^[9-10]，然后在GO基础上引入羧基^[11]、氨基^[12]、羟基^[13]及其他官能团，以改善石墨烯的流动性、分散性、生物活性等，形成功能化GDs^[14]。目前，功能化GDs已与金属^[15]、天然聚合物^[16]、无机物^[17]等复合，制备出可注射水凝胶^[18]、生物支架^[19]、涂层^[20]、生物膜^[21]等多种材料。此外，GDs还能激活一些特定的信号通路，达到促进骨修复的作用，如Wnt/β-catenin通路^[22]、MSCs的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路^[23]以及单核细胞和巨噬细胞中的Wnt和BMP信号通路^[24]。

然而，GDs的潜在毒性和体内残留问题仍是其临床应用的主要挑战。研究表明，GDs的潜在毒性取决于其尺寸、浓度、功能化和结构形式等。GDs浓度超过10 μg/mL可能会抑制BMSCs增殖^[25]，而功能化处理等可在一定程度上降低GDs的毒性风险^[26]。此外，GDs的降解性能受层数、官能团类型以及与其他复合材料的结合方式等因素影响，例如层数较少的GDs更易被酶降解，特定功能基团（如磷酸基团）可增强其与酶的相互作用^[27]。另一方面，将GDs与可降解聚合物复合，不仅可以提高其降解性能，还能改善整体生物相容性^[28]。

因此，GDs的应用在骨修复临床治疗上具有较大潜力。本文将对GDs在骨修复中的应用进展进行总结分析，旨在全面介绍其应用优势，剖析GDs未来发展前景及面临的挑战。

1. GDs应用于骨修复材料的优势

1.1. 机械性能

骨修复材料的本征机械性能对整体性能有重要影响。石墨烯是由sp2混合C-C键组成的单层碳原子构成，具有高键能的特点^[29]。研究表明，石墨烯硬度甚至超过了金刚石，其杨氏模量、刚度和断裂强度分别高达1.0 TPa、2.0 TPa和130 GPa^[30]。此外，GDs能够强化骨修复材料性能，主要取决于基质中GDs的层数、含量等因素。

石墨烯的层数、含量和分布特性是影响材料机械性能的主要原因。由于石墨烯各层之间只有相对较弱的范德华力，因此材料整体的机械性能通常随着石墨烯层数的增加而下降^[31]。Eqra等^[32]用<10层的石墨烯（10 layers of graphene，GEC10）和<30层的石墨烯（30 layers of graphene，GEC30）增强环氧树脂，结果表明，当石墨烯含量为0.1 wt.%时，GEC10和GEC30样品的拉伸强度均达到最大值，其中GEC10样品的拉伸强度峰值比GEC30样品高4.8%。随着基质中GDs含量增加，复合材料的力学性能呈现先升后降的趋势，主要是由于GDs的团聚^[33]。因此，为进一步提升复合材料的力学性能，使其满足骨修复材料在机械强度和稳定性方面的严格要求，GDs在基质中的分散和界面结合方式等是主要研究方向之一。

1.2. 导电性能

提高骨修复材料的导电性可增强其成骨效果^[34]。石墨烯因其每个碳原子在垂直于单层平面的pz轨道上与相邻碳原子形成π键结构，同时比表面积较大，因此具备极佳的导电性^[35]。在室温下，石墨烯单层的电导率高达1×10⁴ S/cm，电子迁移率高达15 000 cm²/（V·s）^[36]。GDs可作为电极引入基质，制备的复合材料具有良好导电性，能够通过体外电刺激促进细胞的成骨活性。与传统金属电极相比，含石墨烯的复合材料具有更低阻抗和更高电荷注入能力。

此外，除了GDs本身具有出色的导电性外，GDs还可以通过改变基质的相结构来增强压电生物材料的电输出性能，从而在体内生物环境中提供新骨形成所需的电刺激^[37]。Shuai等^[37]将GO引入聚偏二氟乙烯中制备复合支架，结果表明含有0.3 wt.% GO的支架表现最佳，最大输出电压（8.2 V）和电流（101.6 nA）分别提高了82.2%和68.2%，主要是由于GO含氧官能团与聚偏二氟乙烯含氟基团间的氢键改善了界面结合，并提高了能量转换效率。然而，过高的GO含量会因团聚效应导致电输出能力下降。

1.3. 比表面积

GDs的大比表面积不仅能提高细胞黏附性，还使其易于功能化后与其他活性材料结合，成为与活性物质结合的“桥梁”^[38]，改善骨修复材料性能。骨修复中常用的GDs功能化方法包括羧基化^[39]、硅烷化^[40-41]、羟基化^[42]、多巴胺修饰^[43-44]和氨基化^[45-46]。见表1。

表 1.

Functionalization of GDs for bone repair

功能化GDs用于骨修复

功能化 Functionalization	制备方法 Preparation method	性能 Property	功能 Function	参考文献 Reference
羧基化	NaOH/ClCH2COOH或KMnO4/H2SO4	结合更多阳性氨基酸	促进MG63细胞的矿化作用	[39]
硅烷化	用3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷进行硅烷 偶联的方法（包括水解、混合、洗涤、冷冻干燥）	改善石墨烯的分散性；提高 材料的抗压强度和抗弯强度	较低的细胞毒性	[40-41]
羟基化	KMnO4/H2SO4或在NaOH中剪切和乳化	更好的机械性能和导电性能	促进大鼠脂肪基质细胞增殖	[42]
多巴胺	化学气相沉积法	显著提高与BMP-2的结合 能力和释放能力	改善外源性 BMP-2诱导的成骨分化	[43-44]
氨基化	氯化亚砜/乙二胺/二甲基甲酰胺	更好的热稳定性和更高的 机械性能	骨结合力更强，细胞毒性更低	[45-46]

通过羧基改性，GDs表面带负电荷，有利于通过结合阳离子来改善复合材料的性能。Chen等^[39]通过制备羧基氧化石墨烯与氧化锌的复合材料，发现该材料显著提高了MG-63细胞的ALP活性、细胞外基质矿化能力，并具有良好的抑菌作用。

硅烷化改善了GDs的分散性，使聚合后的GDs与基质之间的黏附力更强。Paz等^[40]将硅烷化石墨烯引入聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）骨水泥，结果显示复合材料的抗压强度、抗弯强度和断裂韧性分别提高了12%、13.7%和28%，显著优化了其力学性能。

羟基化修饰通过引入羟基提高了GDs的亲水性，为细胞增殖提供了更优微环境。Sun等^[42]通过KMnO₄/H₂SO₄和NaOH剪切乳化两步法制备了羟基化石墨烯，体外实验显示其显著促进了脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的增殖。

多巴胺改性能够增强GDs对血清蛋白的吸附性能。聚多巴胺（polydopamine，PDA）中的儿茶酚基团可与蛋白质上的氨基共价结合，从而固定更多血清蛋白于复合材料表面，形成有利于细胞快速吸附和稳定黏附的细胞外基质^[44]。Jia等^[43]采用蒸发辅助静电组装法，将PDA与还原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，rGO）共价结合制备rGO-PDA，并引入钛基底制备复合材料。体外实验显示，与GO相比，rGO-PDA显著提高了小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1细胞）的黏附、生长及ALP表达。

通过氨基化在GDs表面引入正电荷，可增加GDs对成骨细胞膜表面羧酸根离子和磷酸根离子的吸引力。Sharma等^[45]将胺化石墨烯与PMMA骨水泥基质混合，制备出胺化石墨烯/PMMA复合材料。结果表明，胺化石墨烯可以促进复合材料的骨结合，降低其细胞毒性，而且胺化石墨烯/PMMA复合材料植入兔体内后能更早钙化。

在GDs功能化基础上，与基因^[47-48]、多肽^[49-51]、活性因子^[52-53]和药物^[54-56]等活性分子结合，有助于活性分子持续释放，见表2。这些活性分子可长期增强骨修复材料的增殖、生长、成骨分化、抗菌等功能。然而，功能化GDs对不同活性分子的作用机制和效果各不相同。当功能化GDs用作基因转染细胞的载体时，其表面电荷是影响转染效率的最重要因素之一^[47]。

表 2.

Application of GDs-loaded active substance in bone repair

载GDs的活性物质在骨修复中的应用

活性物质种类 Types of active substance	举例 Example	制备方法 Preparation method		性能 Property		功能 Function	参考文献 Reference
注：EDC：1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺；NHS：N-羟基琥珀酰亚胺；nHAC：纳米羟基磷灰石；CS：壳聚糖
Note: EDC: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide; NHS: N-Hydroxysuccinimide; nHAC: Nano-hydroxyapatite; CS: Chitosan
基因	绿色荧光蛋白基因	将含绿色荧光蛋白基因的PEGFP-N1质粒吸附在石墨烯-油酸-聚氨基胺的复合材料表面		在水溶液中具有良好的分散性和稳定性		提高基因的转染效率	[47]
	MiR-7b	在水溶液中混合MiR-7b质粒和GO-聚乙烯亚胺复合物以制备 GO-聚乙烯亚胺Ⅰ-miR-7b复合物		－		在骨髓巨噬细胞中的转染效率高；阻断破骨细胞的细胞间融合，促进骨再生	[48]
多肽	聚赖氨酸	自组装		机械强度高		增强PC12细胞的黏附力和神经元生长能力	[49]
	分子特异性肽（LLVFGAKMLPHHGA）	肽通过浸渍被吸附在支架表面		形状可调、重量轻、孔隙率高		易于矿化	[50]
	精氨酸-甘氨酸- 天冬氨酸肽	精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽吸附到铟锡氧化物基底上的GO/二氧化硅纳米颗粒复合材料表面		优异的导电性		促进ADSCs的成骨分化	[51]
活性因子	BMP-2	通过浸渍法将BMP-2因子吸附在GO-Fe3O4纳米粒子表面		－		促进牙髓干细胞的成骨分化	[52]
	人重组BMP-2	通过浸渍法将人重组BMP-2因子吸附在肝素修饰的石墨烯支架表面		显著延长因子的释放时间		促进C2C12细胞的成骨细胞分化	[53]
药物	辛伐他汀	采用EDC/NHS交联方法将辛伐他汀与GO-CS-透明质酸复合支架交联		为支架提供更高的机械支持		MC3T3-E1细胞具有更高的矿化活性	[54]
	地塞米松	通过磷酸酯键的共价键合，使用地塞米松制备了地塞米松-磷酸单酯-GO-CS复合支架		在不同pH值条件下，支架实现了长时间持续释放		优良的生物相容性	[55]
	万古霉素	通过浸渍，万古霉素被吸附在rGO/nHAC复合支架表面		抑制病原体复苏		提高BMSCs的细胞黏附性和成骨分化能力	[56]

另外，GDs通过与活性分子的结合以及载体表面电荷的调控，显著提高了复合材料的生物活性。Eckhart等^[49]通过酰化将聚赖氨酸与羧基氧化石墨烯共价结合，增强了材料的导电性和PC12细胞的黏附力。Zhang等^[52]通过-COOH将Fe³⁺引入GO，制备磁性纳米颗粒（GO-Fe₃O₄）并固定BMP-2，通过内吞作用促进牙髓干细胞的增殖、迁移和成骨分化。GO提供的羧基提升了生长因子的结合效率，并在磁性纳米颗粒的辅助下显著促进骨形成。

1.4. 抗菌性能

GDs的抗菌作用主要通过物理破坏和化学作用两种机制实现。从物理作用来看，GDs利用其锋利的边缘和片状结构，导致细胞内的RNA、电解质等物质泄漏，最终导致细菌死亡^[57]。GDs的大小影响其在脂质双分子层中的结合方式，尺寸较大的GDs纳米片倾向于垂直排列，而尺寸较小的纳米片则倾向于平行排列^[58]。磷脂的烃尾与GDs亲脂表面之间的相互作用促进了GDs纳米片插入细胞膜。研究表明，多层石墨烯的杀菌效果低于单层石墨烯，因为层数增加会导致石墨烯聚集，减少纳米材料与细菌的相互作用^[59]。

从化学机制角度来看，GDs的化学抗菌机制主要通过生成活性氧（reactive oxygen species，ROS）来实现^[60]。GDs在光照条件下能够产生多种ROS，如羟基自由基、H₂O₂和超氧化物阴离子等。ROS会对细菌细胞的脂质、蛋白质和DNA造成氧化损伤，从而危害细胞^[61]。此外，高浓度的ROS对生物体具有极大的破坏性，会导致脂质过氧化、蛋白质氧化、核酸损伤和酶抑制，并激活细胞程序性死亡途径^[62]。Zhang等^[63]研究了GO的氧化度对其毒性的影响，发现氧化度较低的GO通过促进H₂O₂分解成羟基自由基，产生较高水平的ROS和氧化损伤，对细菌细胞具有更强的直接氧化能力。

GDs的抗菌性能受多种因素影响，包括其尺寸、形状、浓度和表面修饰等^[64]。首先，较小尺寸的GDs具有更大的比表面积和更多活性边缘，可为细菌微生物提供更多黏附位点，具有更强的抗菌性能。其次，GDs的形状也会影响其抗菌效果，片状结构通常比球形结构具有更强的物理破坏能力。此外，GDs的浓度是影响抗菌性能的关键因素之一，较高浓度的GDs能够提供更多活性位点，从而具有更强抗菌效果。最后，通过表面修饰，如引入亲水性基团或金属纳米颗粒，可以增强GDs的分散性和抗菌活性，从而进一步提高其抗菌性能^[64]。

1.5. 骨相关细胞的功能和骨的再生能力

GDs被誉为下一代生物活性纳米材料，不仅能在体外显著提升骨相关细胞的功能，如黏附、增殖、成骨分化和矿化，还能在体内有效促进骨再生。

研究表明，在基质中引入少量GDs可显著改善成骨细胞的相关功能，如黏附和增殖^[65]。Liang等^[66]通过冷冻干燥法制备了nHAC/聚乳酸-羟基乙酸共聚物 ［poly（lactic-co-glycolic acid）PLGA］/ GO三维多孔支架，结果表明，加入GO显著促进了MC3T3-E1细胞在第3、5、7天的黏附和增殖，同时细胞体积更大、伸展性更强。Li等^[67]在Ti-6Al-4V合金表面制备rGO涂层，发现其显著促进了MC3T3-E1细胞的生长和成骨分化，并在第7天时显著提高了骨唾液酸蛋白、骨钙素和Runt相关转录因子2的基因表达水平，表现出优异的成骨性能。

此外，GDs还能调节不同来源干细胞的成骨分化，因为它们提供了类似天然细胞外基质的独特物理框架。Newby等^[68]制备了氧含量为6%～10%的GO纳米颗粒，并将其与MSCs共培养，通过茜素红染色和定量分析评估石墨烯纳米颗粒对干细胞成骨分化的影响。结果表明，与GO纳米颗粒共培养的MSCs的钙含量显著高于对照组，即使在无骨诱导剂情况下，也能观察到钙含量上升，表明GO纳米颗粒能自发诱导MSCs中的钙积累。

另一方面，各种动物模型的体内实验表明，GDs不仅能促进骨修复，还能显著增强异位骨形成^[69-70]。Zou等^[69]制备了石墨烯和皂石复合纳米颗粒，并将其与感染了重组腺病毒-BMP-9的MSCs混合，植入无胸腺裸鼠皮下。结果表明，含石墨烯的复合纳米颗粒显著增强了BMP-9诱导的MSCs异位骨形成。

2. 用于骨修复的不同复合材料

GDs可以引入金属^[71-73]、无机非金属^[74-77]、天然聚合物^[78-80]和合成聚合物^[81-84]等不同基质中，从而制备出性能更优越的骨修复材料。见表3。在制备和开发承重骨材料方面，GDs发挥了至关重要的作用^[71-73]。具有优异性能的GDs被用来改善复合材料的体内外功能，而GDs和其他材料的协同作用则为进一步提升复合材料的性能提供了良好微环境。

表 3.

GDs-containing composites and their application in bone repair

含GDs的复合材料及其在骨修复中的应用

基材类型 Types of substrate	举例 Example	制备方法 Preparation method		结构 Structure		性能 Property		功能 Function	参考文献 Reference
注：APS：3-氨丙基三甲氧基硅烷；nHAP：纳米羟基磷灰石颗粒
Note: APS: 3-aminopropyltrimethoxysilane; nHAP: Nano hydroxyapatite particles
金属	钛	使用NaOH/APS进行硅烷偶联		三维多孔纳米片		亲水性、粗糙表面		促进BMSCs的ALP活性、细胞外基质的矿化和胶原蛋白分泌	[71]
	锌	丝素蛋白/GO自组装并涂覆于阳极氧化锌基板上		GO涂层附着在锌表面，形成了许多氧化 锌纳米管		－		优异的杀菌活性和成骨活性	[72]
	镁	用球磨机将镁粉和 0.1 wt%石墨烯纳米 片分散，再烧结		微米级颗粒		提高硬度和耐腐蚀性		－	[73]
无机物质	羟基磷灰石	通过原位合成和微波辅助法制备GO/CS/nHAP		三维多孔支架		更好的分散性和显著强度		显著提高 MC3T3-E1细胞活性	[74]
	磷酸钙	液相和粉相混合		粗糙的微孔		更高的稳定性、可注射性和流变性		略微提高BMSCs的存活率	[75]
	碳酸钙	CaCl2/rGO和Na2CO3水溶液的反应		中空微球		对pH值敏感的释放特性		无细胞毒性	[76]
	硅酸三钙	液相和粉相混合		表面粗糙且多孔的球形颗粒		抗压强度更高，pH值更低		提高MC3T3-E1细胞增殖和抗菌能力	[77]
天然聚合物	CS	原位结晶过程 ［醋酸、Ca（NO3）2和K2HPO4水溶液］		三维多孔骨状分层结构		生物降解性以及适当的吸水性和保水性		优异的生物活性和诱导原位骨再生能力	[78]
	纤维素	分散沉积干燥		涂有GO涂层的纤维素纸		阻抗更低，电荷注入能力更强		促进ADSCs的增殖和成骨分化	[79]
	胶原蛋白	溶胶-凝胶法		高孔隙率和相互连接的气凝胶		优异的亲水性和压缩性能		更好的生物矿化性和细胞相容性	[80]
合成聚合物	聚己内酯	3D打印		三维多孔结构		导电性能显著提高		体外矿化成核率更高	[81]
	聚乙烯亚胺	通过EDC/NHS将聚乙烯亚胺与GO交联		纳米填充物		提高极限拉伸强度和弹性模量		促进与基体的有效界面黏附和相容性	[82]
	聚氨酯	3D打印		三维多孔结构		更好的拉伸强度和弯曲强度		－	[83]
	聚乳酸	静电纺丝		纳米复合 纤维		提高拉伸强度和弹性模量		促进Saos-2细胞增殖	[84]

2.1. GDs在金属基底中的应用

GDs最初多以涂层形式引入金属基底。之后为获得更接近天然骨骼的微观结构，研究者们开始在金属中引入GDs以制备三维结构。Qiu等^[71]将GO引入经过NaOH/APS处理的钛基底，随后通过碱性热处理法将GO还原成rGO，制备出了三维多孔纳米复合材料。结果表明，该纳米复合材料可促进大鼠MSCs的ALP活性、细胞外基质矿化和胶原分泌。此外，复合材料表面基因的表达也有所增加，如ALP、BMP-2、骨钙素和骨桥蛋白。这些功能的改善可能是由于钛基底表面引入的硅醇交联形成了独特三维结构，影响了细胞-细胞和细胞-材料之间的相互作用。

2.2. GDs在无机非金属材料中的应用

在骨的组成中，羟基磷灰石等无机物占很大比例，因此能否促进天然骨中无机物的生物矿化是骨修复过程中的一个重要指标^[74-77]。既往基于聚合物的无机和有机复合支架是骨修复的常见选择，但无机颗粒的团聚会影响其整体稳定性和生物活性，引入GDs可以有效解决这些问题。Zhao等^[74]通过原位一步仿生技术，将nHAP颗粒引入CS和GO共价结合网络基质中，制备了GO/CS/nHAP支架，这些支架具有优异的物理和化学特性，如三维多孔结构、机械特性、生物降解性和吸水性。体外实验表明，与CS/nHAP组相比，GO/CS/nHAP组的缺损几乎被新生骨组织填充，并与天然骨形成完整结构。其原因包括以下几个方面：首先，GO/CS的网络基底有效调节了nHAP在纳米尺度上的均匀分散，促进了类骨结构的形成；其次，GO/CS的共价结合加强了有机材料与无机材料之间的界面相互作用，提高了GO/CS/nHAP支架在降解过程中的稳定性；第三，GO的片状结构在复合纤维之间保持了一定空间，提高了GO/CS/nHAP支架的亲水性；最后，GO和CS上丰富的官能团促进了损伤部位内源性干细胞的增殖和分化，从而实现了内源性骨组织再生。

2.3. GDs在聚合物中的应用

聚合物因其易成型、可降解等优点被广泛用作骨修复材料。然而，许多纯聚合物如聚乳酸、聚己内酯等缺乏功能基团，导致细胞反应能力低下。通过膜层压、纤维黏合、3D打印等方法将GDs均匀分散到聚合物基体中，可以弥补这些缺陷。Unagolla等^[81]通过3D打印技术制备了聚己内酯-GO复合支架，结果表明，纯聚己内酯支架表面粗糙且不规则，而含有GO的支架表面光滑且有GO颗粒，并且GO提高了复合材料支架的ALP活性。钙磷含量分析表明，与纯聚己内酯支架相比，GO促进了支架的矿化。此外，Western blot分析表明，聚己内酯-GO复合支架的多孔结构促进了BMP-2和骨桥蛋白的分泌，从而刺激了骨的生成。

3. GDs促成骨活性的机制

3.1. 参与GDs诱导干细胞成骨分化的信号通路

在骨形成过程中，不同来源的干细胞可以作为祖细胞，这些干细胞的招募和成骨分化是骨再生的关键因素，也是评价骨修复材料性能的重要指标。目前研究的干细胞有多种类型，包括BMSCs、ADSCs、乳牙牙髓干细胞和扁桃体间充质干细胞。通过细胞生物学检测和核糖核酸测序，评估了GDs诱导干细胞分化为成骨细胞的信号通路。GDs被证明具有诱导成骨的能力^[85-93]，在促成骨活性中涉及的信号通路中发挥着重要作用。见表4。

表 4.

Study on the signaling pathways involved in GDs-induced osteogenic differentiation of stem cells

有关GDs诱导干细胞成骨分化信号通路的研究

信号通路 Signaling pathway	材料 Material	结构 Structure	干细胞种类 Stem cell species	方法 Method	参考文献 Reference
注：PI3K：磷脂酰肌醇-3激酶；Akt：蛋白激酶B；GSK-3β：糖原合成酶激酶-3；ERK1/2：细胞外调节蛋白激酶；JNK：应激活化蛋白激酶；FoxO1：叉头框蛋白O1；FAK：局部黏着斑激酶；PEG：聚乙二醇
Note: PI3K: Phosphatidylinositol 3-kinase; Akt: Protein kinase B; GSK-3β: Glycogen synthase kinase-3 beta; ERK1/2: Extracellular regulated protein kinases; JNK: c-Jun N-terminal kinase; FoxO1: Forkhead box protein O1; FAK: Focal adhesion kinase; PEG: Polyethylene glycol
Wnt/β-catenin	GO/Fe3O4	纳米粒子	BMSCs	将三氯化铁和氨水化学共沉淀制备的GO/Fe3O4纳米粒子加入细胞悬浮液中，分别培养1、3、5、7、14、21 d	[25]
	GO量子点	悬浮液	乳牙牙髓 干细胞	用超声波分散GO量子点，并在细胞悬浮液中培养 1、3、5、7、14 d	[90]
	β-磷酸三钙/GO	GO：涂层 β-磷酸三钙：三维 支架	BMSCs	细胞被培养在经过水溶液浸泡和热处理制备的GO涂 层上，培养时间分别为1、3、7、14 d	[94]
PI3K/Akt/GSK-3β/β-catenin	GO/PLGA	薄膜	BMSCs	通过丙酮溶液和铸模制备的GO/PLGA薄膜上分别培 养细胞1、3、7、14 d	[95]
MAPK及其亚种（ERK1/2、p38）	GO/锶/胶原蛋白	多孔支架	ADSCs	细胞在经EDC/NHS交联和冷冻干燥处理制备的多孔 支架上分别培养1、3、14 d	[23]
	GO/丝裂霉素甲基丙烯酰	多孔水凝胶	BMSCs	细胞在通过紫外线交联法制备的GO/丝裂霉素甲基丙烯酰多孔水凝胶上培养1 d	[85]
	GO/铜/磷酸钙	GO/铜：涂层 磷酸钙：多孔支架	BMSCs	细胞在由CuSO4和抗坏血酸原位合成的GO/铜涂层 上培养1、3、7、14 d	[86]
	石墨烯/磷酸钙/CS/镁合金	石墨烯纳米片/磷酸钙/CS：多孔涂层	BMSCs	将细胞培养在石墨烯/磷酸钙/CS多孔涂层上，该涂层 是通过电泳沉积法制备，培养时间分别为1、2、8、16、 24 d	[88]
	石墨烯/单壁碳纳米管混合物	纳米粒子	BMSCs	将化学气相沉积法制备的单壁碳纳米管混合纳米粒子 加入细胞悬浮液中，分别培养1、3、7、14 d	[91]
JNK和FoxO1	GO	悬浮液	BMSCs	用超声波分散GO，并在细胞悬浮液中培养1、2、3、7、14 d	[87]
FAK	GO/CS/nHAC	多孔支架	ADSCs	细胞在经EDC/NHS交联并冷冻干燥制备的GO/CS/nHAC多孔支架上培养1、3、5、7、14 d	[89]
	GO/PEG	多孔水凝胶支架	扁桃体间充质 干细胞	细胞在经APS和冷冻干燥耦合制备的GO/PEG多孔水凝胶支架上分别培养1、4、7、14 d	[92]
	GO/PEG-丙烯 酸酯	水凝胶	ADSCs	细胞在通过紫外线交联法制备的GO/丙烯酸酯水凝胶上分别培养1、7、14、21 d	[93]

首先，单独使用GDs和GDs与其他材料结合使用时，促成骨活性的信号通路有所不同，这可能是由于GDs进入基质后表面电荷和基团的变化。其次，复合材料中GDs的含量可能会影响干细胞成骨分化的信号通路。Wu等^[95]在PLGA薄膜中加入适量石墨烯，研究石墨烯诱导的PI3K/Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路对BMSCs成骨分化的影响。结果表明，当石墨烯纳米片浓度增加至0.5 wt.%时，总Akt和磷酸化-Akt的表达上调。然而，当石墨烯纳米片浓度进一步增加至1.0 wt.%时，Akt和磷酸化-Akt的表达量减少。上述结果表明，0.5 wt.% GO-PLGA的成骨诱导效果优于其他石墨烯组。因此，GDs的含量可通过调节相关蛋白表达来影响干细胞成骨分化的信号通路。

最后，GO多孔结构复合材料往往会激活MAPK及其亚种的信号通路。Zhang等^[86]通过原位合成CuSO₄和抗坏血酸制备了GO/铜溶液，并将其涂覆在磷酸钙基底表面，制备GO/铜/磷酸钙复合支架。Western blot分析表明，GO能上调BMSCs中缺氧诱导因子1α的表达，并通过激活ERK1/2信号通路分泌BMP-2。

3.2. GDs促成骨活性的免疫调节机制

在骨修复过程中，免疫细胞是最先与植入物接触并发生反应的细胞。这些细胞通过调节急性炎症，从而释放生长因子，促进MSCs的分化，在骨修复中发挥关键作用。研究表明，IL-4、IL-10和IL-13等炎症细胞因子能够促进成骨，而TNF-α、IL-6和IL-1则起相反作用^[96]；证明GDs可以刺激免疫细胞产生不同反应^[97]。GDs促成骨活性的免疫调节机制主要包括两种方式，一是GDs能够刺激巨噬细胞转化为M1表型，并上调多种促炎症细胞因子表达，从而为骨生成创造良好的免疫微环境，这种免疫微环境能够刺激干细胞分化为成骨细胞；二是GDs能够激活单核细胞，从而增加抑瘤素M的释放，诱导干细胞分化为成骨细胞。

4. GDs与细胞毒性

在骨修复材料中应用GDs仍存在一些问题，包括其潜在细胞毒性和以及可能在体内残留。现总结GDs诱导细胞毒性的机制和相关因素，以及避免或减轻GDs引起细胞毒性的方法，主要包括生物包裹和生物降解。

4.1. GDs引起细胞毒性的主要因素

相关研究表明，GDs可通过消耗线粒体膜电位和增加细胞内ROS来诱导细胞毒性，从而引发细胞凋亡。此外，GDs的潜在细胞毒性与其浓度、大小、形状和功能化程度密切相关。

首先，GDs具有浓度依赖性的细胞毒性^[98]。当溶液中的石墨烯浓度过高时，石墨烯可能会通过在膜上积聚引起高水平氧化应激，导致细胞膜穿透破坏，或者通过石墨烯疏水表面与细胞质基质之间的相互作用降低细胞活力。Pang等^[99]发现当石墨烯浓度在5～10 μg/mL时，其细胞毒性很小；当石墨烯或GO浓度为10 μg/mL时，BMSCs的黏附性和形态保持良好；而当石墨烯浓度超过50 μg/mL时，细胞体积变小，表面分泌物增加，微绒毛延长；当GO浓度超过50 μg/mL时，BMSCs会缩小变形，大部分细胞死亡。表明在相同浓度下，GO对BMSCs的细胞毒性高于石墨烯，可能是由于GO具有更强的吸附能力，可以吸附血清蛋白形成蛋白质包涵体。

其次，GDs的尺寸大小对其细胞毒性有重要影响。Wychowaniec等^[100]使用两种不同尺寸GO片（4.9 μm和151.6 nm）制备了GO纸，体外实验表明，用较小尺寸GO片制备的GO纸具有更高细胞毒性，可能是由于不同尺寸GO片与细胞之间的相互作用机制不同。较大尺寸GO片会先附着于细胞表面，然后膜内陷和伪足扩展进入细胞，而较小尺寸GO片则主要通过内吞作用进入细胞。

第三，GDs的形状也会影响其细胞毒性。Wu等^[101]使用Na₂S作为还原剂制备了rGO，并比较了不同还原度的GO和rGO对原发性骨髓巨噬细胞的细胞毒性。体外评估表明，rGO的细胞毒性高于GO，主要原因是形态从GO的片状变为rGO的多边形卷曲状。因此，rGO比GO更能刺激ROS产生。此外，细胞形态观察表明，GO使巨噬细胞的细胞体积增大，而rGO则使细胞体积变小，可能是因为rGO更容易在细胞质中凝结，对巨噬细胞的细胞毒性更高。

4.2. 避免或减轻细胞毒性的主要方法

如果GDs长期存在于人体内，可能会对人体造成潜在危害。目前，生物包裹和生物降解是避免或减轻GDs引起细胞毒性的主要策略。

随着植入时间推移，GDs可能会被再生骨组织包裹，从而避免或减少其向其他组织或器官的扩散。Zhou等^[102]制备了三维多孔羟基磷灰石/rGO支架，并将其用于修复大鼠6 mm骨缺损。结果表明，rGO植入后6个月被再生骨组织包裹，主要是因为新骨向支架内生长导致基底开裂，GDs暴露从而加速骨再生，最终GDs被新再生骨包裹。另外，动物的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏和胰腺均无明显rGO沉积。上述结果可能与支架的孔径、孔隙率和GDs含量等因素有关。

另一方面，GDs的生物降解主要通过特定酶的作用实现，如髓过氧化物酶和辣根过氧化物酶。这些酶与体内新陈代谢过程中产生的H₂O₂相互作用，H₂O₂在酶的催化下产生强氧化剂次氯酸和反应自由基中间体，从而裂解GDs上的羟基和环氧基，最终形成多孔石墨烯。

此外，GDs表面的官能团会影响其降解速率。Li等^[103]利用PEG和牛血清白蛋白制备了功能化GO，体外实验表明，PEG修饰和牛血清白蛋白功能化的GO都无法被辣根过氧化物酶降解，这可能是因为PEG和牛血清白蛋白阻止了辣根过氧化物酶与GO表面的相互作用。随后，他们用二硫键将GO功能化，形成了GO-SS-PEG，发现GO-SS-PEG在小鼠体内可以被降解，可能是因为GO-SS-PEG与巨噬细胞相互作用，破坏了二硫键，从而促进了酶与GO的接触。

5. 总结与展望

GDs作为骨修复材料，具有优异的机械性能和抗菌性能、良好导电性能、较大比表面积和易于改性等优点（图1）。GDs对复合材料的机械增强作用受其含量影响，呈现先增强后下降的趋势，这与其团聚和拉拔效应有关。GDs的优异导电性不仅能通过低阻抗和高电荷直接提高骨修复材料的导电性，还可以通过改变基质的相结构间接提高导电性，从而改善细胞和组织的骨再生行为。GDs的抗菌作用主要通过物理破坏和化学作用两种机制实现，其抗菌性能受尺寸、形状、浓度和表面修饰等因素影响。此外，功能化修饰提高了GDs的分散性和亲水性，增强了其与活性物质的结合能力，并通过赋予基质更优特性改善细胞黏附、增殖和成骨分化。研究表明，GDs可激活特定信号通路（如MAPK），并通过调节免疫反应刺激成骨。在植入体内后，GDs与免疫细胞作用，诱导促炎细胞因子表达并促进干细胞成骨分化。同时，控制GDs的浓度、大小和形状可降低细胞毒性，而生物降解或生物包裹被认为是减少残留的有效策略。

图 1.

Various characteristics of GDs for bone repair

GDs用于骨修复的各种特性

许多研究证实，GDs在骨修复领域具有广阔应用前景，但在应用于临床之前仍存在一些挑战，包括以下几个方面。首先，研究发现GDs在基质中均匀分散可以显著影响骨修复材料的性能，但这种评价大多是定性的，缺乏统一评价标准。此外，作为多孔结构骨修复材料的主要成分，GDs的层数、含量及功能改性等参数与基质多孔性之间的相互作用尚需深入研究。GDs与基质结合的不同方式（如共价结合与非共价结合）对强化效果的影响，以及处理方法对GDs机械特性的影响，也缺乏系统性研究。

其次，GDs的优异导电性为促进骨再生提供了重要机制，但其与基质界面相互作用对复合材料导电性的影响仍需系统探讨。应研究不同基质或相同基质结合对导电性和成骨行为的影响，并在无外部电场条件下开展体内外研究，明确导电性对骨组织再生的作用机制。基于GDs的压电材料已经展现出通过电信号促进骨再生的潜力，未来需开发更多功能复合材料，如利用GDs将磁刺激或光刺激转化为电信号，进一步增强细胞成骨功能。

第三，在GDs促成骨活性和免疫调节的机制方面，已有研究表明其大小、形状和微结构对特定信号通路的调节具有重要影响。然而，为实现对成骨和免疫调节机制的精准调控，需进一步探讨GDs参数及不同基质复合材料的制备工艺对细胞功能的影响。同时，GDs的潜在细胞毒性仍是应用中的关键挑战。已有研究表明，浓度、大小和形状对细胞毒性的影响显著，但需要借助细胞成像分析系统和冷冻电镜等技术深入分析这些参数对细胞损伤及信号通路的作用机制。此外，目前的动物实验主要集中在大鼠模型，缺乏山羊、犬和猴子等大型动物模型，且缺少6个月以上的慢性毒性研究，包括对生殖和致癌风险的评估。

最后，GDs的生物降解机制也是未来研究的重要方向，需探索酶降解过程中其大小、卷曲和折叠的变化对毒性和炎症的影响，以及其代谢途径（如通过尿液、汗液、粪便排出）。通过深入研究这些领域，将为GDs在临床中的安全应用提供关键数据支持，并加速其从实验室向临床转化的进程。

综上述，GDs在骨修复领域展现了巨大应用潜力，但仍需解决一系列关键问题，以确保其在临床应用中的安全性和有效性。通过进一步研究和技术开发，GDs有望在未来的骨修复中发挥更大作用。

利益冲突　在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点

作者贡献声明　杜志坡、马艺展：资料收集、撰写文章；王存阳：文章修改；张瑞红、李晓明：内容构思、观点形成、结构设计并提出文章修改意见

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（32171345）；河北省自然科学基金资助项目（C2022104003）

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