脂肪干细胞促进创面修复的机制与应用进展

Abstract

创面修复异常所导致的慢性难愈性创面及瘢痕严重损害了患者身体健康, 影响了患者生活质量, 且目前缺乏简单有效、经济的治疗手段。脂肪干细胞（ASC）作为一种拥有多向分化潜能的间充质干细胞, 已经被多项体内、体外研究证实可以通过促上皮化、促血管生成、免疫调节和抗氧化等机制促进创面愈合。ASC及其衍生物已被用于治疗由烧伤、糖尿病和放射性损伤等导致的难愈性创面并取得良好效果, 且其成为创面修复新材料的潜力也得到了证实。该文就ASC促进创面修复的机制和临床应用进行综述, 并对其研究方向与前景进行展望。

深度的、大面积的皮肤软组织损伤一直是创面修复与整形重建外科的一大难题, 我国每年因工业、交通等意外事故需要进行创面治疗的患者达1亿人次, 有持续治疗需求者超过5 000万人次, 其中复杂、难愈性创面患者甚至超过3 000万人次^[1]。难愈性创面不仅严重影响患者身心健康, 也给其家庭和社会带来沉重经济负担。目前临床上常采用的自体皮片/皮瓣转移术受限于供体组织量不足, 而敷料覆盖的方法低效且昂贵, 此外生长因子治疗尚处在探索阶段, 组织工程皮肤也无法完全替代真实皮肤。前述这些手段都显示出各自的局限性, 因此有待探索新的治疗方法。

脂肪干细胞（ASC）因含量丰富、易于获取且具有多向分化潜能, 成为近年来组织修复与再生的理想材料。ASC可以通过促上皮化、促血管生成、免疫调节和抗氧化等机制促进创面的修复, 并被临床应用于治疗多种难愈性创面。本文就ASC促进创面修复的机制及其在治疗多种难愈性创面中的应用进行综述。

1. ASC促进创面修复的机制

ASC是一种来源于脂肪组织的多能干细胞。早在2001年, Zuk等^[2]便观察到单个人源性ASC克隆群的多系分化现象, 证实了ASC具有多能性。ASC主要通过直接分化为特定细胞或分泌各种生物活性因子影响创面愈合。ASC的促创面修复功能有促上皮化、促血管生成、免疫调节和抗氧化等。此外, 由于ASC在创面局部的存活率受限, 目前的研究普遍认为其疗效主要与ASC的分泌作用相关。而由ASC衍生的条件培养基（CM）和分泌的细胞外囊泡（EV）等因富含ASC源性生物活性因子对创面修复具有与ASC相似的效应。

1.1. ASC的促上皮化作用

研究证明, ASC不仅能直接分化为KC来提供创面修复的必要材料, 而且比骨髓间充质干细胞具有更强的促上皮化能力^[3]。此外, ASC还能通过分泌多种细胞因子促进KC的生长。Wiśniewska等^[4]证明ASC来源的分泌因子能作用于体外的真皮KC和Fb。Yu等^[5]观察到ASC通过上调肝细胞生长因子（HGF）的表达, 抑制TNF-α、TGF-β₁和巨噬细胞浸润创面的程度, 从而加速裸鼠难愈性创面的闭合。

此外, 富含ASC源性生物活性因子的ASC-CM和ASC-EV也能通过促进KC的增殖与迁移以加速创面的修复。Riis等^[6]证实ASC-CM可以通过调节KC的增殖和迁移以促进创面上皮化。另一项研究观察到, 采用ASC-EV治疗小鼠全层皮肤缺损后, KC和Fb的增殖与迁移能力显著增强^[7]。Nambu等^[8]使用含ASC的硅胶膜治疗糖尿病小鼠的全层皮肤缺损创面, 结果显示创面的再上皮化及肉芽组织形成能力均较仅使用硅胶膜的对照组显著增强。另有研究测试了ASC对大鼠和猪的烧伤创面的疗效, 结果显示ASC不仅能提高烧伤早期皮肤细胞的增殖速率, 还增强了烧伤后期的皮肤屏障功能和植皮术后皮片的性能, 最终显著改善了烧伤创面的愈合质量^[9-10]。

1.2. ASC的促血管生成作用

血管生成作用在创面愈合早期十分重要, 充足的血供会促进肉芽组织生长和创面及时愈合；血供不足将导致创面愈合过程延长。ASC能通过直接分化为组成血管的内皮细胞和周细胞, 甚至形成血管样结构促进创面血管床的生成并加速创面愈合。此外, ASC也能通过分泌VEGF等细胞因子或释放EV等方式促进血管再生, 组织损伤后的炎症反应会诱导缺氧环境, 而缺氧环境又会促进ASC的分泌作用。一项研究显示, ASC可以通过VEGF-磷脂酶Cγ-胞外信号调节激酶1/2途径促进血管内皮祖细胞的招募和分化, 从而加速糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面的血管化^[11]。另一项治疗后肢缺血裸鼠模型的实验观察到, 联合使用基质血管成分（stromal vascular fraction, SVF）和ASC治疗的裸鼠肢体中VEGFA水平和血管密度较单纯使用SVF显著提升/增加, 这归因于移植物中大量的ASC发挥了分泌作用^[12]。ASC的衍生物也具有相似的作用, 有研究检测到ASC-CM和ASC-EV中含有高水平的VEGF等促血管生成因子, 能显著促进猪和裸鼠缺血部位的血管再生^[13-14]。

血管生成受损是多种创面延迟愈合的主要原因, ASC因此被尝试用于治疗多种模型创面。Deleon等^[15]构建了放射性纤维化的小鼠模型并使用ASC联合脂肪组织进行注射治疗, 结果显示血管闭塞的症状有显著缓解, 软组织血管化程度有所提高。Fujiwara等^[16]则验证了ASC主要通过提高VEGF水平来提升创面床的血流量, 从而促进羊烧伤创面的修复。Zhao等^[17]使用ASC源性外泌体治疗糖尿病小鼠溃疡, 相较于ASC-CM治疗和未进行干预治疗, 血管生成和胶原沉积明显增加, 从而加速创面上皮化进程。

1.3. ASC的免疫调节作用

慢性复杂创面迁延不愈的主要原因之一是机体免疫功能的异常及创面炎症反应的延长。ASC能通过影响免疫细胞或分泌生物活性因子调节机体免疫功能和炎症反应进而促进创面修复。而ASC对免疫细胞的作用主要是通过抑制炎症细胞增殖和促使免疫细胞向抗炎表型转化来实现的。

多项研究证明, 使用ASC能降低炎症细胞在局部创面的浸润程度。ASC不仅能使巨噬细胞向抗炎的M2表型极化, 而且能增加调节性T细胞和调节性B细胞的数量, 并促进Th1/Th2的平衡以维持免疫功能的稳定^[18]。ASC还能通过促进抗炎因子分泌以及抑制促炎因子生成达到抑制炎症的效果。其中, IL-10是一种最重要的抗炎因子, IL-10能增强调节性T细胞的活性并促进其进一步分泌IL-10。研究证实, ASC能通过上调IL-10, 下调IL-1β、TNF-α来缓解多种难愈性创面中的慢性炎症反应, 从而加速创面愈合^{[3, 11]}。

1.4. ASC的抗氧化作用

组织损伤会引起创伤部位缺氧以及活性氧增加, 从而导致组织再生速度减缓和纤维化程度增强。而ASC能通过分泌多种生长因子如HGF、胰岛素样生长因子和血小板源性生长因子, 以抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、血红素氧合酶和内皮型NOS等来拮抗机体的氧化环境^[19]。

ASC的抗氧化特性能改善多种创面模型中的高氧化环境。一项研究显示, 过表达缺氧诱导因子1α的ASC可有效减少糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面中的氧化应激反应和高氧化环境导致的DNA损伤, 增强了细胞疗法的治疗效果^[20]。另一项使用ASC-EV治疗光老化模型小鼠的研究显示, 皮肤中抗氧化酶的表达增加而活性氧水平被抑制, 皮肤炎症和光老化程度被延缓^[21]。

2. ASC促进创面修复的应用

ASC促进创面修复的能力已被多项体内、外实验证实。近年来, 研究者们观察到ASC促创面修复的功能可以通过与材料结合、细胞因子诱导、基因工程和改变培养环境等组织工程方法而得到显著提升^[22], 其中, 与材料结合利用了ASC对细胞外环境的刚度、形态和材料的敏感性；细胞因子诱导则引导了ASC特定的生物学行为。基因工程和环境改变都会影响ASC的存活率以及分泌因子谱的改变。

Capella-Monsonís等^[23]比较了将ASC与3种基于ECM的生物材料支架结合后的疗效, 结果显示3种生物材料都能保留ASC的生物学特性并提升活ASC在创面中的保留率, 加速了裸鼠全层皮肤缺损创面的愈合。Bo等^[24]使用一种光交联水凝胶承载ASC治疗小鼠的全层皮肤缺损, 结果显示该创面的上皮形成能力和血管化速度均增强, 从而促进了创面修复。Azam等^[25]证实, 黄素预处理后的ASC能表现出更强的增殖、迁移和分泌能力, 显著促进了化学烧伤大鼠创面的愈合和上皮化。Ahmadi等^[26]观察到, 经光生物调节预处理的ASC存活率高, 并能促进糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面的闭合。曹涛等^[27]将HGF基因转染至ASC并用于治疗糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面, 其显示出比普通ASC更强的促愈能力。由于ASC及其衍生物具有丰富的来源和强大的可塑性, 研究者们尝试将其应用于治疗多种慢性难愈创面, 如烧伤创面、糖尿病溃疡和放射性纤维化及溃疡等。

2.1. ASC治疗烧伤创面

皮片移植术是目前最常用的创面修复治疗手段, 但仍受限于皮源量的不足。此外, 深度烧伤创面移植皮片的存活率较低, 这也限制了植皮术的应用。ASC能够通过分泌机制或直接分化促进烧伤创面的再上皮化、血管再生并减少瘢痕的形成, 因而成为烧伤创面应用干细胞疗法的理想细胞。

虽然目前学术界仍缺乏使用ASC治疗烧伤创面及烧伤瘢痕的临床研究, 但科学家们进行了较为接近的尝试。Piccolo等^[28]观察了240例患者移植自体脂肪组织治疗包括烧伤在内的的各种类型创面和瘢痕的效果, 结果显示仅有3例糖尿病溃疡患者的创面未能被治愈, 其余患者创面均表现出闭合趋势, 瘢痕挛缩也得到显著缓解, 该研究是目前为止规模较大的观察性研究。然而, 一项纳入8例烧伤儿童通过移植自体脂肪组织治疗烧伤瘢痕的随机对照试验研究显示, 在随访6~12个月期间, 未观察到瘢痕有显著的改善^[29]。一项最新的纳入了100例烧伤患者的随机对照试验显示, 自体脂肪组织移植较传统的外用敷料能更显著地缩短疗程并减少创面对植皮的后续需求, 甚至改善了愈合后瘢痕的质量和挛缩程度, 有力地证明了自体脂肪组织移植疗法的优越性^[30]。此外, 一项进行中的临床研究尝试应用富含ASC的SVF治疗包括烧伤瘢痕在内的瘢痕, 预计于2024年10月完成, 该研究的结果将进一步阐释ASC对于烧伤创面的疗效^[31]。然而, 由于前述研究存在纳入了非烧伤患者、缺乏客观的评价标准以及使用了普通脂肪组织而非单纯ASC等因素, 难以得出ASC是否对烧伤及其预后有影响的准确结论。

2.2. ASC治疗糖尿病溃疡

糖尿病是一种代谢性疾病, 其中19%~34%的患者可并发糖尿病溃疡。糖尿病创面的难愈性主要归因于微血管病变所致的创面供血不足以及机体免疫系统的失调, 而ASC可通过促进血管再生和免疫调节作用治疗糖尿病创面。Lee等^[32]使用自体ASC治疗15例下肢血运障碍患者, 在其中的3例糖尿病溃疡患者中, 有2例症状得到显著改善。类似地, Marino等^[33]将自体ASC注射至10例血运障碍伴有溃疡患者（包含糖尿病患者）的患处, 结果显示溃疡直径和深度较未采用ASC治疗患者有显著缩小。在一项Ⅰ/Ⅱ期临床试验中, Uzun等^[34]使用同种异体来源的ASC局部治疗10例糖尿病足部溃疡患者, 随访期内并未发生不良事件且显示出令人满意的临床效果, 这证明了异体ASC在人体中应用的安全性。另一项Ⅰ/Ⅱ期临床试验首先在5例糖尿病足患者中验证同种异体ASC-水凝胶片应用于人体的安全性, 随后招募59例患者以测试ASC的疗效。结果显示治疗组患者创面的愈合速度和质量都远高于仅使用水凝胶片的对照组, 且无不良反应^[35]。此外, 在一项随机对照试验中, 研究者们使用自体脂肪微片段治疗57例截肢后的糖尿病足部溃疡患者, 6个月后的随访显示, 干预组患者的创面较未使用患者愈合速度更快, 且无不良反应, 这可能与移植物中富含ASC有关, 该研究扩大了自体脂肪移植治疗的适应证^[36]。综合以上研究得出, ASC似乎能够有效促进糖尿病创面的愈合并应用于糖尿病足的多个治疗阶段。但由于上述临床试验纳入的样本量不足和使用的治疗材料未有统一标准, 尚未能得出ASC对糖尿病创面疗效的明确结论。

2.3. ASC治疗放射性纤维化及溃疡

放射治疗是肿瘤学科的一个重要组成部分, 但放射治疗可能引起放射性损伤, 其晚期效应表现为形成放射性纤维化从而影响肢体功能, 或创面长期不愈合进而形成慢性溃疡。

放射性损伤的特点是损伤局部TGF-β₁和胶原蛋白水平的上调。TGF-β₁能促进Fb的增殖与分化, 并促进Fb分泌胶原蛋白加速局部纤维化。而HGF作为一种抗纤维化因子, 被认为能够抑制TGF-β₁的表达^[37]。多项临床前研究显示, ASC能通过抑制TGF-β₁和胶原沉积以及上调HGF以缓解猪和小鼠中的放射性纤维化^[38-39]。虽然ASC用于治疗放射性纤维化的临床试验研究较少, 但已有证据显示自体脂肪组织移植对于人体放射性纤维化的疗效。Rigotti等^[40]对放射治疗后产生纤维化的20例患者进行了脂肪组织移植, 观察到大多数患者病损部位的血管化程度和硬度有显著改善, 纤维化和溃疡得到缓解。Gentilucci等^[41]对60例行放射治疗的乳腺癌患者进行乳房重建, 其中30患者例在假体植入前进行了脂肪移植, 其余患者仅使用假体重建乳房, 随访1年显示前者的皮肤弹性和含水量较后者者更佳, 且放射性损伤发生率显著下降。Karmali等^[42]对119例接受脂肪组织移植以进行肿瘤术后重建的患者进行了研究, 其中大部分患者曾经接受放射治疗, 结果表明脂肪移植可以达到重建效果并显著减少放射治疗后并发症。

ASC也可以改善放射性溃疡的愈合质量。一项临床前研究观察到, 将ASC注射至辐射诱导的小鼠模型的放射性溃疡周边能显著加快其创面的愈合速度, 且受辐射组织的活性得到恢复^[43]。Yu等^[44]对5例患者的放射性溃疡进行富含ASC的SVF移植, 结果显示治疗后的皮肤质地得到改善且疼痛得到缓解, 最终促进了溃疡闭合。

3. ASC在临床转化中的问题

近年来, ASC的采集、分离和注射技术已经得到了较为广泛的研究和标准化, 但将ASC应用于临床仍面临许多问题。供体的年龄、性别、体重指数、健康状况和细胞来源位置的差异都会导致ASC的异质性, 使得细胞质量难以评估。多项研究显示, 肥胖患者来源ASC的促血管生成能力下降, 糖尿病等慢性代谢性疾病患者来源ASC的增殖和分化潜力下降, 而自身免疫病患者来源ASC的免疫调节功能可能受损。不同来源ASC的疗效是否存在差异?部分学者认为来自下腹部的ASC具有较好的干性和活力, 而另一部分学者则认为各部位来源ASC的差异并不显著^[45-48]。关于哪种来源的ASC具有较好的临床应用价值的问题, 目前学界仍未达成广泛共识。因严重的疾病导致难以获取足量自体ASC的患者只能使用体外扩增或异体来源的ASC, 但这是否会影响其疗效?此外, 患者的自身状况也可能影响移植物的存活, 并影响ASC的表型和功能, 这同样影响了临床上对ASC疗效的评价^[49]。目前, 人体干细胞的研究和临床转化需要严格遵循指南, 并经过层层伦理审查, 这也限制了人体干细胞的临床应用。

4. 小结与展望

干细胞疗法、生长因子疗法和组织工程等的发展极大地推动了难愈性创面现代治疗方法的进步。ASC能通过促上皮化、促血管生成、免疫调节和抗氧化等多种机制促进创面的修复, 并被尝试应用于临床试验。虽然由于法规和伦理学的限制, 目前的人体干细胞疗法应用受限, 以至于缺乏足够的临床证据来证实ASC用于难愈性创面的疗效, 但多项临床前研究以及自体脂肪移植的临床试验提示了ASC的巨大潜力。ASC-CM和ASC-EV等衍生物不仅能避免活细胞应用的限制, 还易于存储和运输, 具有巨大的优势和应用前景。此外, 将ASC与组织工程技术结合也能扩大其应用范围。未来, 呼吁能开展更多的ASC及其衍生物的临床前研究, 以及更多移植自体脂肪病例、更长随访期以及不同基础情况的临床研究, 并鼓励对ASC及其衍生物应用前景的探索。相信随着更深入的探索与研究, ASC将为拓展创面修复的治疗手段带来新的希望。

Funding Statement

国家自然科学基金青年科学基金项目（81801932）；广东省基础与应用基础研究基金（2022A 1515011232）

Youth Science Foundation Project of of National Natural Science Foundation of China (81801932); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2022A1515011232)