The role of cytogenetic tests in the diagnosis of malignant hematologic diseases

Abstract

Malignus hematológiai betegségekben a kóros hemopoetikus sejtek kontrollálatlan osztódásáért klonális genetikai eltérések felelősek, melyek lehetnek kromoszómaaberrációk és génmutációk. A klonális eltérések kimutatásának nemcsak diagnosztikai, de prognosztikai és terápiás jelentősége is van. Lehetővé teszik a betegek rizikóalapú differenciált kezelését és célzott (genotípus-specifikus) terápiák alkalmazását. A számbeli és szerkezeti kromoszómaeltérések citogenetikai vizsgálómódszerekkel (kariotipizálás, fluoreszcens in situ hibridizáció – FISH, microarray) azonosíthatók. Krónikus mieloid leukémiában, mielodiszpláziás neopláziában és akut leukémiákban a kromoszómaanalízis kötelező teszt a diagnózis idején. Egyes limfoid kórképekben (krónikus limfocitás leukémia, multiplex mielóma) a kariotipizálás helyett FISH módszerrel történik a szubmikroszkópos eltérések, transzlokációk kimutatása. A nagy érzékenységű új generációs szekvenálási technikák rohamszerű terjedése ellenére a citogenetikai vizsgálatok még mindig elengedhetetlenek a malignus hematológiai betegségek mindennapi diagnosztikájában.

BEVEZETÉS

A malignus hematológiai betegségek patogenezisében szerepet játszó citogenetikai (kromoszómaszintű) és molekuláris genetikai eltérések vizsgálata elengedhetetlen része a klinikai ellátásnak. A betegséget létrehozó kóros sejt (klón) klonális genetikai eltéréseinek kimutatása megerősíti a malignus kórkép diagnózisát. A genetikai eltérések diagnosztikai jelentőségük mellett prognosztikai és terápiás értékkel is bírnak, mivel meghatározzák a betegség kimenetelét, a kezelési stratégiát, lehetőséget biztosítanak genotípus-specifikus (célzott) terápiák alkalmazására és a terápia hatásosságának nyomon követésére is. A World Health Organization (WHO) rendszeres időközönként aktualizálja a malignus betegségek klasszifikációját, a mieloid és limfoid kórképek WHO-osztályozása ma már egyértelműen genetikai alapú, kromoszómaaberrációk és génmutációk megléte definiálja az egyes alcsoportokat (1, 2). A genetikai eltérések prognosztikai besorolását, az egyes klinikai tanulmányok eredményein alapuló következtetéseket a European Leukemia Network (ELN) (https://www.leukemia-net.org), valamint a National Comprehensive Cancer Network (NCCN) (https://www.nccn.org) ajánlásai összegzik. A WHO-osztályozásban szereplő genetikai eltérések száma az ismeretek bővülésével folyamatosan nő, egyre több célzott terápiás lehetőséget biztosítva a betegek számára. Ebből adódóan folyamatosan nő az ezeket azonosító genetikai vizsgálatok jelentősége is a hematológiai malignus betegségek diagnosztikájában. A modern molekuláris genetikai technikák rohamos terjedése ellenére a hagyományos citogenetikai vizsgálómódszerek továbbra is elengedhetetlen elemei a rutin diagnosztikai kivizsgálásnak.

CITOGENETIKAI VIZSGÁLÓMÓDSZEREK

A nagy méretű (Mb), kromoszómaszintű genetikai eltérések kimutatása citogenetikai vizsgálatokkal történik. A citogenetikai vizsgáló eljárás definíció szerint három technikát jelent: hagyományos G-sávos kromoszómaanalízis (kariotipizálás), fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) és microarray (array comparative genomic hybridization, array CGH). A kromoszómaanalízis és a FISH a mindennapi genetikai diagnosztika részét képezik, míg a microarray alkalmazása malignus betegségekben elsősorban tudományos célú. Valamennyi módszernek megvannak az előnyei és korlátjai, ezért az egyes technikák együtt alkalmazva nyújtják a legteljesebb képet a malignus átalakulást eredményező, klinikai jelentőségű kromoszómaeltérésekről.

Hagyományos kromoszómaanalízis

A G-sávos (a kromoszómák Giemsa-festéssel nyert sávos megjelenítése) kromoszómaanalízis adja a legteljesebb képet a kromoszómaaberrációkról. A módszer előnye, hogy a teljes genom vizsgálata révén számbeli (teljes kromoszómavesztés vagy -többlet) és szerkezeti eltérések (pl. transzlokáció, deléció, inverzió) kimutatására egyaránt alkalmas. Emellett lehetőséget teremt egymástól független, eltérő kromoszómaeltéréseket hordozó szubklónok azonosítására, valamint egy klónon belüli klonális evolúció kimutatására. A G-sávos kariotipizálás, mint „gold standard” módszer, bizonyos hematológiai kórképek diagnosztikai kivizsgálásában kötelező elem. A kóros sejtek metafázisú kromoszómáinak analíziséhez a vizsgálati minta in vitro tenyésztése szükséges. Az eljárás sikerességét nagymértékben befolyásolja a vizsgálatra küldött minta, ami hematológiai betegségek esetén a kóros sejteket elegendő mennyiségben tartalmazó csontvelő vagy perifériás vér. Egyes hematológiai kórképekben (pl. multiplex mielóma) a malignus sejtek in vitro körülmények között nem osztódnak, ezáltal a kóros sejtek kariotipizálása nem kivitelezhető. Ilyenkor a FISH módszer nyújt citogenetikai információt a célzottan vizsgált kromoszómarégiók számbeli és/vagy szerkezeti eltéréseiről. Szerzett kromoszómaeltérések kimutatásakor a kariotipizálás során megfelelő számú sejt (lehetőség szerint 20 metafázis) analízise szükséges a kromoszómaaberrációk klonális voltának igazolásához. Amennyiben nincs a preparátumban elegendő számú értékelhető metafázis, célzott FISH vizsgálatok biztosítják az eltérések kimutatását. Ugyanez az eljárásrend azokban az esetekben is, amikor a kariotipizálás korlátozott felbontóképessége (5–10 Mb) miatt a sávtechnikával nem detektálható, ún. szubmikroszkópos eltérések kimutatása a cél (3).

A citogenetikai eredmény közlése interpretatív lelet formájában történik: a kromoszómaeltérések leírása (kariotípus) a legújabb nemzetközi nómenklatúrának (ISCN) megfelelően kerül feltüntetésre a leleten, amit egy szöveges magyarázat követ (4). Ez utóbbinak tartalmaznia kell a talált eltérések klinikai relevanciáját, a feltételezett diagnózissal való egyezést, a WHO-klasszifikációt (amennyiben ez lehetséges) és a prognosztikai besorolást. A leletátfordulási idők (turnaround time, TAT) sürgős indikációban (pl. akut leukémia) 7–10 nap, minden más esetben 21 nap (3).

Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH)

A FISH alkalmazása az 1980-as években terjedt el széles körben a citogenetikai laboratóriumokban. Az eljárás során fluoreszcens festékkel jelölt rövid (100–500 Kb) DNS-próbákat (szondákat) hibridizálnak a vizsgálati minta sejtjeinek DNS-éhez, ezáltal tudják kimutatni a kérdéses genomi régió lokalizációját, delécióját, duplikációját, átrendeződését. A kromoszómák centromerikus régiójához kötődő próbák alkalmasak a számbeli eltérések (pl. monoszómia, triszómia) azonosítására, míg egy specifikus kromoszómarégióhoz/génhez kötődő próbatípus a vizsgált lókusz/gén delécióját/duplikációját, transzlokációban való részvételét tudja kimutatni. A hematológiai malignitásokban gyakori, fúziós gének kialakulásához vezető reciprok transzlokációkat ún. fúziós próbákkal igazoljuk. Amennyiben egy génnek számos transzlokációs partnere lehet és a diagnosztika, prognosztika szempontjából a transzlokáció tényének azonosítása is fontos és elegendő információ, ún. „break-apart” FISH-próbát alkalmazunk. Ezen gyakori próbatípusok mellett léteznek kromoszómakart vagy a teljes kromoszómát egy színnel jelölő próbatípusok is, amelyek leginkább a kromoszomális eredetet vagy kromoszómán belüli eltéréseket tudják kimutatni.

A FISH vizsgálatok nagy előnye a hagyományos kromoszómaanalízishez képest, hogy nemcsak tenyésztett sejtekből származó kromoszómapreparátumon alkalmazhatók, hanem nem osztódó (interfázisú) sejteken is. Emellett segítheti a G-sávozással nehezen beazonosítható eltérések pontosítását metafázisú sejteken. Az interfázisú FISH vizsgálatok megfelelő próbák/próbapanelek használatával, önálló vagy elsővonalbeli genetikai tesztként alkalmazhatók hematológiai malignitások esetén. Ma már a hagyományos kromoszómaanalízis elengedhetetlen kiegészítő módszere a FISH, mivel kiküszöböli a kariotipizálás korlátait. Különösen azokban a malignus betegségekben hasznos, amelyeknél gyors genetikai eredményre van szükség a mielőbbi terápiás beavatkozás miatt. Lényegesen jobb felbontása révén a FISH a választandó technika szubmikroszkópos eltérések kimutatására, olyan fúziós gének, génátrendeződések detektálására, amelyeknél a töréspont nagyon variábilis (pl. IGH), valamint azon gének transzlokációinak azonosítására, amelyeknél a transzlokációs partnerek nagy száma miatt molekuláris módszerek beállítása nem gazdaságos (pl. KMT2A, korábbi nevezéktan szerint MLL gén).

A FISH módszer érzékenysége lényegesen jobb (10×) a citogenetikai vizsgálaténál, mivel több száz interfázisú sejtmag analízisével kis százalékban előforduló szubklonális eltéréseket is biztonsággal azonosít. A FISH technikának is vannak azonban korlátai. A módszer hátránya célzott volta, amely miatt csak egyéb módszerekkel együtt alkalmazva ad teljes képet a malignus hematológiai betegségekben előforduló kromoszómaeltérésekről. Emellett egyszerre csak néhány kromoszómaaberráció vizsgálható a FISH-próbák korlátozott számú jelölése miatt. A rutin diagnosztikában leginkább a kereskedelmi forgalomban kapható próbákat alkalmazzák, amelyek nem fedik le a teljes genomot (5). Leletátfordulási idő az európai ajánlásban csak a gyors FISH-tesztekre van megadva, ezen esetek 95%-ában 3 munkanapon belül (bizonyos esetekben 24 órán belül) javasolt eredményt kiadni (3).

Array komparatív genomi hibridizáció (array CGH)

Ezt a módszert molekuláris kariotipizálásnak is nevezik, hiszen a teljes genom egy lépésben való vizsgálatát teszi lehetővé a hagyományos kromoszómaanalízishez hasonlóan. A lényeges különbség, hogy nem tenyésztett sejtek, hanem a vizsgálati minta sejtjeiből izolált DNS felhasználásával működik, ennélfogva nem képes sejtenkénti genetikai különbségeket azonosítani. A microarray kópiaszám-eltérések (deléció, duplikáció) kimutatására alkalmas a lehető legjobb felbontással (<10 Kb), ami miatt kiváló kiegészítő módszere a citogenetikai analízisnek. Az ún. SNP array platformok a szerzett heterozigótaság-vesztések azonosítása révén képesek a tumorszuppresszor géneket érintő homozigóta eltérések kimutatására is. A microarray magas költsége, nehéz értékelhetősége miatt nem terjedt el a hazai citogenetikai laboratóriumokban a malignus betegségek genetikai diagnosztikájában (6).

Krónikus mieloid leukémia (CML)

A krónikus mieloid leukémia az elsőként felismert malignus megbetegedés, amit egyetlen specifikus genetikai eltérés, a t(9;22)(q34.2;q11.2) transzlokáció hoz létre (1. ÁBRA). A transzlokáció következménye az ún. Philadelphia kromoszóma (Ph), az ezen kialakuló BCR::ABL1 fúziós gén egy onkogén hatású, fokozott tirozinkináz-aktivitású fehérjét eredményez. A CML volt az első olyan malignus kórkép, amelyben a genetikai eltérésre specifikus terápiát, tirozinkináz-inhibitorokat (TKI) alkalmaztak. A TKI-kezelés bevezetése előtt a betegség jellemzően háromfázisú volt (krónikus, akcelerált, blasztos). Napjainkban a rendkívül hatékony terápia és a szoros, genetikai alapú nyomon követés révén a betegség progressziójának incidenciája nagyon lecsökkent, a betegek teljes túlélése 80–90% (7).

1. ÁBRA.

G-sávos kariogram t(9;22)(q34.1;q11.2) transzlokációval. A nyilak a transzlokációban részt vevő 9-es és 22-es kromoszómákat mutatják. A két kromoszóma közötti reciprok transzlokáció eredményeként a 9-es kromoszóma hosszú karja hosszabb lesz a 22-es kromoszómáról oda áthelyeződő világos sávok miatt, míg a partner 22-es kromoszóma rövidebbnek látszik (Philadelphia kromoszóma)

Diagnóziskor a CML-es esetek 90–95%-ában hagyományos citogenetikai analízissel kimutatható a t(9;22)(q34;q11.2) transzlokáció. Az esetek 5–10%-ában variáns t(9;22) transzlokáció látható (több kromoszóma részvételével), vagy sávozással nem, csak molekuláris módszerrel azonosítható, ún. rejtett BCR::ABL1 fúziós gén igazolódik. Az ELN ajánlása szerint a „gold standard”-nek számító kariotipizálást minden CML-es betegnek javasolt elvégezni a diagnózis idején csontvelőmintából vagy perifériás vérből. Interfázis FISH vizsgálatra Ph-negativitás, ritka, atípusos transzlokáció esetén lehet szükség, vagy ha a célzott kezelés mielőbbi elkezdése szükséges. A diagnóziskor végzett citogenetikai analízis célja a t(9;22) transzlokáció kimutatása mellett egyéb kromoszómaeltérések (additional chromosome abnormalities, ACA) vizsgálata. Az ún. magas kockázati csoportba tartozó eltérések (pl. 8-as triszómia, i(17q), +Ph/der(22), 19-es triszómia, −7/7q-, 11q23, 3q26.2, komplex kariotípus) kedvezőtlenebb TKI-válasszal járnak és fokozott rizikót jelentenek a betegség progressziójára. Bár a korábbi ELN-ajánlásokban az ACA figyelmeztető jelként szerepelt, jelenleg rizikófaktorként tartják számon.

A terápia során, az ELN legújabb ajánlásai szerint az érzékeny, standardizált nemzetközi skálán kifejezhető mennyiségi RT-qPCR (real-time quantitative polymerase chain reaction) módszerrel kell a beteget követni. A vizsgálatot javasolt 3 havonta elvégezni annak megítélésére, hogy optimális-e a terápiás válasz, vagy a kezelés módosítására van szükség, mivel a fúziós gén mennyisége nem a megfelelő ütemben vagy mértékben csökkent (terápiás kudarc/rezisztencia). Ritka, atípusos töréspontú transzlokáció esetén, amikor RT-qPCR nem alkalmazható, citogenetikai/FISH vizsgálattal lehet a beteget követni. Terápiás kudarc, tirozinkinázinhibitor-rezisztencia, blasztos fázisba való progresszió esetén citogenetikai vizsgálattal kell keresni a háttérben álló ACA-t (7, 8).

A Ph+ sejtekben kimutatható társuló eltérések klinikai jelentősége eltérő (9). A nyomon követés során elvégzett citogenetikai vizsgálatok a Ph-negatívvá vált sejtekben kialakuló klonális kromoszómaeltérések kimutatására is alkalmasak.

Ezek lehetnek átmenetiek, klinikai jelentőség nélkül, a betegek 2–10%-ában azonban akut leukémia/mielodiszpláziás neoplázia kialakulása is előfordulhat, ezért a Ph-negatív sejtekben megjelenő új, klonális aberrációk folyamatos monitorozása szükséges (10).

Mieloproliferatív neopláziák (MPN)

Az egy vagy több mieloid sejtvonal érintettségével járó krónikus mieloproliferatív kórképek csoportja nagyon heterogén. A WHO 2022-es osztályozása alapján ebbe a kategóriába tartozik a CML, a policitémia vera (PV), esszenciális trombocitémia (ET), primer mielofibrózis (PMF), krónikus neutrofil leukémia (CNL), krónikus eozinofil leukémia (CEL), juvenilis mielomonocitás leukémia (JMML) és a nem specifikálható mieloproliferatív neopláziák (MPN-NOS) (1). Ebben a betegcsoportban a citogenetikai vizsgálatnak elsősorban differenciáldiagnosztikai jelentősége van. A t(9;22) transzlokáció (Ph+) kimutatása révén ugyanis megerősíti a CML diagnózisát és elkülöníti azt a többi, Ph-negatív kórképtől. A Ph-negatív MPN-ek (PV, ET, PMF) esetében a kromoszómaanalízis nem kötelező, a kimutatható klonális kromoszómaeltérések ugyanis nem betegségspecifikusak, a leukemogenezisért elsősorban a JAK2, CALR és MPL génekben bekövetkező driver mutációk lesznek felelősek. Ugyanakkor primer mielofibrózisban a genetikai alapú prognosztikai pontrendszerekben (GIPSS és MIPSS70) kromoszómaeltérések is szerepelnek, ezért a betegek rizikóbesorolásához javasolt a citogenetikai vizsgálat (11, 12). A prognosztikai jelentőség mellett terápiás következménye is van az eltérések azonosításának, hiszen JAK2-pozitív esetekben célzott terápia (JAK2-inhibitor) áll a betegek rendelkezésére (13).

A 2022-es WHO-klasszifikációban a mieloid malignitásokon belül az MPN-ektől elkülönítve kerültek feltüntetésre az eozinofíliával járó mieloid/limfoid neopláziák eozinofíliával és tirozinkináz fúziós génekkel (MLN-eo-TK). Ebben a csoportban (MLN-eo-TK) fúziós gén jelenléte igazolható a diagnózis idején. Az eltérések vizsgálata kromoszómaanalízissel, FISH (ún. break-apart vagy lókuszspecifikus próbák), RT-PCR vagy NGS módszerekkel történhet. Leggyakoribb a FIP1L1-PDGFRA fúziós gén kialakulása, amely egy szubmikroszkópos 4q12 deléció révén jön létre. Ritkábban fordulnak elő a PDGFRB (5q31-33), FGFR1 (8p11) és JAK2 (9p24) gének transzlokációi. Ezeknek a klonális génátrendeződéseknek a kimutatása a diagnózis megerősítése mellett lehetőséget teremt célzott terápiák alkalmazására is: PDFRA/PDGFRB pozitivitás esetén imatinib-, JAK2-fúzió (PCM1-JAK2) kapcsán JAK2-inhibitor- (pl. ruxolitinib, fedratinib, pakritinib, momelotinib), FGFR1-fúziók esetén pemigatinib- (FGFR1/2/3 inhibitor), FLT3-fúzióknál FLT3-inhibitor- (pl. szorafenib, szunitinib, midosztaurin, gilteritinib, kvizartinib), ETV6::ABL1 fúziók esetén nilotinib- vagy daszatinibkezelésben részesülnek a betegek (14).

Mielodiszpláziás neoplázia (MDS)

Az MDS olyan klonális megbetegedés, amely egy vagy több sejtvonal citopéniájával és morfológiai diszpláziájával jellemezhető. A 2022-es WHO-klasszifikációban a mielodiszpláziás neopláziának (korábbi nevén mielodiszpláziás szindrómának) két fő csoportját különítik el: genetikai eltérések által definiált MDS és morfológiailag meghatározott MDS. Az első csoporton belül további három alcsoport különböztethető meg a citogenetikai és molekuláris genetikai eltérések alapján: a) MDS alacsony blasztaránnyal és izolált 5q-delécióval (MDS-5q), b) MDS alacsony blasztaránnyal és SF3B1-mutációval (MDS-SF3B1), c) MDS biallélikus TP53-inaktivációval (gyakran komplex kariotípus része) (MDS-biTP53) (1). Ezeknek az eltéréseknek a vizsgálata kötelező citogenetika és/vagy FISH, valamint molekuláris módszer alkalmazásával minden olyan esetben, amikor az MDS gyanúja fennáll. Hagyományos kromoszómaanalízissel egyéb, MDS-ben gyakori klonális kromoszómaaberráció is kimutatható (pl. 7-es monoszómia, 7q-deléció, 8-as triszómia, 20q-deléció, Y kromoszóma vesztés) az esetek 40–50%-ában (15). Ezek azonosítása nemcsak megerősíti az MDS diagnózisát, de kifejezett prognosztikai jelentőségük miatt lehetővé teszik a betegek eltérő rizikócsoportokba való besorolását a Revised International Prognostic Scoring System (IPSS-R) szerint (16, 17). A legújabb, citogenetikai, molekuláris genetikai és klinikai paramétereket is tartalmazó prognosztikai besorolás (IPSS-M) tovább segíti a betegek differenciálását (18). Az alacsony, intermedier és magas rizikójú betegek differenciált kezelést kapnak, aminek része az 5q-deléció-pozitív esetek specifikus terápiája lenalidomiddal (19).

Krónikus mielomonocitás leukémia (CMML)

A CMML egy olyan klonális hemopoetikus őssejt megbetegedés, amely átfedést mutat az MDS és MPN kórképekkel. Az abszolút leukocitaszám alapján (≥13 G/L) elkülönítenek „mieloproliferatív (MP-CMML)” és „mielodiszpláziás (MDCMML)” formát. A CMML tartós monocitózissal (≥0,5 G/L) jár és meglehetősen nagy rizikóval transzformálódik leukémiába (~15–20% 3–5 év alatt) (20). Klonális kromoszómaeltérések az esetek 20–30%-ában mutathatók ki, ezek nem specifikusak a CMML-re (21). Prognosztikai jelentőségük azonban kifejezett, a 8-as triszómia, 7-es monoszómia/del(7q), komplex/monoszómiás kariotípus kedvezőtlen prognózist jelez, ezért ezek a kromoszómaaberrációk szerepelnek a CMML prognosztikai rendszerében (CPSS-Mol) (22).

Akut mieloid leukémia (AML)

Az AML gyorsan progrediáló malignus megbetegedés, amelynél a hemopoetikus őssejtek citogenetikai és molekuláris genetikai eltérések révén leukémiás őssejtekké alakulnak és klonális expanziót mutatnak a csontvelőben. A differenciálatlan blasztsejtek gyors és kontrollálatlan szaporodása gátolja a normális hemopoézist, ami klinikailag csontvelő-elégtelenségben nyilvánul meg. A krónikus és indolens leukémiákkal ellentétben a kórlefolyás sokszor nagyon gyors, gyakori a terápiarezisztencia, a relapszus, és altípustól függően rövid az eseménymentes és teljes túlélés (23, 24). Mindezek miatt a diagnózis idején elengedhetetlen az AML-es esetek megfelelő klasszifikációja és rizikóbesorolása. A WHO-klasszifikáció, valamint a diagnosztikára, rizikóbesorolásra és betegellátásra vonatkozó legújabb ELN-ajánlás is genetikai alapú (1, 23, 25). A klonális citogenetikai eltérések mellett az elmúlt évtizedben számos új, diagnosztikai és prognosztikai jelentőségű génmutáció került leírásra AML-ben, amelyek célzott terápiák bevezetését is lehetővé tették. Az ELN 2022-es ajánlása szerint az AML diagnózisa idején mind a citogenetikai, mind a molekuláris genetikai vizsgálatok kötelezőek (25). Klonális citogenetikai eltérések az AML-es esetek kb. 50%-ában mutathatók ki, a legerősebb prognosztikai tényezők az indukciós terápiára adott válasz és a túlélés tekintetében (23). A WHO klasszifikációjában az AML-ek két fő csoportba sorolhatók: i) AML meghatározó/visszatérő genetikai eltérésekkel és az ii) AML differenciáció szerint (1. TÁBLÁZAT). Az első csoporton belül az egyes AML-altípusokat definiáló kromoszómaaberrációk olyan transzlokációk, amelyek driver hatású fúziós géneket eredményeznek, ezért ezek vizsgálata citogenetikai, FISH és/vagy molekuláris módszerekkel kötelező. Prognosztikai jelentőségük alapján a kromoszómaeltérések kedvező, intermedier és kedvezőtlen prognózisúak lehetnek (2. TÁBLÁZAT) (1, 25).

1. TÁBLÁZAT.

Az akut mieloid leukémiák 2022-es WHO-klasszifikációja (Khoury JD és mtsai., 2022 alapján; 1)

Akut mieloid leukémia meghatározó genetikai eltérésekkel

Akut promielocitás leukémia PML::RARA fúzióval

Akut mieloid leukémia RUNX1::RUNX1T1 fúzióval

Akut mieloid leukémia CBFB::MYH11 fúzióval

Akut mieloid leukémia DEK::NUP214 fúzióval

Akut mieloid leukémia RBM15::MRTFA fúzióval

Akut mieloid leukémia BCR::ABL1 fúzióval

Akut mieloid leukémia KMT2A-átrendeződéssel

Akut mieloid leukémia MECOM-átrendeződéssel

Akut mieloid leukémia NUP98-átrendeződéssel

Akut mieloid leukémia NPM1-mutációval

Akut mieloid leukémia CEBPA-mutációval

Akut mieloid leukémia, mielodiszpláziával összefüggő

Akut mieloid leukémia egyéb genetikai eltérésekkel

Akut mieloid leukémia, differenciáció szerint

Akut mieloid leukémia minimális differenciálódással

Akut mieloid leukémia érés jelei nélkül

Akut mieloid leukémia érés jeleivel

Akut bazofil leukémia

Akut mielomonocitás leukémia

Akut monocitás leukémia

Akut eritroid leukémia

Akut megakarioblasztos leukémia

2. TÁBLÁZAT.

Az akut mieloid leukémiák genetikai alapú rizikóbesorolása az ELN 2022-es ajánlása szerint (Döhner H és mtsai., 2022 alapján; 25)

RIZIKÓCSOPORT	GENETIKAI ELTÉRÉS
Kedvező	t(8;21)(q22;q22.1)/RUNX1::RUNX1T1 inv(16)(p13.1q22) vagy t(16;16)(p13.1q22)/CBFB::MYH11 NPM1-mutáció FLT3-ITD nélkül bZIP in-frame CEBPA-mutáció
Intermedier	NPM1-mutáció FLT3-ITD mutációval Nem mutált NPM1 FLT3-ITD mutációval (magas rizikójú genetikai eltérések nélkül) t(9;11)(p21.3;q23.3)/MLLT3::KMT2A Citogenetikai és molekuláris genetikai eltérések, amelyek nem kedvező vagy kedvezőtlen prognózisúak
Kedvezőtlen	t(6;9)(p23.3;q34.1)/DEK::NUP214 t(v;11q23.3/KMT2A átrendeződés t(9;22)(q34.1;q11.2)/BCR::ABL1 t(8;16)(p11.2;p13.3)/KAT6A::CREBBP inv(3)(q21.3q26.2) vagy t(3;3)(q21.3;q26.2)/GATA2, MECOM (EVI1) t(3q26.2;v)/MECOM(EVI1) átrendeződés -5 vagy del(5q); -7;-17/abn(17p) komplex kariotípus vagy monoszómiás kariotípus ASXL1-, BCOR-, EZH2-, RUNX1-, SF3B1-, SRSF2-, STAG2-, U2AF1- és/vagy ZRSR2-mutáció

ITD: belső tandem duplikáció

Akut limfoid leukémia (ALL)

Az akut limfoid leukémia a csontvelői B vagy T limfoid progenitorok (B-ALL vagy T-ALL) malignus átalakulása, ellenőrizetlen szaporodása következtében alakul ki. Az ALL leginkább gyermekkorban fordul elő, incidenciája idősebb korban újra enyhén megemelkedik. A B-ALL gyakoribb, a gyermekkori ALL-ek 85%-áért, míg a felnőttkoriak kb. 75%-áért felelős (26). Az ALL genetikailag nagyon heterogén, számbeli és szerkezeti kromoszómaaberrációk, génszintű kópiaszám-eltérések, génmutációk sora jellemzi. A citogenetikai eltérések prognosztikai jelentősége az 1970-es évek óta ismert, molekuláris genetikai eltérésekkel kiegészítve rizikóalapú kezelési stratégiát biztosítanak, aminek köszönhetően mára az 5 éves túlélési adatok kiemelkedőek: 90% (standard rizikó), 83% (intermedier) és 62% (magas/nagyon magas rizikó) (27, 28). Az ALL WHO-klasszifikációját az AML-hez hasonlóan visszatérő genetikai eltérések határozzák meg (2) (3. TÁBLÁZAT). A genetikai eltérések nemcsak egy-egy altípust definiálnak, de kifejezett prognosztikai, prediktív értékkel is bírnak. A számbeli kromoszómaeltérések közül a hiperdiploid (<50 kromoszómaszám) kariotípus (kb. 25%) kedvező prognózissal társul, míg az alacsony hipodiploid (32–39 kromoszómaszám) és közel haploid (24–31 kromoszómaszám) kariotípussal rendelkező betegek a magas rizikójú csoportba sorolhatók.

3. TÁBLÁZAT.

Az akut limfoid leukémiák 2022-es WHO-klasszifikációja (Alaggio R és mtsai., 2022; 2)

PREKURZOR B-SEJTES NEOPLÁZIA

B-sejtes limfoblasztos leukémiák/limfómák

B-limfoblasztos leukémia/limfóma, NOS

B-limfoblasztos leukémia/limfóma, magas hiperdiploid kariotípussal

B-limfoblasztos leukémia/limfóma, hipodiploid kariotípussal

B-limfoblasztos leukémia/limfóma, iAMP21-eltéréssel

B-limfoblasztos leukémia/limfóma, BCR::ABL1 fúzióval

B-limfoblasztos leukémia/limfóma, BCR::ABL1-like tulajdonságokkal

B-limfoblasztos leukémia/limfóma, KMT2A-átrendeződéssel

B-limfoblasztos leukémia/limfóma, ETV6::RUNX1 fúzióval

B-limfoblasztos leukémia/limfóma, ETV6::RUNX1-like tulajdonságokkal

B-limfoblasztos leukémia/limfóma, TCF3::PBX1 fúzióval

B-limfoblasztos leukémia/limfóma, IGH::IL3 fúzióval

B-limfoblasztos leukémia/limfóma, TCF3::HLF fúzióval

B-limfoblasztos leukémia/limfóma, egyéb genetikai eltérésekkel

PREKURZOR T-SEJTES NEOPLÁZIA

T-sejtes limfoblasztos leukémiák/limfómák

T-limfoblasztos leukémia/limfóma, NOS

Korai T-prekurzor limfoblasztos leukémia/limfóma

NOS: not otherwise specified

A szerkezeti aberrációk között leggyakoribb (kb. 25%) a t(12;21) transzlokáció (ETV6::RUNX1 fúziós gén) (2. ÁBRA), ami G-sáv-technikával nem látható (rejtett) és kedvező prognózissal társul, míg a BCR::ABL1 és KMT2A transzlokációra pozitív esetek prognózisa kedvezőtlen (2. ÁBRA) (29, 30, 31). A kromoszómaeltérések jelentős terápiás következménye miatt az ALL diagnózisakor hagyományos kromoszómaanalízis és FISH vizsgálatok végzése kötelező. Mivel a limfoblasztok in vitro tenyésztése gyakran sikertelen, a metafázisú kromoszómák nem megfelelő minőségűek és egyes klinikailag jelentős kromoszómaeltérések kariotipizálással nem azonosíthatók, a citogenetikai vizsgálattal párhuzamosan minden beteg esetében célzott FISH vizsgálatokat is kell végezni az alábbi eltérések azonosítása/kizárása céljából: BCR::ABL1, ETV6::RUNX1, KMT2A- és TCF3-átrendeződés (3). A B-sejtes ALL-ek klasszifikációjában szerepel a BCR::ABL1-like alcsoport (gyermekkori 10–15%, felnőtt 20–25%). Ezeknek az eseteknek a genetikai háttere nagyon heterogén, következményüket tekintve mindegyikben aktiválódnak a kináz- és citokinreceptor-szignalizációs útvonalak (pl. JAK–STAT, ABL1-kináz fúziós gének). Ezen betegcsoport azonosítása egyre nagyobb jelentőségű, mivel kedvezőtlen prognózissal járnak és célzott terápiára adnak lehetőséget (pl. ABL1-tirozinkináz-gátlók, JAK-inhibitorok) (32, 33).

2. ÁBRA.

Interfázisú FISH vizsgálat eredménye. a) t(12;21)(p13;q22) (ETV6::RUNX1) transzlokációra specifikus kétfúziós FISH-próba. Az ETV6 gén (zöld) és a RUNX1 gén (piros) lókuszok közötti reciprok transzlokáció eredményeként a két érintett kromoszómán ún. fúziós szignálok (zöld-piros és piros-zöld) jönnek létre, amelyek egyértelműen igazolják a transzlokáció tényét. Mindkét sejtmag pozitív a transzlokációra, aminek eredményeként 2 fúziós szignál látható a normális ETV6- és RUNX1-lókuszokat jelző zöld és piros szignál mellett. b) KMT2A-génátrendeződésre specifikus ún. „break-apart” FISH-próba. A transzlokációban nem érintett, normális KMT2A gént fúziós szignál (zöld-piros) jelöli, míg a transzlokációban résztvevő KMT2A gén esetében a fúziós szignál szétválik („break apart”) egy különálló zöld és piros szignálra. Mindkét sejtmag pozitív KMT2A-génátrendeződésre

T-sejtes ALL-ben az esetek kb. 50–70%-ában mutatható ki kóros kariotípus. A számbeli kromoszómaeltérések sokkal ritkábbak, mint B-sejtes ALL-ben. Az esetek 35%-ában fordul elő T-sejt-receptor (TCR) génátrendeződés a 7q34 (TCRB) és 14q11 (TCRA/D) lókuszokon, míg a TLX3- és TLX1-eltérések a gyermekkori T-ALL esetek 25% és 5%-ában mutathatók ki (34, 35).

Krónikus limfocitás leukémia (CLL)

A CLL monoklonális B-sejt-szaporulattal járó malignus kórkép, mely leginkább az idősebb életkorban jelentkezik és heterogén klinikai kép jellemzi. Krónikus limfocitás leukémiában a betegek mintegy 80%-ában mutathatók ki kromoszómaeltérések, amelyek nemcsak diagnosztikai szempontból jelentősek, de kifejezett prognosztikai értékkel is bírnak, terápiát meghatározó szerepük is van (36, 37). Ebben a betegcsoportban a tenyésztésen alapuló vizsgálatok a CLL-sejtek alacsony in vitro proliferációs indexe miatt gyakran sikertelenek, de megfelelő mitogének alkalmazásával a kromoszómaanalízis elvégezhető. Annak érdekében, hogy a CLL-es betegeket klinikailag releváns prognosztikai alcsoportokba lehessen besorolni, az International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia (iwCLL) ajánlása szerint az alábbi kromoszómalókuszok célzott FISH vizsgálata javasolt: 11q22 (ATM); 13q14; 17p13 (TP53); 12-es triszómiát kimutató próba (38). A tumorszuppresszor géneket érintő 11q22 (ATM) és 17p13 (TP53) deléciók kedvezőtlen prognosztikai faktorok, míg a 13q-deléció inkább indolens kórlefolyást jelez. Újabb ajánlások felvetik a kariotipizálás szükségességét a rutin diagnosztikában (39, 40, 41). Mivel a TP53 gén delécióját és/vagy mutációját hordozó esetek nem reagálnak jól a hagyományos kemo-immunoterápiára, a European Research Initiative on CLL (ERIC) ajánlása szerint minden terápiás döntéshozatal előtt javasolt a TP53-deléció és TP53-mutációs státusz vizsgálata (42). A 2024-ben megjelent legújabb ajánlás szerint a FISH és NGS vizsgálatokat javasolt a perifériás vérből szeparált mononukleáris vagy CD19-pozitív sejteken végezni (43).

Mielóma multiplex (MM)

A plazmasejtes mielóma a monoklonális plazmasejtek felszaporodásával járó megbetegedés, amely a felnőttkori malignus hematológiai kórképek kb. 2%-áért felelős. Elsősorban az idős korra jellemző (medián életkor 65–70 év), premalignus állapotok, monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) és ún. parázsló (smoldering) mielóma (SMM) előzik meg (44). Genetikailag nagyon heterogén betegség, nagyfokú szubklonális variabilitást mutat. A primer klonális kromoszómaaberrációk már a premalignus állapotokban is kimutathatók, az MM kialakulásához további, szekunder genetikai eltérések szükségesek. A primer kromoszómaeltérések alapján az MM-esetek közel fele hiperdiploid kariotípusú (+5, +7, +9, +11, +13, +15), míg a másik fele az IGH (14q32) gén transzlokációját hordozza (45). A mielómasejtek korlátozott in vitro osztódási képessége miatt a hagyományos kromoszómaanalízis nem része a rutin genetikai kivizsgálásnak MM-ben, emellett a prognosztikailag jelentős kromoszómaaberrációk kariotipizálással nem kimutathatók. Mindezek miatt mielómában az elsővonalbeli diagnosztikai teszt az interfázisú FISH vizsgálat, amelyet a csontvelői plazmasejtek dúsítását (pl. CD138+ mágnesgyöngyös szeparálás) követően kell elvégezni (3). Az International Myeloma Working Group és a European Myeloma Network ajánlásai szerint végzendő tesztek az alábbiak: TP53-deléciós státusz, a t(4;14)(p16;q32) (NSD2::IGH), t(11;14)(q13;q32) (CCND1::IGH), t(14;16)(q32;q23) (MAF::IGH), valamint t(14;20) (q32;q12) (MAFB::IGH) transzlokáció vizsgálata (46, 47). A ploiditás vizsgálatához javasolt az 5, 9, 15-ös kromoszómákra specifikus próbák közül legalább kettő alkalmazása, a hiperdiploid betegcsoport azonosítása céljából. A RISS (Revised International Staging System) besorolása alapján magas rizikójú eltérések a 17p- (TP53) deléció, a t(4;14) és t(14;16) transzlokációk (47).

Limfómák

A limfómák klasszifikációját a hematolimfoid tumorok 2022-es WHO-besorolása tárgyalja részletesen (2). Esetükben a malignus sejtek genetikai eltéréseinek kimutatásához a nyirokcsomó a preferált szövet, a csontvelő vizsgálatára csak abban az esetben van szükség, ha egyéb módszerekkel (morfológia/immunfenotipizálás) igazolták abban a kóros sejtek jelenlétét. Limfómák esetén az immunfenotipizálási és morfológiai analízisek mellett a mindennapi gyakorlatban elsősorban FISH vizsgálatokat végeznek diagnosztikai, prognosztikai vagy terápiás jelentőségű kromoszómaeltérések kimutatása céljából. A limfómák diagnosztikája, prognosztikája szempontjából legjelentősebb és leggyakoribb visszatérő kromoszómaeltéréseket a 4. TÁBLÁZAT tartalmazza (48).

4. TÁBLÁZAT.

Klinikailag jelentős kromoszómaeltérések B- és T-sejtes limfómákban (Sánchez-Beato M és mtsai., 2024; 48)

B-sejtes limfóma	Citogenetikai eltérés	Klinikai jelentőség
Marginális zóna limfóma (MZL) Splenikus MZL Nodális MZL Extranodális MZL	+3, +18, 7q-deléció +3, +18, +7, +12 +3, +18, +12, t(11;18) (BIRC3::MALT1), t(1;14) (BCL10::IGH), t(3;14) (FOXP1::IGH), t(14;18) (MALT1::IGH)	diagnosztikai diagnosztikai diagnosztikai/prognosztikai (m7-FLIPI) /terápiás
Follikuláris limfóma (FL)	t(14;18) (BCL2::IGH)	diagnosztikai
Köpenysejtes limfóma (MCL)	t(11;14) (CCND1::IGH); CCND2- és CCND3-átr., del(17p)	diagnosztikai prognosztikai/terápiás
Diffúz nagy B-sejtes limfóma, másképp nem osztályozott (DLBCL-NOS)	MYC-, BCL2-, BCL6-átr.	diagnosztikai/prognosztikai
Nagy B-sejtes limfóma IRF4-génátrendeződéssel	IRF4-átr.	diagnosztikai
Nagy B-sejtes limfóma 11q-eltéréssel	11q-eltérések	diagnosztikai
Magas grádusú B-sejtes limfóma (HGBCL) HGBCL-DH-BCL2 HGBCL-DH-BCL6	MYC-, BCL2-átr. MYC-, BCL6-átr.	diagnosztikai/prognosztikai diagnosztikai
Burkitt-limfóma (BL) EBV-pozitív BL EBV-negatív BL	MYC-átr., t(8;14)(MYC::IGH), TP53-eltérés MYC-átr., TP53-eltérés	diagnosztikai diagnosztikai
T-sejtes limfóma
Anaplasztikus nagysejtes limfóma (ALCL) ALK-pozitív ALK-negatív	ALK-átr.: pl. t(2;5)(ALK::NPM1) DUSP22-átr., 17p- (TP53-) deléció, TP63-átr.	diagnosztikai diagnosztikai/prognosztikai

A gyakoribb eltéréseket félkövér betűk jelölik; + jel: triszómia; átr.: génátrendeződés

ÖSSZEFOGLALÁS

A kromoszómaeltérések klinikai jelentősége megkérdőjelezhetetlen mind a mieloid, mind a limfoid hematológiai kórképek diagnosztikájában. A klonális kromoszómaaberrációk megerősítik a malignus betegség diagnózisát, prognosztikai jelenőségüknél fogva lehetővé teszik a betegek eltérő rizikójú csoportokba való besorolását, a genetikai eltérésre specifikus terápia révén pedig a hatékony, célzott kezelést. Az évtizedek óta alkalmazott hagyományos kromoszómaanalízis napjainkban is a rutin genetikai kivizsgálás része. A FISH alkalmazása nagy előrelépést jelentett a kromoszómaeltérések gyors és pontos kimutatásában, de célzott volta miatt nem helyettesítheti a teljes genomot vizsgáló kariotipizálást. A nagy felbontású microarray kiválóan azonosítja a szubmikroszkópos deléciókat, duplikációkat, de nem alkalmas a klinikailag nagy jelentőségű transzlokációk (fúziós gének) kimutatására. A rendelkezésünkre álló citogenetikai technikák tehát csak egymással kiegészítve biztosítanak elegendő információt a malignus betegségek genetikai diagnosztikájához. A kariotipizálás kivitelezése, az eredmények értékelése és interpretációja igen nagy tapasztalatot, sokéves tanulási folyamatot igényel. A szakember-utánpótlás egyre nagyobb problémát jelent a citogenetikai laboratóriumokban, szerte a világban. Így számos technológiai fejlesztés van folyamatban (pl. Optical Genome Maping, long-read teljesgenom-szekvenálás), melyek ígéretesek a diagnosztikai módszertani integráció tekintetében.