Abstract
目的
探讨磷酸化HSP27(p-HSP27)对鼻咽癌增殖和转移的影响及其分子机制。
方法
① Western blot检测鼻咽癌CNE1、CNE2细胞中HSP27和p-HSP27的表达水平；抑制HSP27磷酸化，Transwell检测细胞的迁移、侵袭能力。②合成过表达HSP27磷酸化和去磷酸化突变体的鼻咽癌细胞株(CNE2-OE1和CNE2-OE2)，以转染空载体的CNE2细胞(CNE2-NC)为对照：CCK8检测3组细胞的增殖能力，Western blot检测CyclinD1、Bax和Bcl-2的表达水平；Transwell检测细胞的迁移、侵袭能力，Western blot检测E-cadherin、Vimentin、MMP2、MMP9的表达水平。
结果
① HSP27在CNE2中的表达高于CNE1，p-HSP27的表达则相反；抑制HSP27磷酸化以后，CNE1的侵袭、迁移能力显著降低，CNE2无明显变化。②与CNE2-NC比较：CNE2-OE1生长速度降低，CNE2-OE2生长速度加快；CyclinD1在CNE2-OE1中表达下调，在CNE2-OE2中表达较高；CNE2-OE1中Bax的表达升高，Bcl-2的表达降低，两者在CNE2-OE2中的表达无明显变化。③与CNE2-NC比较：CNE2-OE1的迁移能力增强、侵袭能力减弱，CNE2-OE2的迁移能力减弱而侵袭能力增强；E-cadherin在CNE2-OE1中表达减少、在CNE2-OE2中表达增加，Vimentin在3组细胞中的表达差异无统计学意义；MMP2和MMP9在CNE2-OE2中表达上调，在CNE2-OE1中表达略下调。
结论
① HSP27和p-HSP27在不同鼻咽癌细胞中呈差异性表达，鼻咽癌的转移能力不仅与HSP27、也与p-HSP27的表达水平有关。②p-HSP27可抑制CNE2细胞增殖，促进其凋亡。③p-HSP27在鼻咽癌转移的不同环节发挥不同作用，其可增加CNE2细胞的迁移能力、降低其侵袭能力；p-HSP27可能通过下调E-cadherin使CNE2细胞发生EMT改变进而促进CNE2细胞迁移，通过下调MMPs的表达抑制CNE2细胞侵袭。
Keywords: 鼻咽癌, 热休克蛋白27, 磷酸化, 增殖, 转移
Abstract
Objective
To investigate the effect of phosphorylated HSP27 on the proliferation and metastasis of nasopharyngeal carcinoma and its molecular mechanism.
Methods
① Western blot assay was used to detect the expression levels of HSP27 and p-HSP27 in CNE1 and CNE2 cells of nasopharyngeal carcinoma. Inhibited the phosphorylation of HSP27, Transwell assay detected the metastasis ability of nasopharyngeal carcinoma cells. ②Nasopharyngeal carcinoma cell lines(CNE2-OE1 and CNE2-OE2) overexpressing phosphorylated and dephosphorylated mutants of HSP27 were synthesized, empty vector transfected CNE2 cells(CNE2-NC) were used as controls. The proliferation ability of the three groups of cells was detected by CCK8, and the expression levels of CyclinD1, Bax and Bcl-2 were detected by Western blot. Transwell was used to detect the migration and invasion ability of cells, and Western blot was used to detect the expression levels of E-cadherin, Vimentin, MMP2 and MMP9.
Results
The expression level of HSP27 in CNE2 was higher than that of CNE1 cells, while the expression level of p-HSP27 was opposite. After inhibition of HSP27 phosphorylation, the invasion and migration ability of CNE1 cells decreased significantly, with no significant change in CNE2 cells. Compared with CNE2-NC, the growth rate of CNE2-OE1 decreased, and the growth rate of CNE2-OE2 increased. The expression level of CyclinD1 was down-regulated in CNE2-OE1 and higher in CNE2-OE2. The expression level of Bax in CNE2-OE1 was increased, while the expression of Bcl-2 was decreased. There was no significant change in the expression of Bax and Bcl-2 in CNE2-OE2. Compared with CNE2-NC, the migration ability of CNE2-OE1 was enhanced and the invasion ability was weakened, while the migration ability of CNE2-OE2 was weakened and the invasion ability was enhanced. There was no significant difference in the expression levels of E-cadherin was decreased in CNE2-OE1 and increased in CNE2-OE2. There was no significant difference in the expression levels of Vimentin among the three groups. The expression levels of MMP2 and MMP9 were up-regulated in CNE2-OE2, and slightly down-regulated in CNE2-OE1.
Conclusion
HSP27 and p-HSP27 were differentially expressed in different nasopharyngeal carcinoma cells, and the metastasis ability of nasopharyngeal carcinoma was not only related to the expression level of HSP27, but also related to the level of p-HSP27. The p-HSP27 inhibited CNE 2 cell proliferation and promoted their apoptosis. As p-HSP27 plays different roles in different stages of nasopharyngeal carcinoma metastasis, it can increase the migration ability of CNE2 cells and reduce its invasion ability. p-HSP27 may induce EMT changes in CNE2 by down-regulating E-cadherin, thus promoting CNE2 migration, and may inhibit CNE2 invasion by down-regulating MMPs expression.
Keywords: nasopharyngeal carcinoma, HSP27, phosphorylation, proliferation, metastasis
鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一，尤以南方多见，其起病隐匿，早期症状不明显，多数患者确诊时已发展至中晚期。随着综合诊疗技术的运用，鼻咽癌的5年生存率有了明显提升，但仍有30%~40%的患者在治疗后发生局部复发和远处转移[1]。对于复发性鼻咽癌，鼻内镜下手术治疗辅以化疗可改善其预后，但远期疗效仍待观察[2]；转移性鼻咽癌的治疗仍以全身化疗为主，疗效较差。复发和转移是影响鼻咽癌患者预后的重要因素，因此，探索鼻咽癌转移的分子机制，寻找更多有效的分子靶点对改善鼻咽癌患者的预后、提高生存率具有重要意义。热休克蛋白27(HSP27)属于小热休克蛋白(sHSP)家族，其功能受翻译后修饰如磷酸化等的调控，在应激条件下，HSP27的多个丝氨酸残基发生磷酸化，其中Ser15，78和82是最常见的磷酸化位点。HSP27的磷酸化不仅导致其结构改变，其生物学功能也发生相应变化。近年来有研究发现磷酸化HSP27(p-HSP27)与肿瘤的增殖、凋亡、转移和化疗耐药、放疗抵抗等密切相关[3-5]，但其在鼻咽癌增殖、凋亡和转移中的作用尚未见报道。本研究拟观察磷酸化HSP27对鼻咽癌增殖、凋亡和侵袭、迁移能力的影响并探讨其可能的分子机制。
1. 材料与方法
1.1. 主要实验材料
CNE1和CNE2细胞株由中南大学馈赠，293T细胞购自ATCC公司(USA)，HSP27、p-HSP27、MMP9、MMP2、Bax、Bcl-2抗体以及CMPD1等购自美国Cell Signaling Technology公司，E-cadherin、Vimentin抗体以及CyclinD1购自Abcam公司，GV358质粒、AgeI/AgeI内切酶、BCA法蛋白定量试剂盒购自上海吉凯基因化学技术有限公司，Trizol RNA试剂盒购自Invitrogen公司(USA)，CCK8试剂盒购自日本DOJINDO公司。
1.2. 实验方法
1.2.1. 细胞培养
鼻咽癌CNE1和CNE2细胞以及下述转染成功的CNE2细胞用含10%小牛血清的1640培养液常规培养于37℃、5%CO2的恒温培养箱内。
1.2.2. HSP27磷酸化和去磷酸化突变体的构建及转染
HSP27磷酸化和去磷酸化突变体的构建委托上海吉凯基因化学技术有限公司完成。具体为：将HSP27蛋白的3个丝氨酸位点(Ser15、Ser78、Ser82)分别突变为天冬氨酸(模拟磷酸化，3D突变)、丙氨酸(模拟去磷酸化，3A突变)。查询HSP27(NM_001540.3)的编码序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，通过NEBcutter V2.0(http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.phb)检测序列的特异性核酸内切酶位点，设计出HSP27的克隆引物，上游引物为5’-GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG-3’下游引物为5’-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3’。以cDNA为模板，利用PlatnumTaq高保真DNA聚合酶通过PCR扩增得到带相应核酸内切酶位点的HSP27基因的编码序列，并将其接入GV358载体得到重组质粒，转染E.Coli感受态细胞，利用含Puromycin的LB培养液进行阳性克隆筛选并经测序证实。利用磷酸钙沉淀法将重组质粒与包装质粒共同转染至293T细胞中，48 h后收集培养液，过滤、高速离心得到纯化的携带目的基因或空载体的自灭活慢病毒，溶于0.05 mol/L的Tris缓冲液中，-80℃保存备用。继而将CNE2细胞种于12孔板中(5×104/孔)，过夜后转染，转染48 h后荧光显微镜检查转染效率并继续后续实验。实验分3组：PLIG-HSP27磷酸化突变体转染组(3D突变体转染组，CNE2-OE1)、PLIG-HSP27去磷酸化突变体转染组(3A突变体转染组，CNE2-OE2)、对照组(转染空载体，CNE2-NC)。
1.2.3. 细胞增殖(CCK8)实验
取对数生长期的CNE2-OE1、CNE2-OE2、CNE2-NC细胞，PBS漂洗，胰酶消化，吸取10 μL细胞悬液至细胞计数板进行计数、调整细胞密度至1×104个/mL，向96孔板内每孔加入100 μL细胞悬液、培养箱内孵育一段时间后加入含CCK8反应液的培养液，培养1 h后使用酶标仪测定其OD值。
1.2.4. Transwell细胞迁移实验及侵袭实验
迁移实验：分别取对数生长期的CNE1、CNE2细胞及转染的CNE2-OE1、CNE2-OE2、CNE2-NC细胞，PBS漂洗，胰酶消化，吸取10 μL细胞悬液至细胞计数板进行计数、调整细胞密度至2.5×105个/mL，吸取200 μL细胞悬液加入Transwell小室、将小室放入含15%FBS的1640培养液的孔中，放入37℃、5%CO2孵育箱中培养24 h后，吸去小室内液体，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色、漂洗，将小室倒置于载玻片上、盖上盖玻片，每张膜随机取5个视野(×200)、显微镜下观察细胞数并拍照。侵袭实验：选用铺胶的侵袭小室，其余步骤同迁移实验。
1.2.5. Western Blot实验
当CNE1、CNE2细胞及转染的CNE2-OE1、CNE2-OE2、CNE2-NC细胞长至70%~80%密度时，用RIPA蛋白裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取25 μg蛋白上样，经SDS-PAGE凝胶电泳，半干法转移至PVDE膜上，5%脱脂牛奶封闭液封闭2 h、TBST漂洗，一抗4℃冰箱孵育过夜、漂洗，二抗4℃冰箱孵育、漂洗，把PVDE膜放入ECL化学发光液内浸湿，暗室下进行曝光并采集图像，Image J软件统计各条带的灰度值，进行定量分析。
1.3. 统计学处理
所有数据均使用SPSS 26.0软件进行统计分析，计量资料以X±S表示、组间比较用t检验，计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. HSP27和p-HSP27在不同鼻咽癌细胞株中的表达水平
Western blot实验发现：HSP27在鼻咽癌CNE2细胞中的表达水平高于CNE1细胞，而p-HSP27的表达水平以及p-HSP27/HSP27的比值低于CNE1细胞，差异有统计学意义(图 1)。
图 1.
HSP27和p-HSP27在CNE1、CNE2细胞中的表达水平
实验重复3次，1)P＜0.01。
2.2. 抑制HSP27磷酸化对鼻咽癌细胞侵袭、迁移能力的影响
使用MK2抑制剂CMPD1抑制HSP27的磷酸化后，Transwell实验发现：CNE1细胞的侵袭、迁移能力显著下降，而CNE2细胞的侵袭、迁移能力无明显变化(图 2)。
图 2.
抑制HSP27磷酸化后，CNE1和CNE2细胞迁移、侵袭能力的改变
实验重复3次，1)P＜0.01，NS差异无统计学意义。
2.3. 慢病毒质粒转染结果
将包装产生的分别含磷酸化、去磷酸化HSP27的慢病毒颗粒感染CNE2细胞，感染48 h后，在荧光显微镜下观察，发现CNE2-NC(感染空载体的细胞)、CNE2-OE1(HSP27磷酸化细胞)和CNE2-OE2(HSP27去磷酸化细胞)3种细胞均能发出绿色荧光，表明转染成功(图 3)。
图 3.
慢病毒转染荧光图
a：CNE2-NC；b：CNE2-OE1；c：CNE2-OE2。
2.4. HSP27磷酸化对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响
CCK8实验发现：与对照组CNE2-NC细胞比较，HSP27磷酸化的CEN2细胞(CNE2-OE1)生长速度明显降低，HSP27去磷酸化的CNE2细胞(CNE2-OE2)生长速度加快(图 4)。Western blot实验显示：细胞周期蛋白D1(CyclinD1)在CNE2-OE1细胞中的表达下调，而在CNE2-NC和CNE2-OE2细胞中表达量较高(图 5)；CNE2-OE1细胞中凋亡蛋白Bax的表达水平高于CNE2-NC、抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平低于后者，差异均有统计学意义，Bax和Bcl-2在CNE2-NC和CNE2-OE2细胞中的表达水平无明显差异(图 6)。
图 4.
CNE2-NC、CNE2-OE1、CNE2-OE2细胞的增殖能力
实验重复3次，1)P＜0.05，2)P＜0.01。
图 5.
CyclinD1在CNE2-NC、CNE2-OE1、CNE2-OE2细胞中的表达水平
实验重复3次，1)P＜0.05，2)P＜0.01。
图 6.
HSP27磷酸化对Bax和Bcl-2表达量的影响
实验重复3次，1)P＜0.01，NS无统计学意义。
2.5. HSP27磷酸化对鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的影响
Transwell迁移实验显示：CNE2-OE1细胞的迁移能力较CNE2-NC细胞明显增强、差异有统计学意义，CNE2-OE2细胞的迁移能力较后者减弱、但差异无统计学意义(图 7)；侵袭实验显示：CNE2-OE1细胞的侵袭能力较CNE2-NC细胞减弱、CNE2-OE2细胞的侵袭能力较后者明显增强、差异有统计学意义(图 8)。Western blot实验显示：与CNE2-NC细胞比较，E-cadherin在CNE2-OE1细胞中的表达明显减少、在CNE2-OE2细胞中的表达明显增加、差异有统计学意义，Vimentin在3种细胞中的表达无明显差异(图 9)；MMP2和MMP9在CNE2-OE2细胞中的表达明显上调、差异有统计学意义，而在CNE2-OE1细胞中的表达水平下调，但差异无统计学意义(图 10)。
图 7.
HSP27磷酸化对鼻咽癌细胞迁移能力的影响
实验重复3次，1)P＜0.01，NS无统计学意义。
图 8.
HSP27磷酸化对鼻咽癌细胞侵袭能力的影响
实验重复3次，1)P＜0.01。
图 9.
HSP27磷酸化对EMT相关蛋白表达的影响
实验重复3次，1)P＜0.05，2)P＜0.01，NS无统计学意义。
图 10.
HSP27磷酸化对MMPs表达量的影响
实验重复3次，1)P＜0.05，NS无统计学意义。
3. 讨论
鼻咽癌的增殖、凋亡和转移与多种因子有关，既往多数研究表明HSP27在鼻咽癌细胞中高表达，与鼻咽癌的增殖、侵袭和转移能力呈正相关。本课题组前期研究发现HSP27在部分鼻咽癌细胞株中的表达水平并不高，由此猜测鼻咽癌的增殖和转移能力不全依赖于HSP27的表达水平，也可能受HSP27磷酸化状态的影响。HSP27作为sHSP家族的一员在肿瘤中发挥重要作用，参与调控癌细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭以及放化疗抗性等[6-7]。HSP27的功能由翻译后修饰进行调控，主要包括丙酮醛修饰、S-硫醇化、磷酸化等，其中磷酸化是目前研究较广的修饰形式。人HSP27主要在3个丝氨酸位点(Ser15、Ser78、Ser82)发生磷酸化，可由多种蛋白激酶催化，包括MAPK活化蛋白激酶2(MK2)、MAPK活化蛋白激酶3(MK3)、p38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)、蛋白激酶B等，目前MK2被认为是HSP27磷酸化的主要激酶，它可以诱导HSP27ser15，ser78，ser82位点的磷酸化。磷酸化的HSP27由大分子寡聚体解离成小分子聚合物，进而使HSP27的功能发生改变。本实验检测了HSP27与p-HSP27在鼻咽高分化鳞癌细胞株CNE1和低分化鳞癌细胞株CNE2细胞中的表达水平，发现HSP27在CNE2细胞中的表达水平高于CNE1细胞，而p-HSP27的表达水平恰好相反，说明HSP27和p-HSP27在不同分化程度的鼻咽癌细胞中呈差异性表达。使用MK2抑制剂CMPD1抑制CNE1和CNE2细胞中HSP27的磷酸化以后，高表达p-HSP27的CNE1细胞的侵袭和迁移能力显著下降，而低表达p-HSP27的CNE2细胞的侵袭和迁移能力无明显变化，提示鼻咽癌细胞的侵袭、迁移能力不仅与HSP27的表达水平，也与p-HSP27的表达水平有关。
磷酸化HSP27在肿瘤中的作用逐渐受到关注，不同的肿瘤细胞可能拥有多种HSP27磷酸化模式，而p-HSP27在不同肿瘤生长中的作用也不尽相同。在乳腺大汗腺癌、直肠癌、胃癌以及食道癌中，p-HSP27可促进肿瘤细胞的生长[8-11]。在胃癌细胞中，丹参酮ⅡA(TⅡA)的短时诱导使HSP27Ser82位点磷酸化，引起活性氧的产生和未折叠蛋白反应，最终导致肿瘤细胞凋亡[4]。Karademir等[12]研究发现，抑制HSP27的磷酸化可促进卵巢癌细胞的凋亡、抑制其增殖。Neo等[13]报导，HSP27Ser65位点过度磷酸化可诱导肾癌细胞凋亡。在头颈鳞癌中，Ernst等[14]研究发现，使用MK2抑制剂抑制HSP27的磷酸化可抑制头颈鳞癌细胞的增殖和迁移能力，并克服其放疗抗性；Ju等[15]发现，抑制HSP27丝氨酸残基78和82位点的磷酸化，可抑制P38/MAPK信号通路，进而抑制头颈鳞癌细胞的增殖和转移。磷酸化HSP27在鼻咽癌增殖和凋亡中的作用尚未见研究报导。为探索HSP27磷酸化状态在鼻咽癌发展中的作用，本实验构建了HSP27磷酸化和去磷酸化突变体细胞(CNE2-OE1和CNE2-OE2细胞)并检测了其增殖、凋亡能力，结果发现，CNE2-OE1细胞的增殖速度慢于空载体组CNE2-NC，Westernblot实验显示细胞周期蛋白D1(cyclinD1)在CNE2-OE1细胞中的表达也相应减少，提示磷酸化HSP27可抑制鼻咽癌CNE2细胞的增殖；同时，Western blot检测发现CNE2-OE1细胞中凋亡蛋白Bax表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降，表明磷酸化HSP27可促进鼻咽癌CNE2细胞的凋亡。此研究结果与p-HSP27在其他肿瘤增殖、凋亡中的研究结果不尽相同，这种差异可能与肿瘤的异质性以及HSP27的磷酸化位点不同有关。
磷酸化HSP27在肿瘤转移中的作用同样备受关注。研究发现：诱导HSP27磷酸化，可使黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)活化，促进细胞骨架重塑，从而引起肿瘤细胞的转移[16]；HSP27Ser82位点的磷酸化促进了食管鳞癌细胞的增殖、侵袭和迁移[11]；Ke等[17]报道在黑色素瘤细胞中，通过抑制AKT的水平降低HSP27的磷酸化，导致F-actin聚合，从而抑制了肿瘤细胞的迁移；HSP27作为p38/MAPK/APK2通路的下游靶蛋白被磷酸化，参与了乳腺癌、结直肠癌的转移、生长和血管生成[8-9]。在头颈鳞癌中，HSP27介导的生物学效应并不在于其整体表达水平，而是依赖于它的磷酸化水平，抑制HSP27的磷酸化可显著降低肿瘤细胞的迁移能力[14]。磷酸化HSP27在鼻咽癌转移中的作用尚未见报导。本研究用Transwell实验检测HSP27磷酸化突变体细胞CNE2-OE1和去磷酸化突变体细胞CNE2-OE2的迁移和侵袭能力，结果显示CNE2-OE1细胞的迁移能力增强而侵袭能力减弱，CNE2-OE2细胞的变化趋势刚好相反，提示磷酸化HSP27可促进鼻咽癌CNE2细胞的迁移能力，但对其侵袭能力却有抑制作用。目前，虽然多数研究认为磷酸化HSP27与肿瘤的侵袭能力呈正相关[8-9, 11, 18]，但也有少数研究报导磷酸化HSP27与肿瘤的侵袭能力呈负相关或者无关[19-20]，可见p-HSP27在肿瘤侵袭中发挥何种作用与肿瘤的类型有关。
侵袭和迁移是肿瘤转移中的2个相互延续的环节，但有其不同的分子机制。上皮间质转化(EMT)在肿瘤包括鼻咽癌的迁移中扮演着重要角色，其主要以E-钙黏蛋白(E-cadherin)等上皮细胞表型的丢失和波形蛋白(Vimentin)等间充质细胞表型的获得为特征。本研究用Western blot实验检测了HSP27磷酸化突变体细胞CNE2-OE1和HSP27去磷酸化突变体细胞CNE2-OE2中EMT相关蛋白表达量的变化，结果显示，E-cadherin在CNE2-OE1细胞中表达下调，在CNE2-OE2细胞中表达增加，而Vimentin的表达水平在CNE2-OE1细胞中略有上升但差异无统计学意义，提示磷酸化的HSP27可通过下调E-cadherin而促进CNE2细胞发生EMT改变，进而促进CNE2细胞的迁移能力。细胞外基质的降解是肿瘤侵袭的关键环节，基质金属蛋白酶家族(MMPs)是降解细胞外基质的主要酶群，MMP2和MMP9是最常见的失调蛋白酶亚型，在促进肿瘤侵袭中发挥重要作用。本研究发现CNE2-OE1细胞的侵袭能力明显低于CNE2-OE2细胞，Western blot实验发现MMP2和MMP9在CNE2-OE1细胞中的表达水平下调，而在CNE2-OE2细胞中的表达明显升高，提示磷酸化HSP27可通过降低MMP2和MMP9的表达抑制鼻咽癌CNE2细胞的侵袭。同时，上述研究结果提示：p-HSP27在鼻咽癌转移的侵袭和迁移环节中可能发挥着不同的作用。
综上所述，本研究发现p-HSP27在鼻咽高分化鳞癌细胞株中的表达水平高于低分化鳞癌细胞株，鼻咽癌的转移能力不完全依赖于HSP27的总体表达水平，也与HSP27的磷酸化状态有关；p-HSP27可抑制鼻咽癌细胞的增殖、促进其凋亡；p-HSP27在鼻咽癌转移的不同环节中可能扮演着不同角色，其可以增强鼻咽癌细胞的迁移能力、降低其侵袭能力。p-HSP27可能通过下调E-cadherin促进CNE2细胞发生EMT改变，进而促进CNE2细胞迁移，同时可通过抑制MMP2和MMP9的表达，抑制CNE2细胞的侵袭能力。本研究尚缺乏体内实验佐证，且构建HSP27磷酸化位点的形式过于单一，HSP27不同位点磷酸化，单位点磷酸化和多位点磷酸化对鼻咽癌细胞增殖、凋亡和转移能力的影响可能不尽相同，尚待进一步研究。
Funding Statement
云南省科技厅-昆明医科大学联合专项(No：202101AY070001-174)
Footnotes
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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