Abstract
目的
制备可溶性微针贴片装载鱼腥草素钠合并红霉素，进行表征分析并探究其协同抗痤疮作用及机制。
方法
采用两步离心法制备鱼腥草素钠合并红霉素微针贴片（SH+ERY-MN)，通过扫描电镜、穿刺试验等方法检测微针的形态、皮肤穿刺性能等，用棋盘法研究其联合抗菌作用，用qPCR和ELISA评价SH+ERY-MN体外抗炎效果，通过动物模型考察SH+ERY-MN对小鼠痤疮的治疗作用。
结果
所制备的微针贴片具有整齐排列、优良针型和较好的力学性能，能够有效穿透皮肤至浅表真皮层。红霉素对痤疮的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）为1.28 mg/mL。联用鱼腥草素钠后，测定得分级抑菌浓度（fractional inhibitory concentration, FIC）为 0.375，说明联合抗菌具有协同作用。特别是ERY联用时的MIC值是其单用时的1/4。体外qPCR实验结果显示，SH+ERY-MN可下调细胞培养上清液中痤疮丙酸杆菌诱导的白细胞介素（interleukin, IL）-1β、IL-18、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）、核因子κB抑制蛋白（inhibitor of κB, I-κB）、Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）、核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3（NLR family pyrin domain containing 3, NLRP3）和Caspase-1的产生（P<0.05）。体内结果显示，SH+ERY-MN具有明显的抗痤疮作用，有效缓解了细胞因子炎症反应。qPCR和ELISA结果显示SH+ERY-MN能有效降低小鼠痤疮炎症模型血清中IL-1β、IL-18、NLRP3、Caspase-1的水平（P<0.01），具有良好的抗菌和抗炎效果。
结论
成功制备了鱼腥草素钠合并红霉素微针贴片（SH+ERY-MN），具有明显的抗痤疮效果，促进了鱼腥草素钠合并红霉素的透皮递送，为其在痤疮治疗提供了一种创新型方法，为实现有效药物递送和提高治疗效果提供了新的可能性。
Keywords: 微针, 痤疮, 鱼腥草素钠, 红霉素, 协同作用
Abstract
Objective
To prepare a dissolvable microneedle (MN) patch loaded with sodium houttuyfonate (SH) combined with erythromycin (ERY) (SH + ERY-MN patch), to characterize its properties, and to investigate its synergistic anti-acne effects and the mechanisms involved.
Methods
The SH + ERY-MN patch was prepared by two-step centrifugation. The morphology and skin puncture performance of the microneedles were evaluated using scanning electron microscopy, puncture tests, and other methods. The combined antibacterial effect was assessed using the checkerboard assay. The in vitro anti-inflammatory effect of the SH + ERY-MN patch was evaluated by quantitative PCR (qPCR) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The therapeutic effect of the SH + ERY-MN patch on acnes in mice was investigated using an animal model.
Results
The microneedle patch prepared in the study had well-aligned microneedles, excellent needle shape, and good mechanical properties, which could effectively penetrate the skin to reach the superficial dermis. The minimum inhibitory concentration (MIC) of ERY against acne was 1.28 mg/mL. When ERY was combined with SH, the results showed that the fractional inhibitory concentration (FIC) was 0.375, indicating that the medication combination had a synergistic antibacterial effect. In particular, the MIC value of ERY in combination was 1/4 of that of ERY used alone. The results of in vitro qPCR showed that SH + ERY-MN could downregulate the production of interleukin (IL)-1β, IL-18, tumor necrosis factor α (TNF-α), inhibitor of κB (I-κB), Toll-like receptor 4 (TLR4), NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3), and cysteine-aspartic proteases (Caspase-1) induced by Propionibacterium acnes (PA) in cell culture supernatant (P < 0.05). According to the in vivo findings, SH + ERY-MN had a significant anti-acne effect and effectively alleviated cytokine-mediated inflammatory responses. The results of qPCR and ELISA showed that SH + ERY-MN could effectively reduce the levels of IL-1β, IL-18, NLRP3, and Caspase-1 in the serum of the mouse acne inflammation model (P < 0.01), and had good antibacterial and anti-inflammatory effects.
Conclusion
SH + ERY-MN patch was successfully prepared and demonstrated obvious anti-acne effects. The SH + ERY-MN patch enhances the transdermal delivery of SH combined with ERY. It provides an innovative method for acne treatment and creates new possibilities for achieving effective drug delivery and improving therapeutic efficacy.
Keywords: Microneedle, Acne, Sodium houttuyfonate, Erythromycin, Synergistic
鱼腥草酸钠（sodium houttuyfonate, SH）是一种从传统中草药中提取的著名活性成分，具有广谱抗菌和抗炎作用[1]。科学研究已经提供了SH有效抑制细菌生长的证据，包括葡萄球菌和表皮葡萄球菌等菌株[2]。红霉素（erythromycin, ERY）是一种大环内酯类抗生素，由于其对痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acne, P. acne）的抑菌活性，临床上主要用于治疗轻、中度炎症性寻常痤疮。然而随着抗生素的滥用，关于痤疮丙酸杆菌对ERY耐药的报道越来越多，针对细菌耐药性不断增加，可以通过将抗生素与其他药物联合治疗痤疮，以减少细菌耐药性的产生。微针[3]（microneedle, MN）是由一系列针状突起组成的系统，由亲水性聚合物制成，具备可溶解的特性，且具有较好的溶解性，插入皮肤后能够吸收皮肤组织液，从而快速溶解，释放MNs中包封的药物[4]，提高患者的顺应性。长度在25～1000 μm[5]的微针能够物理地破坏角质层，能够以无痛、微创的方式通过皮肤，增加患者的用药依从性[6]。因此，本项研究的目的是制备含鱼腥草素钠合并红霉素的可溶解微针贴片（SH+ERY-MN），旨在实现这两种药物的有效经皮递送，并对其微针的形态学特征、皮肤穿透能力以及体外经皮递药效果进行全面评估，并利用小鼠痤疮炎症模型探究其治疗效果，为SH和ERY的剂型改良和临床应用提供新视角。
1. 材料与方法
1.1. 实验仪器
Synergy H1酶标仪：美国BioTek公司；ASP200S组织脱水机：德国Leica公司；Arcadia H组织包埋机：德国Leica公司；RM2235切片机：德国Leica公司；HI 1210摊片机：德国Leica公司；CKX31SF显微镜：日本Olympus公司；CFX Connect实时荧光定量 PCR 仪：美国Bio-Rad公司；Galaxy 170S CO2培养箱：德国New Brunswick公司。
1.2. 实验试剂
鱼腥草素钠购自于成都植标化纯生物技术有限公司；壳聚糖和透明质酸购自上海麦克林生化有限公司；红霉素（erythromycin, ERY）购自马应龙药业集团有限公司；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）、白细胞介素（interleukin, IL）-1β、IL-18、Caspase-1、核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3（NLR family pyrin domain containing 3, NLRP3）ELISA试剂盒均购于北京安迪华泰科技有限公司；HE染液购自南京建成生物工程研究所有限公司。
1.3. 菌和动物
痤疮丙酸杆菌（ATCC1969）来源于广东省微生物菌种保藏中心。SPF级BALB/c小鼠购于广东省医学实验动物中心，动物使用许可证SYXK（粤）2017-0125。动物饲养于广东药科大学 SPF级环境中，自由进食和饮水，12 h明暗循环的环境，本研究获得广东药科大学实验动物伦理委员会批准，批准号gdpulacspf2017704。
1.4. 鱼腥草素钠和红霉素对痤疮丙酸杆菌的MIC和MBC测定
最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）测定：先后在96孔板加菌液和药液，空白培养基做阴性对照，不加药液做阳性对照，以完全抑制细菌生长的最小药物浓度为该药的MIC值。最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）测定：从测定MIC的孔以及随后4个稀释度孔中各取100 μL细菌培养液，使用无菌涂布器在琼脂平板上均匀涂布。将平板倒置并放入37 ℃的恒温培养箱中进行过夜培养。痤疮丙酸杆菌需在厌氧条件下培养。第2天，选取菌落数量不超过5的最低药物浓度作为该药物的MBC。每个实验需进行3次重复。
1.5. 红霉素与鱼腥草素钠协同作用测定
基于单独使用SH（药物A）或ERY（药物B）对痤疮丙酸杆菌所测定的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，通过棋盘法实验来确定两种药物的分级抑菌浓度（fractional inhibitory concentration, FIC）。96孔板先后加入菌液和药液AB，37 ℃恒温培养箱中培养24 h，计算FIC[7]。FIC < 0.5说明联合抗菌具有协同作用。
1.6. 鱼腥草素钠合并红霉素微针的制备与表征
采用离心法制备MN贴片[8]。将7.5 g的SH溶解在100 mL蒸馏水中，同时在60 ℃下加入甘油（10%）和吐温80（0.1%），直至完全溶解。将ERY溶解在蒸馏水中，质量分数为30%。随后，将SH、ERY两种溶液分别缓慢加入羧甲基壳聚糖，在80 ℃下反应24 h。将上述溶液向PDMS模具中加入50 μL，在4 ℃下以3000 r/min离心15 min，然后将微针模具旋转180°，在4 ℃下以3000 r/min离心15 min，使微针溶液充分进入微针模具中，形成MNs的针头；将模具表面多余的微针溶液擦去，然后加入30 μL 10%的透明质酸（hyaluuronic acid, HA），4 ℃ 4000 r/min离心15 min，形成MNs的基底，最后，将模具取出置于烘箱中烘干至MNs与微针模具分离，干燥后取出MN。
1.6.1. 微针形态表征
按照上述步骤制备MNs，通过扫描电镜（SEM）对微针进行表征。
1.6.2. 微针的FTIR测试
使用傅立叶红外光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）在400～4000 cm－1对鱼腥草素钠合并红霉素微针（SH+ERY-MN）进行红外光谱分析。
1.6.3. 微针的机械性能
使用万能试验机评估MNs的机械性能。将制备好的MNs（针轴无弯曲、破裂，背衬光滑平整）放置在金属铝板上，针尖朝上。然后使用探针施加轴向力以0.5 mm/min的速度压缩MNs，记录MNs的力-位移曲线。
1.6.4. 微针皮肤的穿透力
使用猪皮模型检验MNs是否具有足够的机械强度。将含有FITC的MNs通过压缩力以20 N的力推入猪皮肤，持续5 s。取下微针后，去除多余的荧光染料，用紫外光检查穿透角质层的迹象（绿点）。
1.7. 鱼腥草素钠合并红霉素微针的体外抗炎作用
1.7.1. 细胞痤疮炎症模型构建
①制备灭活的痤疮丙酸杆菌：收集菌液，4 ℃下以4000 r/min转速离心20 min。去除上清液，用PBS洗涤3次，最后用PBS调整菌液浓度为108 CFU/mL，80 ℃水浴30 min灭活。②RAW264.7细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基中进行培养，37 ℃的恒温培养箱中，体积分数5%CO2的环境下进行培养。用含有MN的新鲜培养基替换DMEM培养基，然后将灭活的108 CFU/mL痤疮丙酸杆菌加入6孔板中。放入细胞培养箱中培养24 h，ELISA、qPCR测定相关因子的表达。
1.7.2. qPCR 法检测细胞上清中IL-1β、IL-18、NLRP3和Caspase-1等相关基因的表达
吸取上述6孔板上清，用PBS清洗细胞，每孔加入1 mL RNAiso-plus，室温静置1 min，将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸至无沉淀，室温静置5 min，然后按照Trizol法提取细胞总RNA，并按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser for qPCR说明书进行RNA逆转录，后采用SYBR Premix Ex TaqTM试剂进行实时荧光定量PCR扩增反应。引物序列如表1所示。采用2–ΔΔCt法进行相对定量分析。
表 1. Primer design.
引物设计
| Gene name | Primer sequences (5' to 3') | Product length/bp |
| GAPDH: glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; IL-1β: interleukin-1 beta; IL-18: interleukin-18; Caspase-1: cysteine-aspartic proteases; NLRP3: NLR family pyrin domain containing 3; TNF-α: tumor necrosis factor alpha; TLR4: Toll-like receptor 4; I-κB: inhibitor of κB. | ||
| GAPDH | F: CAGCCTTCCTTCTTGGGTAT | 106 |
| R: CTGTGTTGGCATAGAGGTCTT | ||
| IL-1β | F: TGTGTTTTCCTCCTTGCCTCTGAT | 105 |
| R: TGCTGCCTAATGTCCCCTTGAAT | ||
| IL-18 | F: GCTGTGACCCTCTCTGTGAA | 158 |
| R: TCCATCTTGTTGTGTCCTGGA | ||
| Caspase-1 | F: TGTCAGGGGCTCACTTTTCA | 164 |
| R: AACGTTTTGTCAGGGTCACC | ||
| NLRP3 | F: GTCTGGAAGAACAGGCAACAT | 144 |
| R: AGAACTGTCATAGGGTCAAAACG | ||
| TNF-α | F: AAGTCAACCTCCTCTCTGCC | 191 |
| R: TCCAAAGTAGACCTGCCCG | ||
| TLR4 | F: GCCCTACCAAGTCTCAGCTA | 165 |
| R: CTGCAGCTCTTCTAGACCCA | ||
| I-κB | F: GAGCCGACCTCAATAAACCG | 324 |
| R: TGCGACTGTGAACCACGATG | ||
1.7.3. ELISA检测细胞上清中炎症因子的含量测定
取造模成功后的细胞培养上清进行实验，根据制造商说明使用酶联免疫（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒测定IL-1β、IL-18、Caspase-1、TNF-α和NLRP3的含量。
1.8. 鱼腥草素钠合并红霉素微针的体内抗炎作用
1.8.1. 动物模型构建
在厌氧 37 ℃下培养痤疮丙酸杆菌，离心收集细菌（3000×g，4 ℃ 10 min）。然后用PBS悬浮细菌颗粒清洗细菌，并在3000×g，4 ℃下离心10 min。PBS重悬细菌浓度达到109 CFU/mL。提前1 d将小鼠背部毛剃除。选取BALB/c小鼠，分为7组，6只/组。将小鼠分为正常组、模型组、MN组、SH-MN组、ERY-MN组、SH+ERY-MN组和ERY组。正常组为对照组，其余各组皮下注射20 μL 109 CFU/μL痤疮丙酸杆菌。模型组不给药，而MN组、SH-MN组、ERY-MN组、SH+ERY-MN组和ERY组分别经皮给药（MN贴片、SH-MN贴片、ERY-MN贴片、SH+ERY-MN贴片和1%ERY乳膏）。
1.8.2. HE染色
给药后第7天取材，采用HE染色观察皮肤组织的病理变化。将小鼠皮肤表面毛发剔除，取痤疮生长部位用于组织包埋。将皮肤样本浸泡在体积分数为4%的多聚甲醛溶液中进行固定。随后，对组织样本进行脱钙处理，接着利用逐级升高浓度的乙醇进行脱水。脱水后的组织被包埋在石蜡中，以便于切片。切片完成后，进行脱蜡处理。根据HE染色试剂盒说明书染色，在显微镜下观察皮肤组织并拍照。
1.8.3. qPCR检测皮肤组织相关炎症因子mRNA水平的变化
称取40 mg皮肤中，置于冰上用电动匀浆器充分匀浆后静置5 min，12000 r/min 4 ℃离心5 min，吸取上清至另一个高压灭菌后的RNase-free EP管中。然后按照 Trizol法提取皮肤组织总RNA，采用微量分光光度计测定 RNA浓度。剩余步骤按1.7.2步骤进行。最后采用2−ΔΔCt计算处理数据。
1.8.4. ELISA检测小鼠血清中炎症因子的变化
动物模型构建成功后，于给药后第7天取材，将小鼠麻醉后取血，离心收集上清，根据制造商说明使用ELISA试剂盒测定IL-1β、IL-18、Caspase-1和NLRP3的含量。
1.9. 统计学方法
使用GraphPad Prism 9.0统计学软件进行数据分析，定量数据均使用
进行描述，各种实验组间的多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）进行分析，进一步组间两两比较使用SNK法、Tukey's检验、Dunnett's检验等方法，P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 鱼腥草素钠和红霉素对痤疮丙酸杆菌的MIC和MBC
根据MIC和MBC实验结果得出，SH对P. acne的MIC为0.16 mg/mL，MBC为0.32 mg/mL；ERY对痤疮丙酸杆菌的MIC和MBC均为1.28 mg/mL。
2.2. 鱼腥草素钠和红霉素对痤疮丙酸杆菌的联用抗菌效果
SH和ERY联用后，依据FIC指数的计算方法，得出FIC指数为0.375，由于FIC指数小于0.5，表明SH和ERY之间存在协同抗菌效果。在联合用药的情况下，ERY的MIC降低至其单独使用时的1/4。
2.3. 鱼腥草素钠合并红霉素微针表征
2.3.1. 形态学
观察 MNs 外观形态。结果如图1A所示：所制备的微针贴片由圆锥形的微针和基底层构成，排列成10×10的阵列，阵列整齐，基底层均匀无气泡。微针的形状设计优良，高度为600 μm，底部直径为300 μm，微针之间的间距设定为600 μm。
图 1.
The appearance of the microneedles (A), FITR of the SH + ERY-MN patch (B), and results of the microneedle puncture experiment and the mechanical properties of microneedles (C)
微针外观图（A）、SH+ERY-MN的FTIR图（B）和微针穿刺实验结果图和微针机械性能（C）
2.3.2. FITR
由图1B可以看出，NOCC席夫碱的红外谱图中，1640 cm－1处为C=N的伸缩振动峰，1100 cm－1处为C-O的伸缩振动峰。与NOCC的红外谱图相比，ERY-MN和SH+ERY-MN的红外谱图中增加了C=N基团1640 cm－1，1083 cm－1处的单峰变化为1100 cm－1的单峰。通过这些峰值的变化可以判断NOCC与醛基发生了反应，生成了羧甲基壳聚糖席夫碱。
2.3.3. 微针的皮肤穿透特性
MNs的力学性能是成功皮肤插入的基础。为此，评估微针所能承受的最大压缩力。如图1C结果显示，每根针可以承受超过0.3 N的压力，足以实现成功皮肤穿刺。进一步在猪皮肤模型中测试了MN穿刺皮肤的能力。图1C为在猪皮肤上应用微针后约5 s后，在猪皮肤上可以看到完整的绿色斑点，这表明MNs已成功插入皮肤。
2.4. 鱼腥草素钠合并红霉素微针的抗菌作用
图2A显示，pH5.0和pH7.4的条件下P. acne的生长曲线基本一致，但是在pH5.0的条件下微针原液的抑菌效果比pH7.4的条件下的抑菌效果好，说明微针原液具有pH响应性，且在pH5.0的条件下，SH+ERY-MN的抗菌效果比SH-MN和ERY-MN的抗菌效果更好。并且SH+ERY-MN在24 h内能够杀灭部分细菌，使菌液浓度在24 h内保持在较低的水平。表明SH+ERY-MN的抑菌效果比SH-MN和ERY-MN的抗菌效果好。
图 2.
The antibacterial effects of SH + ERY-MN (A) and the relative mRNA levels of IL-1β (B), IL-18 (C), TNF-α (D), I-κB (E), Toll-like receptor 4 (TLR4) (F), Caspase-1 (G), and NLRP3 (H) in cells
SH+ERY-MN的抗菌作用（A）和细胞中IL-1β（B）、IL-18（C）、TNF-α（D）、I-κB（E）、Toll样受体4（TLR4）（F）、Caspase-1（G）和NLRP3（H）的mRNA相对表达量
* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, vs. model group. # P < 0.05, ## P < 0.01, ### P < 0.001, vs. SH + ERY-MN group. n = 3 per proup.
2.5. 鱼腥草素钠合并红霉素微针的体外抗炎作用
2.5.1. qPCR法检测细胞上清中相关基因的表达
图2B～2H的qRT-PCR结果表明，SH-MN组、ERY-MN组和SH+ERY-MN组RAW264.7细胞中的炎症因子的基因水平大体上低于Model组（P<0.05）。与SH-MN组、ERY-MN组相比，SH+ERY-MN组的效果较好。
2.5.2. 检测细胞中IL-1β、IL-18、NLRP3和Caspase-1蛋白含量测定
表2结果与qRT-PCR结果基本一致。与SH-MN组和ERY-MN组相比，SH+ERY-MN组能较好的抑制P. acne诱导的IL-1β、IL-18、Caspase-1和NLRP3的炎症因子表达。
表 2. The content of IL-1β, IL-18, Caspase-1, and NLRP3 in cell supernatant.
细胞上清中IL-1β、IL-18、Caspase-1和NLRP3蛋白的含量
| Group | IL-1β/(pg/mL) | IL-18/(pg/mL) | Casepase-1/(pg/mL) | NLRP3/(pg/mL) |
| * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, vs. model group. # P < 0.05, vs. SH + ERY-MN. n = 3 per proup. | ||||
| Control | 83.80±0.79*** | 44.77±0.39*** | 5.76±0.41*** | 85.21±3.90** |
| Model | 107.43±0.75 | 92.81±1.34 | 10.64±1.09 | 118.77±1.91 |
| MN | 101.41±1.17 | 89.01±0.46 | 6.11±0.34** | 99.97±0.35 |
| SH-MN | 84.46±1.13*** | 50.42±0.33*** | 5.38±0.31*** | 89.33±10.07** |
| ERY-MN | 93.94±5.48*, # | 52.53±0.32***, # | 7.70±1.06*, # | 99.73±3.21*, # |
| SH + ERY-MN | 82.02±0.35*** | 49.38±0.35*** | 5.83±0.75** | 75.03±5.65*** |
2.6. 鱼腥草素钠合并红霉素微针的体内治疗作用
2.6.1. 小鼠背部痤疮大小变化
图3A～3B为背部痤疮大小变化，由给药后第6天与第1天的痤疮大小的比值变化可知，与Model组相比，SH-MN组、ERY-MN组和SH+ERY-MN组的小鼠背部痤疮大小比值变化差异有统计学意义（P<0.01），且SH+ERY-MN组的差异明显。
图 3.
The changes in the back acne in mice (A) and its quantitative analysis (B), and HE staining results of skin (C)
小鼠背部痤疮变化（A）及其定量分析（B）和皮肤HE染色结果（C）
*** P < 0.001, vs. model group.
2.6.2. 皮肤HE染色
图3C结果显示各组皮肤结构，与Model组比较，SH-MN组、ERY-MN组和SH+ERY-MN组毛囊中未观察到明显的角化物质积累和表皮角化现象，同时未见皮脂腺的增生或毛囊内皮脂的积聚。此外，皮下组织的炎症细胞浸润程度有所降低。结果表明SH-MN组、ERY-MN组和SH+ERY-MN组均能够减轻痤疮炎症，且效果比阳性药给药组的效果较好。
2.6.3. 小鼠IL-1β、IL-18、NLRP3和Caspase-1基因的皮肤组织mRNA表达和血清含量水平
结果如图4A～4D所示，与Model组相比，SH-MN组、ERY-MN组和SH+ERY-MN组均能降低小鼠痤疮炎症模型血清中IL-1β、IL-18、NLRP3、Caspase-1的含量水平（P<0.01）；且SH+ERY-MN组比ERY组更能降低炎症因子含量水平（P<0.05）。图4E～4H中qPCR 的结果与ELISA结果基本一致。结果表明SH+ERY-MN组抑制治疗炎性痤疮的作用优于SH-MN组和ERY-MN组。
图 4.
The expression of IL-1β (A), IL-18 (B), NLRP3 (C), and Caspase-1 (D) in mouse serum and the relative expression of IL-1β (E), IL-18 (F), NLRP3 (G), and Caspase-1 (H) mRNA in mouse skin tissue
小鼠血清中IL-1β（A）、IL-18（B）、NLRP3（C）和 Caspase-1（D）的表达及小鼠皮肤组织中IL-1β（E）、IL-18（F）、NLRP3（G）和Caspase-1（H）mRNA的相对表达
* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, vs. model group. # P < 0.05, ## P < 0.01, vs. ERY group. n = 3 per proup.
3. 讨论
在过去的十年中，痤疮丙酸杆菌对ERY、克林霉素（clindamycin, CLI）和四环素（tetracycline, TC）的耐药性增加，提升了一般人群患痤疮等皮肤疾病的风险[9]。这种耐药性在全球范围内引发了公共卫生危机[10]。因此，探索抗生素与天然产品联合治疗的研究显得尤为重要，这不仅能有效和安全地治疗痤疮，还能解决耐药性问题。ERY作为一种有效的外用抗生素，主要用于治疗炎症性痤疮，通过抑制细菌蛋白合成对痤疮丙酸杆菌产生抑菌作用，同时还能防止中性粒细胞的趋化迁移，这在炎症过程及随后的细菌感染中起着关键作用[11]，中药因其抑菌作用且不易产生耐药性而备受关注。
SH是癸酰乙醛（鱼腥草的活性成分）的亚硫酸氢钠加成物，不仅保留了癸酰乙醛的抗菌、抗炎[12]和抗氧化作用，又具有性质稳定、毒性低和作用效果持久的优点[13]。我们课题组的前期研究也显示，SH对痤疮丙酸杆菌具有较强的抑菌效果[14]。将SH与ERY结合使用，可以降低痤疮丙酸杆菌的耐药性，并增强痤疮的治疗作用。微针作为一种新型经皮给药方式，能够有效地透过角质层，释放出药物，从而解决了常规经皮给药时大分子化合物无法透过角质层的实际问题[15]。可溶性微针采用生物可降解或可溶解的聚合材料制成的微针[16]，具有安全性好、制备过程简单、制造成本相对低廉的特点[17]。本实验制备的鱼腥草素钠合并红霉素微针，外观设计优良，按照10×10的矩阵排列，背衬层表面光滑且无气泡。使用FITC标记的微针穿刺猪皮肤后，留下了明显的绿色痕迹，证实了该药物载体微针能够有效穿透皮肤的角质层。
本研究首先确定红霉素的MIC为1.28 mg/mL，与文献中红霉素对痤疮丙酸杆菌的MIC基本一致[18]。通过棋盘法，我们进一步确定了SH与ERY对痤疮丙酸杆菌具有联合抗菌作用。基于FIC，我们制备并鉴定了SH+ERY-MN，成功制备了SH+ERY-MN。SH+ERY-MN的时间杀伤曲线测定结果表明，SH与ERY确实具有协同作用，并且MN在pH5.0的条件下才能够将药物释放出来。体外细胞实验结果进一步证实，SH+ERY-MN组的抑制效果较好。通过小鼠体内痤疮炎症模型，我们发现SH+ERY-MN能够有效抗痤疮作用，缓解细胞因子炎症反应，显示出良好的抗菌和抗炎效果。综上所述，与SH-MN和ERY-MN相比，SH+ERY-MN在炎性痤疮的治疗上效果更好，表明SH+ERY-MN可能是抗痤疮治疗的潜在候选者。
尽管本研究取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。首先，本研究未能充分探讨不同个体对SH和ERY联合治疗的反应差异，未来研究需要考虑个体差异对治疗效果的影响。其次，研究主要关注短期内的治疗效果，对于长期应用的安全性和效果尚未进行评估。此外，本研究主要针对ERY的耐药性，对于其他抗生素的耐药性模式和联合治疗的效果尚未涉及。基于本研究的发现和局限性，未来的研究可能会聚焦于以下几个方向：一是探索不同个体对SH和ERY联合治疗的反应，以发展个体化治疗方案；二是进行长期研究以评估SH和ERY联合治疗的安全性和持续效果；三是扩展研究范围，探讨SH与ERY联合治疗对其他抗生素耐药性的影响。
* * *
作者贡献声明 巫婷婷负责论文构思、数据审编、正式分析、调查研究、研究方法、软件、可视化和初稿写作，陈晴汝负责数据审编、验证、可视化、初稿写作和审读与编辑写作，卢雪梅负责经费获取、研究项目管理、提供资源、监督指导和审读与编辑写作。所有作者已经同意将文章提交给本刊，且对将要发表的版本进行最终定稿，并同意对工作的所有方面负责。
Author Contribution WU Tingting is responsible for conceptualization, data curation, formal analysis, investigation, methodology, software, visualization, and writing--original draft. CHEN Qingru is responsible for data curation, validation, visualization, writing--original draft, and writing--review and editing. LU Xuemei is responsible for funding acquisition, project administration, resources, supervision, and writing--review and editing. All authors consented to the submission of the article to the Journal. All authors approved the final version to be published and agreed to take responsibility for all aspects of the work.
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
Declaration of Conflicting Interests All authors declare no competing interests.
Funding Statement
国家自然科学基金（No. 32070509、No.82372161），广东省基础与应用基础研究基金（No. 2021A1515220119），深圳市科技计划（No. JCYJ20220530150412027），深圳市医学重点学科（No. SZXK066），深圳市医疗卫生三名工程（No. SZSM202011008、No. SZSM202211016）和广东省高水平临床重点专科（No. SZGSP006）资助
Contributor Information
婷婷 巫 (Tingting WU), Email: 1500395246@qq.com.
雪梅 卢 (Xuemei LU), Email: luxuemei605@163.com.
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