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. 2021 Oct 20;37(10):959–969. [Article in Chinese] doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20200715-00347

不同三维多孔结构对人工真皮血管化速率影响的实验研究

Experimental study on the effect of three-dimensional porous structures on the vascularization rate of artificial dermis

谭 荣伟 1, 刘 曦 2, 陈 滢滢 2, 许 孟强 2, 郭 远军 2, 王 丹妍 1, 梁 嘉美 2, 刘 姣 1, 苑 莎莎 3, 范 炜 3, 王 香坤 3, 佘 振定 1,*
PMCID: PMC11917312  PMID: 34689466

Abstract

目的

探索定向排列的三维多孔网状（A型）结构和蜂窝煤状垂直贯穿的三维多孔网状（B型）结构对人工真皮血管化速率的影响。

方法

采用实验研究方法。本研究中的人工真皮为硅胶层和支架层双层结构，根据支架层结构不同，分为含A型结构和B型结构的人工真皮（以下分别简称A型真皮、B型真皮），其中的A型结构和B型结构分别采用梯度冷冻干燥技术和物理制孔技术制得。采用扫描电镜观测2种真皮支架的微观形貌。采用比重瓶法测定2种真皮支架的孔隙率。参照国家医药行业标准中的方法，于降解4、8、13、24 h测定2种真皮降解液及残留物中羟脯氨酸的含量，反映2种真皮降解率。取L929细胞，按照随机数字表法分为A型真皮组、B型真皮组、阴性对照组、阳性对照组，阳性对照组加入含体积分数5%二甲基亚砜的MEM培养基，阴性对照组加入高密度聚乙烯浸提液，其余2组加入相应的浸提液培养24 h，采用噻唑蓝试剂测定细胞增殖率，并对细胞毒性进行定级。取L929细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVEC），接种于预先置有2种真皮的孔板。接种后1、4、7、14 d，采用免疫荧光法检测L929细胞在2种真皮支架表面的黏附生长状况。接种后7 d，采用免疫荧光法和苏木精-伊红（HE）染色法检测前述2种细胞长入2种真皮支架的情况。在3只6个月龄雄性巴马小型猪背部两侧各制作3个5.0 cm×5.0 cm的全层皮肤缺损创面，6列创面按照随机数字表法分为A型真皮两步法组、B型真皮两步法组和B型支架一步法组。A型真皮两步法组和B型真皮两步法组的创面分别先行A型真皮或B型真皮移植后，再行自体刃厚皮片的移植，B型支架一步法组的创面行B型真皮（揭除硅胶层）+自体刃厚皮片一步法移植。大体观察Ⅱ期术后7 d A型真皮两步法组和B型真皮两步法组及Ⅰ期术后14 d B型支架一步法组的猪背创面出血、渗液和感染情况。同时，采用透明胶片网格法测定自体皮移植面积并计算其存活率。Ⅰ期术后4、7、14 d，HE染色法检测3组猪背创面中支架的炎症细胞、成纤维细胞（Fb）和毛细血管浸润情况。Ⅰ期术后7 d，免疫组织化学法进一步检测3组猪背创面中支架的血管化情况。Ⅰ期术后28 d、3个月，HE染色法检测A型真皮两步法组和B型支架一步法组猪背创面中支架的降解情况。对数据行单因素方差分析、独立样本t检验、Bonferroni校正。

结果

A型真皮支架表面均匀分布着大量圆形和椭圆形的微孔，纵切面可观察到柱状孔壁大体呈平行定向排列；B型真皮支架表面的蜂窝煤状贯穿大孔呈矩阵有序排列，纵切面蜂窝煤状贯穿孔的孔壁由微孔相互连通成网络结构。A型真皮支架的孔隙率为（93.2±0.7）%，与B型的（95.9±1.0）%相近（t=4.653，P > 0.05）。A型真皮在4、8、13、24 h的降解率与B型真皮对应时间点的降解率相近（t=0.232、0.856、0.258、7.716，P > 0.05）。培养24 h，A型真皮组、B型真皮组、阴性对照组L929细胞的增殖率显著高于阳性对照组（t=2 393.460、2 538.270、1 077.770，P < 0.01）；阳性对照组细胞毒性评级为4级，其余3组为0级。接种后1、4、7、14 d，L929细胞和HUVEC在2种真皮支架中均呈时间依赖性增殖；且2种细胞在B型真皮上的黏附生长、增殖速率高于A型真皮。接种后7 d，L929细胞和HUVEC均已长满B型真皮支架层且至硅胶层一侧；而前述2种细胞向A型真皮内部迁移速度较慢，硅胶层一侧仅见少量细胞。Ⅱ期术后7 d A型真皮两步法组和B型真皮两步法组及Ⅰ期术后14 d B型支架一步法组创面均未出现出血、渗液、感染等情况；3组各6个创面的自体皮植皮存活率均为100%。Ⅰ期术后4、7、14 d，炎症细胞、Fb、毛细血管等逐渐向创面的支架层浸润，且细胞浸润速率从高到低依次为B型支架一步法组、B型真皮两步法组、A型真皮两步法组。Ⅰ期术后7 d 3组创面中支架的血管化速率从高到低依次为B型支架一步法组、B型真皮两步法组、A型真皮两步法组。B型支架一步法组猪背创面中的支架在术后28 d逐渐溃散，术后3个月完全降解；A型真皮两步法组猪背创面中的支架降解情况与前述相似。

结论

与A型结构相比，B型结构可加速人工真皮支架血管化进程，利于联合自体刃厚皮一步法移植修复猪全层皮肤缺损创面。一步法移植的效果与分次移植人工真皮与自体刃厚皮的两步法一致，可为创面治疗提供更优选择。

Keywords: 皮肤，人工, 伤口愈合, 三维, 孔结构, 全层皮肤缺损, 血管化

自体皮片或皮瓣移植一直是全层皮肤缺损修复的主要手段。然而，自体皮片移植易导致皮片移植部位形成瘢痕、色素沉着及挛缩，大面积皮肤缺损患者还面临着皮源不足的困境[1]；皮瓣移植则供区损伤大，受区臃肿，且常需二次手术修薄皮瓣[2]。

真皮替代物的出现为全层皮肤缺损修复提供了崭新选择。本研究中Lando®人工真皮已在临床得到广泛应用[3-8]。该产品为双层结构，使用时待下层支架完全血管化后（通常需10~14 d）揭除上层硅胶层，行Ⅱ期自体皮移植术封闭创面。若创基较好，采用真皮支架联合自体皮一步法移植封闭创面，则可大大缩短患者住院周期，降低医疗费用，提高病床周转率，这也对支架早期营养供给及血管化速度提出了更高的要求。

目前，促进移植术后人工真皮支架血管化策略涵盖了支架、细胞及其他新兴技术[9]。然而，大多数血管化策略仅停留在理论研究或动物实验阶段，并未进入临床使用。为满足人工真皮早期营养供给及快速血管化，实现一步法移植封闭创面的需求，本研究通过对比定向排列的三维多孔网状（A型）结构人工真皮（以下简称A型真皮）和蜂窝煤状垂直贯穿的三维多孔网状（B型）结构人工真皮（以下简称B型真皮），评估蜂窝煤状垂直贯穿孔结构的增加对人工真皮理化性能、体外细胞毒性及相容性、猪体内血管化及有效性的影响。

1. 材料与方法

本实验研究遵循国家有关实验动物管理和使用规定。

1.1. 动物及主要试剂与仪器来源

3只健康普通级雄性广西巴马小型猪购自东莞松山湖明珠实验动物科技有限公司，许可证号：SYXK（粤）2017-0123，月龄为6个月，体重约20 kg。兔抗小鼠CD31单克隆抗体、生物素标记的山羊抗鼠IgG二抗及二氨基联苯胺色原/底物试剂盒购自英国Abcam公司，MEM培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司，胶原蛋白酶、鬼笔环肽-罗丹明、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、二甲基亚砜（DMSO）及噻唑蓝购自美国Sigma公司，苏木精、伊红购自北京索莱宝生物科技有限公司，L929细胞株购自中国典型培养物保藏中心，人脐静脉内皮细胞（HUVEC）株购自上海细胞生物学研究所，A型真皮和B型真皮购自深圳齐康医疗器械有限公司。TM3030型台式扫描电镜购自日本日立公司，BioTek-SynergyTM 2多功能酶标仪购自广州基因有限公司，Leica SP8激光扫描共聚焦显微镜和徕卡DMIL LED型倒置荧光显微镜购自徕卡显微系统（上海）贸易有限公司，NanoZoomer 2.0RS型切片扫描仪购自滨松光子学商贸（中国）有限公司。

1.2. 人工真皮支架的制备

A型真皮为已上市的Lando®双层人工真皮，上层为半透明的医用硅胶层；下层为含A型结构的支架层，其主要成分为可降解的胶原/硫酸软骨素，采用梯度冷冻干燥技术制得。与A型真皮相比，B型真皮的差别为其下层支架的物理结构为B型结构，由物理制孔法得到，具体的制备方法参照发明专利，专利公开号：CN109248337A。

1.3. 人工真皮支架理化性能的表征

1.3.1. 扫描电镜观察

2种真皮用纯水洗净冻干后制作试样备用。取部分试样，真空条件下在支架表面和纵切面倾斜喷金后，采用30、100、200倍扫描电镜观察支架微观形貌并拍照。

1.3.2. 孔隙率测定

取试样，根据参考文献[10]，用水代替乙醇，采用比重瓶法测定2种真皮支架的孔隙率，样本数为3。

1.3.3. 体外降解试验

将2种真皮试样制备成规格为1 cm×1 cm的样品，每个样品加入4 mL pH=7.4、150 U/mL的胶原蛋白酶溶液，于37 ℃恒温摇床振荡（转速50次/min）的条件下降解。于降解4、8、13、24 h，分别收集降解残留物及降解液并用6 mol/L盐酸分别进行消解。用氢氧化钠溶液中和、定容，参照国家医药行业标准YY/T 1453-2016附录B中方法1测定降解液及降解残留物中羟脯氨酸的含量，反映样品的降解率，降解率=降解液中羟脯氨酸含量÷（降解液中羟脯氨酸含量+降解残留物中羟脯氨酸含量）×100%。本实验重复3次，结果取均值。

1.4. 生物安全性试验

1.4.1. 体外细胞的增殖及毒性反应

采用噻唑蓝试剂检测细胞增殖率。以MEM培养液为浸提介质，于37 ℃下分别对A型真皮、B型真皮和高密度聚乙烯（阴性对照）浸提24 h，获取对应浸提液。取L929细胞，以添加体积分数10%胎牛血清的MEM培养液为培养基（以下简称MEM完全培养基），置于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳培养箱中培养。待细胞生长至80%以上融合时，以5×104个/mL的密度接种至96孔板中，每孔100 μL，继续培养24 h。按照随机数字表法将细胞分为A型真皮组、B型真皮组、阴性对照组、阳性对照组，弃原培养基，阳性对照组孔板中加入含体积分数5% DMSO的MEM完全培养基，其余3组加入相应含体积分数10%胎牛血清的浸提液继续培养24 h。按照噻唑蓝试剂的说明书处理细胞，用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度值，计算细胞的增殖率。根据国家标准GB∕T 14233.2-2005的规定，对细胞毒性进行定级。本组实验每组设6个复孔，结果取均值。

1.4.2. 体外细胞黏附与长入支架的情况

免疫荧光法和HE染色法检测。无菌条件下，将2种真皮裁切后置于48孔板中，硅胶层朝下。取L929细胞和HUVEC，消化、计数，按2×104个/mL密度接种于预先置有真皮的孔板中，每孔500 μL，置于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳培养箱中培养，每1~2天换液1次。于接种后1、4、7、14 d，用体积分数10%的甲醛溶液固定细胞爬片备用。取上述各时间点接种在2种真皮上的L929细胞爬片，按照说明书采用鬼笔环肽-罗丹明和DAPI 2种荧光染料分别对其细胞骨架（红色）与细胞核（蓝紫色）染色，采用400倍激光扫描共聚焦显微镜观察细胞在真皮支架表面的黏附生长情况。取接种在2种真皮上7 d的2种细胞爬片，行免疫荧光（方法同前）和常规HE染色，观察细胞向支架内部的长入情况。HE染色结果采用切片扫描仪进行观察。以上各实验均设3个复孔。

1.4.3. 动物实验

1.4.3.1. 动物分组及模型制备

巴马小型猪术前禁食12 h，采用吸入性麻醉的方法，先用氯胺酮、噻拉嗪分别以10 mg/kg和1~2 mg/kg的剂量进行诱导麻醉，建立静脉通路，气管插管，再以体积分数2.5%~3.5%的异氟烷维持麻醉。保持俯卧位姿势，背部剃毛、消毒、铺无菌巾，在同一只猪背部两侧各制备3个5.0 cm×5.0 cm的全层皮肤缺损创面，创面间距5.0 cm以上。将3头猪左右侧6列创面按照随机数字表法分为A型真皮两步法组、B型真皮两步法组和B型支架一步法组，每组2列共6个创面。电凝止血后，A型真皮两步法组先行A型真皮移植，14 d后揭除硅胶层，再行自体刃厚皮片移植封闭创面；B型真皮两步法组先行B型真皮移植，7 d后揭除硅胶层，再行自体刃厚皮片移植封闭创面；B型真皮支架一步法组行B型真皮（揭除硅胶层）+自体刃厚皮片一步法移植。3组皮片移植缝合后用灭菌凡士林纱布覆盖，打包后用弹力绷带固定。创面处理后，动物予以单笼饲养。术后每天观察大鼠活动情况，每4~7天行常规换药，根据创面愈合情况选择抗感染和镇痛治疗。

1.4.3.2. 创面大体观察

大体观察Ⅱ期术后7 d A型真皮两步法组和B型真皮两步法组及Ⅰ期术后14 d B型支架一步法组的猪背创面出血、渗液和感染情况并拍照。同时，采用透明胶片网格法测定自体皮移植面积并计算其存活率，存活率=植皮存活面积÷移植总面积×100%。

1.4.3.3. 创面支架中的细胞浸润情况

采用免疫组织化学法和HE染色法观测。于Ⅰ期术后4、7、14 d，在创面中心或距离创缘1.0~1.5 cm的创面处取2个直径约2 mm、深度约7 mm柱状活检样，经组织固定和石蜡包埋后备用。取各时间点组织，行常规HE染色，400倍镜下观察炎症细胞、Fb和毛细血管长入支架情况。取其中7、14 d的包埋组织进行脱蜡、复水，在96 ℃、0.01 mol/L三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液中行抗原修复20 min，常规条件下封闭抗原。滴加兔抗小鼠CD31一抗（稀释比为1∶150），4 ℃孵育过夜。加入生物素标记的山羊抗兔IgG二抗（稀释比为1∶200），室温孵育15 min。二氨基联苯胺显色，苏木精室温下复染2 min。倒置荧光显微镜下着红棕色的单个或相邻2个细胞以及环状物均视为1条阳性血管，每个组织切片于400倍镜下随机观察4个视野并对阳性信号进行计数。以上实验重复3次，结果取均值。

1.4.3.4. 支架降解情况

Ⅰ期术后28 d、3个月，取A型真皮两步法组和B型真皮支架一步法组猪背创面柱状活检样（方法同1.4.3.3），经固定、包埋后行常规HE染色，观察A型真皮支架和B型真皮支架的降解情况。

1.5. 统计学处理

采用SPSS 24.0统计软件进行分析，计量资料数据均符合正态分布，以x±s表示，总体比较行单因素方差分析，组间两两比较行独立样本t检验并进行Bonferroni校正。P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 改性对支架理化性能的影响

A型真皮支架表面均匀分布着大量圆形和椭圆形的微孔，孔径为（111±46）μm，见图 1A；纵切面可观察到柱状孔壁大体呈平行定向排列，近似垂直于支架表面，孔壁由微孔相互连通成网络结构。B型真皮支架的蜂窝煤状贯穿大孔呈矩阵有序排列，呈规则圆形，大小均一，孔径为（247±25）μm，孔间距为（976±23）μm；纵切面未见支架皱缩及塌陷，蜂窝煤状贯穿孔的孔壁由微孔相互连通成网络结构。见图 1。

图 1.

2种人工真皮试样支架表面和纵切面形貌观察。1A.A型真皮表观形貌，表面均匀分布着大量圆形和椭圆形的微孔扫描电镜×30，图中标尺为1 mm；1B.B型真皮表观形貌，可见蜂窝煤状贯穿大孔呈矩阵有序排列扫描电镜×30，图中标尺为1 mm；1C.A型真皮纵切面形貌，可观察到柱状孔壁大体呈平行纵向排列扫描电镜×200，图中标尺为200 μm；1D.B型真皮纵切面形貌，清晰可见蜂窝煤状贯穿大孔断面（白色虚线标记）扫描电镜×100，图中标尺为300 μm

注：A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮，B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮

图 1

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A型真皮支架的孔隙率为（93.2±0.7）%，与B型真皮支架的（95.9±1.0）%相近（t=4.653，P=0.164）。

A型真皮在降解4、8、13、24 h的降解率分别为（32.9±2.9）%、（48.5±1.7）%、（76.0±3.4）%和（78.4±1.3）%，与B型真皮在对应时间点的降解率（31.2±2.1）%、（52.3±3.7）%、（73.5±3.5）%和（86.4±2.6）%接近（t=0.232、0.856、0.258、7.716，P=0.678、0.452、0.662、0.109）。

2.2. 生物相容性

2.2.1. 体外细胞毒性

分组培养后24 h，4组细胞的增值率总体比较差异有统计学意义（F=563.832，P < 0.001）。A型真皮组、B型真皮组、阴性对照组细胞的增殖率分别为（102.6±3.4）%、（105.9±3.5）%、（118.2±6.3）%，显著高于阳性对照组的（24.7±0.9）%（t=2 393.460、2 538.270、1 077.770，P < 0.001）。阳性对照组细胞毒性评级为4级，其余3组均为0级。

2.2.2. 细胞黏附与长入

接种后1 d，只有少量L929细胞在A型真皮支架表面黏附；接种后4 d，细胞在支架表面呈铺展状态；接种后7 d，细胞在支架表面呈密集黏附生长；接种后14 d，细胞几乎已长满整个支架，细胞生长状况良好，见图 2A~2D。与A型真皮支架相比，L929细胞于对应时间点在B型真皮支架表面的黏附呈更加铺展状态且增殖更快（图 2E, 2H）。接种后7 d，L929细胞和HUVEC均已长满B型真皮支架层且至硅胶层一侧；而2种细胞向A型真皮内部迁移速度较慢，硅胶层一侧只见少量细胞，见图 3、图 4。

图 2.

不同时间点L929细胞在2种支架上的黏附生长情况  鬼笔环肽-罗丹明-4', 6-二脒基-2-苯基吲哚×400，图中标尺为100 μm。2A、2B、2C、2D.分别为细胞在A型真皮接种1、4、7、14 d黏附生长情况，接种后的细胞均呈时间依赖性增殖；2E、2F、2G、2H.分别为细胞在B型真皮分别接种1、4、7、14 d黏附生长情况，与图 2A、2B、2C、2D相比，细胞在B型真皮上的黏附生长、增殖速率更高

注：细胞骨架阳性染色为红色，细胞核阳性染色为蓝紫色；A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮，B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮

图 2

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图 3.

接种后7 d 2种细胞在2种真皮支架中的长入情况  鬼笔环肽-罗丹明-4', 6-二脒基-2-苯基吲哚×400，图中标尺为200 μm。3A、3B.分别为人脐静脉内皮细胞分别向A、B型真皮支架纵向长入情况，细胞长入B型真皮支架的数量明显多于A型真皮支架；3C、3D.分别为L929细胞分别向A、B型真皮支架纵向长入情况，细胞长入B型真皮支架的数量明显多于A型真皮支架

注：细胞骨架阳性染色为红色，细胞核阳性染色为蓝紫色；A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮，B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮

图 3

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图 4.

接种后7 d 2种细胞在2种真皮支架中的长入情况  苏木精-伊红×400，图中标尺为100 μm。4A、4B.分别为人脐静脉内皮细胞分别向A、B型真皮支架长入情况，细胞长入B型真皮支架的数量明显多于A型真皮支架；4C、4D.分别为L929细胞分别向A、B型真皮支架长入情况，细胞长入B型真皮支架的数量明显多于A型真皮支架

注：细胞核阳性染色为蓝紫色（↑）；A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮，B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮

图 4

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2.2.3. 人工真皮材料有效性的动物实验评价

2.2.3.1. 创面大体观察

Ⅱ期术后7 d A型真皮两步法组和B型真皮两步法组及Ⅰ期术后14 d B型真皮支架一步法组猪背创面均未出现出血、渗液、感染等情况；3组各6个创面的自体皮存活率均为100%，其修复效果无明显差异，见图 5。

图 5.

3组猪背全层皮肤缺损创面移植自体皮存活情况。5A.A型真皮两步法组Ⅱ期术后7 d创面情况，创面移植的自体皮完全存活；5B.B型真皮两步法组Ⅱ期术后7 d的创面情况，创面移植的自体皮完全存活；5C.B型真皮支架一步法组术后14 d创面，创面移植的自体皮完全存活

注：图中小孔为柱状活检样取出后遗留的痕迹；A型真皮两步法组Ⅰ期术后14 d行Ⅱ期自体皮移植，B型真皮两步法组Ⅰ期术后7 d行Ⅱ期自体皮移植；A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮，B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮

图 5

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2.2.3.2. 创面支架中细胞浸润情况

A型真皮两步法组：Ⅰ期术后4 d，支架内有少量淋巴细胞、巨噬细胞及嗜酸性粒细胞等炎症细胞浸润，但未见Fb浸润，见图 6A；Ⅰ期术后7 d，支架内炎症细胞进一步增多，支架创基侧有较多Fb浸润，见图 6B；Ⅰ期术后14 d，支架内炎症细胞继续增多，局部可见多核细胞，整层支架完全被Fb和毛细血管浸润，见图 6C。B型支架一步法组：Ⅰ期术后4 d，与相同时间点A型真皮两步法组相比，支架与创基交界处已有少量Fb浸润，B型真皮两步法组在相同时间点的细胞长入情况与之相似（图 6D）；Ⅰ期术后7 d，与相同时间点A型真皮两步法组相比，B型真皮支架整层已被大量Fb浸润，见图 6E；Ⅰ期术后14 d，B型真皮支架内炎症反应明显消退，支架孔隙间已生成大量致密的新生胶原，孔壁较厚的支架区域，组织长入则较少，见图 6F。Ⅰ期术后7、14 d，B型真皮两步法组猪背创面支架中的细胞浸润情况介于对应时间点的其他2组之间。

图 6.

3组猪背全层皮肤缺损创面移植支架中的细胞浸润情况  苏木精-伊红×400，图中标尺为100 μm。6A.Ⅰ期术后4 d，A型真皮两步法组创面中支架内有炎症细胞浸润，未见成纤维细胞（Fb）浸润；6B.Ⅰ期术后7 d，A型真皮两步法组创面中支架内炎症细胞较图 6A略有增加，支架创基侧有较多Fb浸润；6C.Ⅰ期术后14 d，A型真皮两步法组创面中支架内炎症细胞较图 6B增多，整层支架完全被Fb和毛细血管浸润；6D.Ⅰ期术后4 d，B型真皮两步法组创面中的支架与创基交界处已有少量Fb浸润；6E.Ⅰ期术后7 d，B型真皮支架一步法组创面中的支架整层已被大量Fb浸润；6F.Ⅰ期术后14 d，B型真皮支架一步法组创面中的支架内炎症反应明显消退，支架孔隙间已生成大量致密的新生胶原

注：A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮，B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮

图 6

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2.2.3.3. 创面中支架的血管化进程

Ⅰ期术后7 d，A型真皮两步法组猪背创面中支架表层未明显见血管腔，基底侧局部可见血管腔，CD31表达阳性的血管数为（16±3）条；B型真皮两步法组创面支架表层局部可见较多血管腔，基底侧血管腔明显，可见大量CD31阳性信号表达，贯穿孔处及其周围可见更多渗出物及粗大、多分支的血管样结构，CD31表达阳性的血管数为（27±5）条，显著高于对应时间点的A型真皮两步法组（t=6.914 3，P=0.047）；B型真皮支架一步法组创面中支架已与自体皮及其下的创基有紧密的连接，整个支架内有大量CD31阳性信号表达，支架全层血管化。A型真皮两步法组Ⅰ期术后14 d的创面支架层仅可见较多细小的血管样结构，其血管化情况甚至不及Ⅰ期术后7 d B型真皮两步法组。见图 7。

图 7.

3组猪背全层皮肤缺损创面中移植支架的血管化情况二氨基联苯胺-苏木精×100，图中标尺为500 μm。7A.Ⅰ期术后7 d，A型真皮两步法组创面支架中仅基底侧局部可见血管腔；7B. Ⅰ期术后14 d，A型真皮两步法组创面中支架内有较多细小血管样结构均匀长入；7C.Ⅰ期术后7 d，B型真皮两步法组创面中支架的蜂窝煤状贯穿大孔中有大量CD31阳性信号表达；7D.Ⅰ期术后7 d，B型支架一步法组创面中支架完全血管化

注：AD为支架层，AS为移植的自体皮；红色虚线标记处为蜂窝煤状贯穿大孔；棕色为CD31阳性表达，反映细胞血管化情况；A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮，B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮

图 7

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2.2.3.4. 创面中支架体内降解

B型真皮支架一步法组猪背创面中的支架在Ⅰ期术后28 d逐渐溃散，可见较大块的支架碎片，支架残留处仍可见少量炎症细胞浸润，其他部位炎症消失；Ⅰ期术后3个月，支架已完全降解，所移植自体皮表皮突清晰可见，自体皮下方重建的真皮层中可见胶原纤维纵横交错排列，未见明显瘢痕增生，炎症反应完全消失。A型真皮两步法组猪背创面中的支架在Ⅰ期术后28 d也逐渐溃散；Ⅰ期术后3个月，也完全降解，其降解情况与B型真皮支架相似。见图 8。

图 8.

B型真皮支架一步法组和A型真皮两步法组猪背创面中的移植支架降解情况。8A.A型真皮两步法组术后28 d创面中支架的降解情况，支架溃散，仅可见大块碎片（↑）苏木精-伊红×400，图中标尺为100 μm；8B.A型真皮两步法组术后90 d创面中支架降解情况，支架完全降解，所移植自体皮表皮突清晰可见，未见明显瘢痕增生，炎症反应完全消失苏木精-伊红×100，图中标尺为500 μm；8C.B型真皮支架一步法组术后28 d创面中支架降解情况与8A相似苏木精-伊红×400，图中标尺为100 μm；8D.B型真皮支架一步法组术后90 d创面中支架降解情况与8B相似苏木精-伊红×100，图中标尺为500 μm

注：A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮，B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮

图 8

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3. 讨论

有研究表明[11]，自体游离皮片植入创面后，其营养来源按发生先后分别为创面渗液（1~2 d）、血管网吻合（3~5 d）、新生血管形成（1~2周），但皮片依靠创面渗液滋养而维持活力的界限一般不超过3~4 d[12]。真皮替代物修复创面时，由于替代物缺乏正常的血管网络，若在植入早期同时移植自体皮片，氧气和营养物质向自体皮渗透传输的距离增加，易导致自体皮移植失败。因此，为确保所移植自体皮片的存活，真皮替代物移植修复创面通常需要2次手术，即待真皮替代物完全血管化（即建立血管网络）后行Ⅱ期自体皮片移植。然而，新生微血管的生长速度约为5 μm/h[13]，市售的真皮替代物通常需要2周[14]甚至3~4周[15]才能完全血管化，2次手术延长了患者的住院周期，增加了血肿形成、创面感染等并发症的发生风险[16]。

为满足临床缩短住院周期等治疗需求，真皮替代物一步法移植应运而生。实现人工真皮一步法成功移植的关键在于提高自体皮片的存活率，这就需要在植皮初期搭建真皮支架快速血管化通路，满足自体皮早期营养供给，并且使周围的Fb、内皮细胞及其他细胞因子等及时浸润，从而促进支架的血管化。目前，国内外已上市的一步法移植产品包括Alloderm®、桀亚®等脱细胞异体真皮，以及Integra®、Matriderm®等单层人工合成真皮，适应证包括撕脱伤[16]、烧伤[17]、供瓣区[18]、皮肤癌切除后创面[19]、瘢痕松解后创面[20]等。分析相关文献报道，相较两步法，一步法移植的科学证据仍相对薄弱，且更倾向应用于修复血运良好的急性创面。在一步法移植中，为提高自体皮存活率，真皮替代物通常会戳孔或适当拉网，且建议与VSD装置联用，尤其是修复解剖学位置特殊的创面，或因病理生理原因导致的缺损创面时，上述加速营养物质扩散的方法尤为重要[16，19，21]。此外，还可以通过引入组织修复细胞或相关因子来加快真皮支架的血管化。如Soejima等[21]在将Terudermis®真皮支架一步法移植治疗烧伤创面时，支架中引入自体血小板源伤口愈合因子及异体内皮细胞和纤维母细胞，可增强支架的血管化能力，自体皮存活良好，再建皮肤质地柔软。受真皮基质戳孔、拉网等临床应用经验的启发，国内学者开始尝试微孔化真皮基质的研究[22-24]。但是，这类研究局限于异种皮，未见人工合成真皮的微孔化研究，制孔技术多为二氧化碳激光打孔，存在孔洞较大、基质碳化严重等问题，且生物相容性及有效性评价局限于裸鼠、大鼠等小动物，离临床应用还有很长的路要走。

本研究基于国产Lando®人工真皮微孔结构开展改性研究，以满足一步法移植对于真皮支架快速血管化的需求。该人工真皮早期的临床组织学切片表明，人工真皮移植14 d后，与创面接触部位有大量Fb长入以及毛细血管形成，但是，沿着垂直于真皮支架表层方向，细胞长入数量及血管形成数量呈梯度减少，表明改善垂直方向的孔结构是实现人工真皮一步法移植快速血管化的重要研发方向。有研究表明，孔参数影响孔结构中生成血管的大小和数量，单纯孔径的增加利于孔结构中生成大尺寸的血管，而随着支架互通尺寸的增加，大孔径内的血管尺寸和数目都会增加，因此，学者认为支架互穿的孔结构对于支架的血管化形成甚至比孔径更重要[26]。

因此，本研究采用物理制孔技术新增了蜂窝煤状贯穿大孔，与支架原有的微孔形成互穿的网络三维孔结构。有研究认为，孔间距为1 mm的激光微孔脱细胞真皮与自体刃厚皮复合移植效果最佳，可提高创面修复质量[23]。组织学分析结果表明，小孔支架（< 200 μm）利于密度高的小血管网络的形成，但穿透深度低；而大孔支架（> 200 μm）利于形成大血管网络，密度低，但穿透深度高[27]。支架孔径大小是血管长入的关键因素，血管长入 > 250 μm孔径支架中的速度明显快于 < 250 μm[28]。鉴于此，本研究新增贯穿孔孔径设置为250 μm，孔间距约为1 mm，实测值分别为（247±25）μm和（976±23）μm，蜂窝煤状贯穿大孔改性可小幅度提高支架的孔隙率，这与直观观察结果一致。2种三维孔结构的人工真皮支架均无细胞毒性，符合临床使用要求。体外细胞培养表明，只要有少量细胞在支架表面黏附，由于材料良好的亲和性，细胞能快速地伸展、增殖，并且向支架内部迁移长入。且相比A型真皮，B型真皮蜂窝煤状贯穿大孔与微孔互穿网络三维孔结构可促进L929细胞和HUVEC更快地向支架内部长入。

巴马小型猪背部全层皮肤缺损实验进一步证实了B型真皮的生物安全性和一步法移植的有效性。在移植初期，猪组织内表现出一定的炎症反应，7 d左右炎症反应为急性期，28 d时，炎症反应已经不明显，3个月后，炎症反应完全消失，这说明该人工真皮植入体内不会引起明显的异物反应，具有良好的生物相容性。然而，相比A型真皮两步法组，B型支架一步法组支架内Fb浸润及炎症反应消退均更快。CD31是一种跨膜蛋白，为血管内皮细胞的特异性表面标志，常用于评价新生血管[29]。B型真皮植入后7 d，支架全层血管化，且贯穿孔处及其周围可见更多渗出物及粗大的、多分支的血管结构；并且B型真皮与自体皮一步法移植，所移植皮片7 d时已与支架紧密黏附，所植皮片全部存活。而A型真皮在移植14 d时，其支架才完全血管化，这与前期动物试验结果相一致[30]。这说明蜂窝煤状贯穿大孔与微孔互穿网络三维孔结构的设计可实现支架的快速血管化，分析其原因：一方面B型真皮结构利于血浆渗出液的浸入，可满足移植自体皮初期营养供给；另一方面B型真皮与自体皮一步法移植利于周围的Fb、内皮细胞及其他细胞因子等向支架层两侧及时浸润从而加速支架的血管化，利于移植自体皮后期营养持续供给。考虑到薄的人工真皮产生薄的新生真皮，最终导致创面术后挛缩[31-32]，B型真皮在设计过程中，保留了已上市Lando®人工真皮1~2 mm的厚度。本研究的体外降解和动物体内降解均表明，蜂窝煤状贯穿大孔与微孔互穿网络三维孔结构没有明显加快支架的降解性能，B型真皮降解情况与A型真皮基本相当，术后3个月2组支架修复创面均未见明显瘢痕增生。可推测，较厚的真皮支架孔隙壁可在一定程度上保证支架的降解速率，为新生组织增殖期提供模板作用，限制新生组织过度生长而导致瘢痕的形成。

综上所述，B型真皮具有良好的生物相容性及有效性，蜂窝煤状贯穿大孔与微孔互穿网络三维孔结构可小幅度提高支架的孔隙率，但不会影响支架体内外降解性能，从而也不会改变人工真皮支架真皮重建的模板作用。蜂窝煤状贯穿大孔可为创面基底的新生组织向真皮支架内部的生长提供通道，更利于真皮支架的血管化。因此，对于创基血供比较好的创面，蜂窝煤状贯穿大孔与微孔互穿网络三维孔结构的人工真皮采用一步法移植可替代部分两步法移植修复全层皮肤缺损创面，可为创面治疗提供更优选择。

Funding Statement

国家重点研发计划政府间国际科技创新合作重点专项（2018YFE0194300）；广东省高端医疗器械专项（2020B1111150001）；深圳市发改委战略性新兴产业发展专项（深发改〔2019〕561号）；深圳市技术攻关项目（JSGG20180504170419462）

National Key Research and Development Program Intergovernmental Key Projects for International Cooperation in Science, Technology and Innovation (2018YFE0194300); Special Project of High-end Medical Devices in Guangdong Province (2020B1111150001); Shenzhen Development and Reform Commission Strategic Emerging Industries Development Project (No. 2019561); Shenzhen Technical Key Project (JSGG20180504170419462)

Footnotes

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

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Articles from Chinese Journal of Burns are provided here courtesy of Chinese Medical Association

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