白藜芦醇对后肢去负荷大鼠肝脏的保护作用研究

Abstract

This study aims to investigate the protective effect of resveratrol against liver injury in hindlimb unloading rats. Thirty 2-month-old male SD rats were randomly divided into normal group (Control), hindlimb unloading model group (Model), and hindlimb unloading+resveratrol administration group (Model+Res). The Model + Res group was injected intraperitoneally with 30 mg/kg of resveratrol, and the Control and Model groups were injected intraperitoneally with an equal volume of 0.9% NaCl. Liver tissues were collected after 28 days and analyzed for oxidative stress, inflammatory factors, energy metabolism indices, Na⁺-K⁺-ATPase and Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase activity, and morphological changes were observed by hematoxylin-eosin staining. The protein expression levels of Bax, Bcl-2, p-PI3K, PI3K, p-AKT, and AKT were detected by Western blotting. Compared with the Control group, hepatocytes in the Model group showed swelling, abnormal morphology, nuclear consolidation, and cell membrane disruption. Oxidative stress, inflammatory factor levels, hepatic glycogen accumulation, and energy metabolism were increased in the liver tissues of the Model group, while resveratrol treatment significantly reversed these changes. The results of Western blotting showed that resveratrol significantly reduced the expression of Bax and increased the expression levels of Bcl-2, and the proteins of p-PI3K/PI3K and p-AKT/AKT expression levels. It is suggested that 28 days of hindlimb unloading treatment could lead to liver tissue injury in rats, which is manifested as oxidative stress, inflammatory response, energy metabolism disorder and increased apoptosis level, and resveratrol has a certain mitigating effect on this.

0. 引言

随着人类对太空探索的深入，微重力环境对生物体健康的影响成为热点话题。长时间的太空飞行可能导致宇航员出现骨密度降低、肌肉萎缩、心血管系统变化及器官功能改变等问题^[1]。肝脏在新陈代谢、解毒、免疫调节等方面发挥着关键作用^[1-2]，然而已有研究发现，在微重力条件下，肝脏细胞的结构和功能会出现异常，导致代谢紊乱和相关疾病的发生^[3-5]。

白藜芦醇（resveratrol，Res）是一种存在于葡萄、红酒和某些浆果中的多酚化合物，已被证明具有抗氧化、抗炎和抗衰老等多种生物活性。近年的研究发现，白藜芦醇对酒精依赖^[6-7]、运动性疲劳^[8-9]和野百合碱^[10]等多种原因所致的肝损伤均有明显的保护作用。

为解决航天员在太空飞行时所面临的肝脏损伤难题，本次实验使用大鼠后肢去负荷所模拟的失重模型探究白藜芦醇对失重所致肝脏损伤是否具有保护作用。

1. 动物、材料与方法

1.1. 动物

SPF级SD雄性大鼠30只，鼠龄8周，体质量（180 ± 20）g，购自空军军医大学实验动物中心，许可证编号SCXK(陕)2019-001，本实验经中国人民解放军联勤保障部队第940医院科研管理伦理委员会批准（伦理审批号：2023KYLL337）。

1.2. 材料

白藜芦醇（阿拉丁，中国）；比色法测试盒（南京建成，中国）；酶联免疫吸附实验试剂盒（泉州睿信，中国）；B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）单克隆抗体（北京博奥森，中国）；Bcl2关联X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）单克隆抗体、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）多克隆抗体、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）单克隆抗体（Abcam，英国）；磷酸化蛋白激酶B（phospho-protein kinase B，p-AKT）多克隆抗体、磷酸化磷脂肌醇3激酶（phosphorylation phosphotylinosital 3 kinase，p-PI3K）多克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（recombinant glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗体、HRP标记山羊抗兔二抗（Affinity，美国）；Epoch酶标仪（伯腾，美国）；电泳仪、电泳槽（Bio-Rad，美国）

1.3. 方法

1.3.1. 动物分组与给药方法

所有动物在实验开始前在实验室环境适应性饲养1周，然后随机分为正常组（Control）、后肢去负荷模型组（Model）和后肢去负荷+白藜芦醇给药组（Model+Res）,每组10只。Model+Res组腹腔注射Res 30 mg·kg⁻¹，Control组和Model组均腹腔注射等体积0.9% NaCl。隔天给药，持续给药28天，给药共14次。每周称取大鼠体质量并记录。

1.3.2. 后肢去负荷模型构建

本实验中，按照Wronski和Morey-Holton的方法建立后肢去负荷模型^[11]。Control组大鼠正常饲养，而Model组和Model+Res组大鼠通过尾部悬吊，保持身体30 °倾斜，后肢离地，前肢自由，确保正常进食和饮水。每天尾吊24 h，共28天。

1.3.3. 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色法观察大鼠肝脏组织病理学形态变化

大鼠肝脏组织经磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗净后于4%的多聚甲醛固定液中保存，随后进行脱水、透明、石蜡包埋、切片，最后做HE染色处理，于光学显微镜下观察各组大鼠肝脏组织的病理学变化。

1.3.4. 比色法检测肝脏组织氧化应激和能量代谢水平

取部分肝脏组织，按照各试剂盒说明书进行超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX)、过氧化氢（hydrogen peroxide，H₂O₂）、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、一氧化氮(NO)、糖原、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、Na⁺K⁺-ATP酶（Na⁺K⁺-ATPase）、Ca²⁺Mg²⁺-ATP酶（Ca²⁺Mg²⁺-ATPase）含量/酶活力检测。

1.3.5. ELISA法检测肝脏组织炎症因子水平

取部分肝脏组织，按照1∶9的比例加入预冷的裂解液机械匀浆，离心30 min后取上清，采用酶联免疫吸附法（ELISA）进行白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平检测，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.3.6. 蛋白质印迹法检测肝脏组织内Bax、Bcl-2、p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K和GAPDH蛋白的表达水平

取部分肝脏组织，按照1∶9的比例加入预冷的裂解液机械匀浆，随后依次进行离心、测蛋白浓度、蛋白定量、高温变性。随后置于−80 ℃冰箱中待用。待测样品利用10% SDS-PAGE分离胶进行电泳分离，湿法转膜，5%脱脂奶粉封闭，再分别置于放有一抗Bax、Bcl-2、p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K和GAPDH的自封袋中4 ℃孵育过夜，二抗孵育，曝光检测各蛋白表达量。

1.3.7. 统计学分析

实验数据通过SPSS 26.0进行均值±标准差（x ± s）的统计学分析。多组别比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后用LSD法进行组间比较，检验水准为0.05。

2. 结果

2.1. 白藜芦醇对后肢去负荷大鼠肝脏组织病理变化的影响

普通光学显微镜下观察可见（见图1），Control组大鼠肝细胞形态结构正常，细胞核呈椭圆形，细胞间隙清晰，排列规则且紧密，肝细胞索排列整齐；Model组大鼠肝脏组织则出现了明显的病理变化，表现为肝细胞肿胀且形态异常，细胞核固缩，细胞膜完整性被破坏，肝细胞质内出现圆形空泡，细胞间隙模糊，排列无规则，肝细胞索紊乱，狄氏隙显现；Model+Res组大鼠肝脏组织的损伤有明显缓解，表现为肝细胞形态恢复正常，细胞肿胀程度明显降低，细胞间隙清晰，排列有序，肝细胞索排列较整齐。结果表明白藜芦醇能有效减轻后肢去负荷大鼠肝细胞受损程度。

图 1.

Effect of resveratrol on pathological changes in liver tissue of hindlimb unloading rats

白藜芦醇对后肢去负荷大鼠肝脏组织病理变化的影响

2.2. 白藜芦醇对后肢去负荷大鼠肝脏组织抗氧化酶活性的影响

如图2所示，与Control组相比，Model组大鼠肝脏组织抗氧化酶CAT、SOD、GSH-PX的酶活力显著下降（P < 0.01，P < 0.05，P < 0.01）；经白藜芦醇处理后，与Model组相比，CAT、SOD、GSH-PX的酶活力显著上升（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.01），其中GSH-PX活性与Control组相比无显著差异（P > 0.05）。以上结果表明，白藜芦醇能明显缓解因后肢去负荷所致大鼠肝脏组织的氧化损伤，并有可能在一定程度上基本恢复肝脏异常状态。

图 2.

Effect of resveratrol on antioxidant enzyme activity in liver tissue of hindlimb unloading rats

白藜芦醇对后肢去负荷大鼠肝脏组织抗氧化酶活性的影响

^*P < 0.05，^**P < 0.01，Model vs Control组；^#P < 0.05，^##P < 0.01，Model + Res vs Model组；^&P < 0.05，^&&P < 0.01，Model + Res vs Control组

^*P < 0.05, ^**P < 0.01, Model vs Control group; ^#P < 0.05, ^##P < 0.01, Model + Res vs Model group; ^&P < 0.05, ^&&P < 0.01, Model + Res vs Control group

2.3. 白藜芦醇对后肢去负荷大鼠肝脏组织氧化损伤指标的影响

如图3所示，与Control组相比，Model组大鼠肝脏氧化损伤指标H₂O₂、LDH、MDA和NO的酶活力/含量均显著升高（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.05，P < 0.01）；经白藜芦醇给药处理后，与Model组相比，Model+Res组大鼠肝脏组织上述指标均显著下降（P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01），与Control组相比无显著差异（P > 0.05，P > 0.05，P > 0.05，P > 0.05）。这说明白藜芦醇能够显著降低后肢去负荷大鼠肝脏组织的氧化损伤，并可恢复至正常水平，显示出白藜芦醇强大的抗氧化应激的作用。

图 3.

Effect of resveratrol on oxidative damage indicators in liver tissue of hindlimb unloading rats

白藜芦醇对后肢去负荷大鼠肝脏组织氧化损伤指标的影响

^*P < 0.05，^**P < 0.01，Model vs Control组；^#P < 0.05，^##P < 0.01，Model + Res vs Model组；^&P < 0.05，^&&P < 0.01，Model + Res vs Control组

^*P < 0.05, ^**P < 0.01, Model vs Control group; ^#P < 0.05, ^##P < 0.01, Model + Res vs Model group; ^&P < 0.05, ^&&P < 0.01, Model + Res vs Control group

2.4. 白藜芦醇对后肢去负荷大鼠肝脏组织炎症因子水平的影响

Elisa结果显示（见图4），与Control组相比，Model组大鼠肝脏组织IL-6和IL-1β相对含量显著升高（P < 0.01，P < 0.05）；Model+Res组大鼠肝脏组织IL-6和IL-1β相对含量明显低于Model组（P < 0.01，P < 0.01），且与Control组之间无显著差异（P > 0.05，P > 0.05）。这说明白藜芦醇对由后肢去负荷引起的大鼠肝脏炎症因子水平的升高有一定的缓解作用。

图 4.

The effect of resveratrol on the levels of inflammatory factors in liver tissue of hindlimb unloading rats

白藜芦醇对后肢去负荷大鼠肝脏组织炎症因子水平的影响

^*P < 0.05，^**P < 0.01，Model vs Control组；^#P < 0.05，^##P < 0.01，Model + Res vs Model组；^&P < 0.05，^&&P < 0.01，Model + Res vs Control组

^*P < 0.05, ^**P < 0.01, Model vs Control group; ^#P < 0.05, ^##P < 0.01, Model + Res vs Model group; ^&P < 0.05, ^&&P < 0.01, Model + Res vs Control group

2.5. 白藜芦醇对后肢去负荷大鼠肝脏组织能量代谢指标的影响

如图5所示，与Control组相比，Model组大鼠肝脏组织糖原含量明显升高（P < 0.05），ATP含量、Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活力显著降低（P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01），发生了肝糖原蓄积、能量代谢紊乱现象；而经白藜芦醇给药后，肝糖原含量明显下降（P < 0.05），能够恢复至正常水平，且ATP含量、Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活力均有一定程度的上升（P < 0.01，P < 0.05，P < 0.01）。这说明白藜芦醇能够一定程度上改善因后肢去负荷引起的肝脏能量代谢紊乱的现象。

图 5.

The effect of resveratrol on energy metabolism indicators in liver tissue of hindlimb unloading rats

白藜芦醇对后肢去负荷大鼠肝脏组织能量代谢指标的影响

^*P < 0.05，^**P < 0.01，Model vs Control组；^#P < 0.05，^##P < 0.01，Model + Res vs Model组；^&P < 0.05，^&&P < 0.01，Model + Res vs Control组

^*P < 0.05, ^**P < 0.01, Model vs Control group; ^#P < 0.05, ^##P < 0.01, Model + Res vs Model group; ^&P < 0.05, ^&&P < 0.01, Model + Res vs Control group

2.6. 白藜芦醇对后肢去负荷大鼠肝脏组织凋亡蛋白表达的影响

如图6所示，与Control组相比，Model组大鼠肝脏组织Bax促凋亡蛋白相对表达水平显著升高（P < 0.05），Bcl-2抗凋亡蛋白相对表达水平显著下降（P < 0.01）；与Model组相比，Model+Res组大鼠肝脏组织Bax蛋白相对表达水平显著下降（P < 0.05）并恢复至正常水平，Bcl-2蛋白相对表达水平显著上升（P < 0.05）。结果说明，白藜芦醇能够抑制后肢去负荷引起的大鼠肝脏组织的凋亡。

图 6.

The effect of resveratrol on the expression of apoptotic proteins in liver tissue of hindlimb unloading rats

白藜芦醇对后肢去负荷大鼠肝脏组织凋亡蛋白表达的影响

^*P < 0.05，^**P < 0.01，Model vs Control组；^#P < 0.05，^##P < 0.01，Model + Res vs Model组；^&P < 0.05，^&&P < 0.01，Model + Res vs Control组

^*P < 0.05, ^**P < 0.01, Model vs Control group; ^#P < 0.05, ^##P < 0.01, Model + Res vs Model group; ^&P < 0.05, ^&&P < 0.01, Model + Res vs Control group

2.7. 白藜芦醇对后肢去负荷大鼠肝脏组织PI3K/AKT信号通路活性的影响

如图7所示，Model组大鼠肝脏组织的PI3K和AKT蛋白磷酸化相对水平与Control组相比显著下降（P < 0.01，P < 0.01）；与Model组相比，Model+Res组大鼠肝脏组织的PI3K和AKT蛋白磷酸化相对水平显著上升（P < 0.05，P < 0.05）。以上结果提示，白藜芦醇可能通过激活PI3K/AKT信号通路调节后肢去负荷大鼠肝脏组织的氧化应激和凋亡水平。

图 7.

The effect of resveratrol on the PI3K/AKT signaling pathway activity in liver tissue of hindlimb unloading rats

白藜芦醇对后肢去负荷大鼠肝脏组织PI3K/AKT信号通路活性的影响

^*P < 0.05，^**P < 0.01，Model vs Control组；^#P < 0.05，^##P < 0.01，Model + Res vs Model组；^&P < 0.05，^&&P < 0.01，Model + Res vs Control组

^*P < 0.05, ^**P < 0.01, Model vs Control group; ^#P < 0.05, ^##P < 0.01, Model + Res vs Model group; ^&P < 0.05, ^&&P < 0.01, Model + Res vs Control group

3. 讨论与结论

随着太空探索活动的增多，微重力环境对生物体特别是肝脏的影响成为研究热点。研究显示，微重力条件下肝脏面临组织形态变化、氧化应激、炎症反应和能量代谢失调等多重压力，而白藜芦醇通过综合调节这些因素，可为肝脏健康提供保护作用。

肝脏组织正常形态对于维持其功能至关重要，而在微重力环境下，肝脏组织常出现明显的形态学变化，如细胞肿胀、结构异常和细胞膜损伤，这些变化通常与肝脏的功能障碍和代谢失调相关^[12]。本研究表明，白藜芦醇能够有效改善后肢去负荷大鼠的肝脏组织形态，减轻细胞损伤和形态异常，体现出对肝脏的保护作用。

肝脏作为机体主要的解毒器官，负责代谢各种化合物，但当自由基的生成量超过内源性抗氧化系统的能力时，肝脏的稳态就会遭受损害^[13]。氧化应激作为微重力环境中导致肝损伤的主要机制之一，能够增加自由基的产生，导致细胞膜脂质过度氧化，进而损伤细胞结构和功能^[14]。研究结果显示，白藜芦醇能显著增强肝脏中的抗氧化酶活性（如CAT、SOD、GSH-PX），并降低氧化损伤标志物（如MDA、H₂O₂和NO）的水平。

此外，研究发现，氧化应激和炎症在肝脏损伤中存在着密切的相互关系，它们通常相互影响并相互促进，导致肝脏疾病的发生和发展。炎症因子的过度释放是微重力环境下肝损伤的另一关键因素^[15]，而本研究发现，白藜芦醇能够显著降低由于后肢去负荷引起的炎症因子水平，表明它在抑制炎症反应方面具有良好的效果。而炎症和氧化应激通常相互作用，加剧肝脏损伤，因此白藜芦醇通过减轻炎症水平，也间接减轻了氧化应激的负面影响。

同时，肝脏在调节糖代谢和能量代谢方面也起着至关重要的作用，尤其体现在维持血糖水平的平衡上，通过合成和分解糖原，肝脏可动态调控血糖水平。它也是ATP酶的主要合成场所，直接影响着细胞内的能量代谢，此外，ATP酶的活力水平也通常被视为评估机体代谢状态的关键指标^[16]。本次研究发现，在后肢去负荷模拟的微重力环境下，大鼠肝脏出现异常的糖原累积现象，这与先前Abraham等^[17]和Merrill等^[18]在真实太空飞行条件下所观察到的现象一致。本研究也同时发现Model组大鼠肝脏组织中Na⁺K⁺-ATP酶和Ca²⁺Mg²⁺-ATP酶活力显著降低，而经白藜芦醇处理后，糖原含量恢复至正常水平，同时ATP含量和酶活力显著升高。

为了探究白藜芦醇发挥调节作用的具体作用机制，研究特别针对PI3K/AKT信号通路的潜在影响开展实验。结果提示，Model组大鼠肝脏组织中PI3K和AKT磷酸化水平显著降低，而白藜芦醇则显著升高了PI3K和AKT的磷酸化水平，提示白藜芦醇可能通过激活PI3K/AKT信号途径来发挥其保护作用，但具体是否通过激活PI3K/AKT信号通路来减轻大鼠肝脏组织的凋亡、氧化应激、炎症反应以及调节能量代谢，仍需进一步深入研究以确认。

综上所述，长时间的后肢去负荷可导致大鼠肝脏组织氧化应激、炎症因子和凋亡水平升高，能量代谢紊乱等，而白藜芦醇的介入对上述现象具有一定程度的缓解作用。这些发现为白藜芦醇在太空医学领域的应用提供了新的机制解释，并为未来的研究提供了新的方向和希望。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：轩莹莹进行了本次实验的实验设计、数据处理和论文撰写，杨玉田和唐汉琴参与了实验设计和论文撰写，马智慧和李亮协助数据采集、处理和分析并参与了文章修订，申栋帅和张梅提供了实验设备、技术和资金支持，陈克明对本实验进行了全程指导并对文章进行了审校。

伦理声明：本研究通过了中国人民解放军联勤保障部队第940医院科研管理伦理委员会的审批（批文编号：2023KYLL337）。

Funding Statement

甘肃省自然科学基金实验动物专项（23JRRA536，22JR5RA023）

The Natural Science Foundation of Gansu Province; The Natural Science Foundation of Gansu Province