基于术前CT影像组学模型预测透明细胞肾细胞癌患者的Ki-67表达

Abstract

Objective

Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of renal cell carcinoma (RCC), and developing personalized treatment strategies is crucial for improving patient prognosis. This study aims to develop and validate a preoperative computer tomography (CT) radiomics-based predictive model to estimate Ki-67 expression in ccRCC patients, thereby assisting in clinical treatment decisions and prognosis prediction.

Methods

A retrospective analysis was conducted on 214 ccRCC patients who underwent surgical treatment at Gansu Provincial Hospital between January 2018 and November 2023. Patients were classified into high Ki-67 expression (n=123) and low Ki-67 expression (n=91) groups based on postoperative immunohistochemical staining results. The dataset was randomly divided in a 7꞉3 ratio into a training set (n=149) and a validation set (n=65). Preoperative contrast-enhanced urinary CT images and clinical data were collected. After preprocessing, 5 mm arterial-phase CT images were manually segmented layer by layer to delineate the region of interest (ROI) using ITK-SNAP 3.8 software. Radiomic features were then extracted using the FeAture Explorer (FAE) package. Dimensionality reduction and feature selection were performed using the least absolute shrinkage and selection operator (LASSO) algorithm, yielding the optimal feature set. Three classification models were constructed using logistic regression (LR), multilayer perceptron (MLP), and support vector machine (SVM). The receiver operating characteristic (ROC) curve, area under the curve (AUC), decision curve analysis (DCA), and calibration curves were used for model evaluation.

Results

A total of 107 radiomic features were extracted from 5 mm arterial-phase CT images, and twenty-one features significantly associated with Ki-67 expression were selected using the LASSO algorithm. Predictive models were developed using LR, MLP, and SVM classifiers. In the training and validation sets, the AUC values for each model were 0.904 (95% CI 0.852 to 0.956) and 0.818 (95% CI 0.710 to 0.926) for the LR model, 0.859 (95% CI 0.794 to 0.923) and 0.823 (95% CI 0.716 to 0.929) for the MLP model, and 0.917 (95% CI 0.865 to 0.969) and 0.857 (95% CI 0.760 to 0.953) for the SVM model. DCA demonstrated that all models had good clinical net benefit, while calibration curves indicated high accuracy of the predictions, supporting the robustness and reliability of the models.

Conclusion

A CT radiomics-based model for predicting Ki-67 expression in ccRCC was successfully developed. This model provides valuable guidance for treatment planning and prognostic assessment in ccRCC patients.

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是最常见的原发性肾恶性肿瘤，约占全球确诊癌症的2%^[1]。其中透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是最常见的亚型，约占RCC的75%。尽管大多数ccRCC患者在初始诊断时接受根治性肾切除术或部分肾切除术^[2]，但仍有约25%的患者出现疾病复发和转移^[3]。因此准确预测患者的预后对于制订有效的治疗计划至关重要，不仅能促进个性化医疗方案的选择，还能显著提高患者的生存率及生活质量。

Ki-67是一种在细胞周期活跃阶段表达但在静止状态下缺失的核蛋白，参与调控有丝分裂中核仁分离、核糖体核糖核酸(ribosomal ribonucleic acid，rRNA)合成等关键过程^[4]。作为衡量肿瘤增殖活性的重要生物标志物之一，Ki-67表达水平已被广泛用作预测多种实体瘤的恶性程度和预后，并显示出良好的预测性能^[5-8]。在ccRCC中，Ki-67高表达与较严重的TNM分期、Fuhrman分级及较短的总生存期(overall survival，OS)和无病生存期(disease-free survival，DFS)相关联^[9-10]。尽管Ki-67被认为是评估RCC风险的重要因素，但传统的Ki-67检测方法依赖于组织样本进行免疫组织化学染色分析，存在侵入性高、重复性差等问题。因此，开发一种非侵入性且可重复使用的方法监测Ki-67水平尤为重要。

影像组学作为一种新兴算法，能够从医学图像中提取大量高通量成像特征，为临床提供了传统肉眼观察所无法获得的信息^[11-13]。该技术的出现使基于影像组学特征对肿瘤进行无创评估成为可能，目前影像组学已广泛应用于肿瘤学研究，而现有的运用影像组学技术预测肿瘤患者Ki-67表达水平的研究主要聚焦于乳腺癌^[14]、膀胱癌^[15]、肝细胞癌^[16]、肺癌^[17-18]等，ccRCC中此类研究很少。本研究基于计算机断层扫描(computer tomography，CT)影像组学构建预测ccRCC患者Ki-67表达水平的预测模型，用于ccRCC中Ki-67表达状态的术前评估和预后预测。

1. 资料与方法

1.1. 病例收集

在甘肃省人民医院(以下简称“本院”)病历系统筛选2018年1月至2023年11月在本院行手术治疗的肾恶性肿瘤患者，纳入标准：1)术后病理确诊ccRCC；2)术前1个月内在本院行泌尿系统增强CT检查；3)术前未进行任何治疗前干预；4)临床和影像学资料齐全。排除标准：1)CT图像质量不佳(可能导致图像分割的不精确性)；2)存在远处转移或并发其他病灶；3)术后免疫组织化学染色结果不全。经筛选，最终有214例ccRCC患者纳入本项研究。收集入组患者的一般资料和临床资料，采用标准方法记录。CT图像来自本院影像科。本研究经本院医学伦理委员会批准(审批号：2024-280)。

1.2. Ki-67数据处理

Ki-67数据来自本院病理科出具的病理报告，根据既往研究^[19-20]及纳入本研究患者Ki-67表达的数据分布，本研究选取5%作为截断值，高于5%纳入 Ki-67高表达组(n=123)，低于5%纳入Ki-67低表达组(n=91)。

1.3. CT图像采集

本研究纳入的患者均接受IQon spectral CT(荷兰飞利浦公司)增强扫描，使用双头高压注射器通过肘部正中静脉注射碘克沙醇(320 mgI/mL)，剂量为 1.5 mL/kg，注射速率为3.5 mL/s，随后以相同速率注入50 mL生理盐水。在注射后的25~30 s采集动脉期图像，60~70 s采集静脉期图像，240 s采集延迟期图像。采集的图像上传至RSP Nebula工作站进行后续处理。本研究使用的图像关键参数：层厚5 mm动脉期CT，管电压120 kV，自动毫安秒，矩阵为512×512，螺距0.953，旋转速度0.5 s/圈。

1.4. 图像分割和特征提取

首先收集符合标准的患者的CT图像资料，由于动脉期图像可提供比静脉期和平扫期图片更高的对比度，有助于区分正常组织和病变组织，可以更好地观察肿瘤的边界、轮廓和血供情况，因此选用 5 mm动脉期CT图像进行模型构建。将CT图像以DICOM的格式导入ITK-SNAP软件(3.8版)，挑选出层厚5 mm的动脉期CT作为研究对象，经图像归一化处理以确保图像的一致性^[21]。然后由1名具有5年泌尿系统肿瘤诊断经验的影像科主治医师(医师1)使用ITK-SNAP软件在预处理后的CT图像中沿肿瘤边缘全手动逐层勾画感兴趣区(region of interest，ROI)(图1)，最后由1名具有10年泌尿系统肿瘤诊断经验的副主任医师(医师2)复核ROI勾画的准确性，意见不一致时协商达成一致。1个月后随机选择30个病例，由医师1和医师2再次勾画ROI，使用组内相关系数(intra-class correlation coefficient，ICC)评估观察者间和观察者内的影像组学特征提取可重复性和一致性，ICC值的范围从0到1，数值越接近1表示再现性越强，ICC值>0.8表明特征可再现。使用FeAture Explorer(FAE)^[22]工具包提取特征，特征种类包括一阶直方图特征(first order statistics)、形态学特征(shape-based)、灰度共生矩阵(gray level cooccurrence matrix，GLCM)、灰度游程矩阵(gray level run length matrix，GLRLM)、灰度大小区域矩阵(gray level size zone matrix，GLSZM)、灰度依赖矩阵(gray level dependence matrix，GLDM)、相邻灰度差矩阵(neighbourhood gray-tone difference matrix，NGTDM)。

图1.

感兴趣区勾画

Figure 1 ROI delineation

A: CT image post N4 bias field correction; B: Manually delineated ROI; C: Volume of the ROI. ROI: Region of interest; CT: Computer tomography.

1.5. 特征筛选及预测模型构建

采用零-均值(Z-score)标准化法，应用Z-score转换公式，使得每个特征转换后的特征值均值接近于0，标准差接近于1，以消除原始特征中的量纲影响，提高模型训练的效率和准确性。采用Spearman相关系数以评估不同特征之间的关联程度，选择最具代表性或最相关的特征，特征相关系数高于0.9被视为可靠，筛选出最优特征集用于后续分析。将选择的特征使用最小绝对收缩与选择算子(least absolute shrinkage and selection operator，LASSO)回归算法进行降维，筛选出精确度最佳的特征组合，并进行多次迭代来评估每个特征的重要性。随机将患者按照7꞉3的比例分为训练集(n=149)和验证集(n=65)，基于Logistic回归算法分别利用逻辑回归(logistic regression，LR)、多层感知器(multilayer perceptron，MLP)和支持向量机(support vector machine，SVM)分类器构建预测模型。采用敏感度、特异度和受试者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线下面积(area under the curve，AUC)评估模型的性能。

1.6. 统计学处理

采用R软件(4.3.1版本)及SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。分类变量以频数和百分比表示，采用χ ²检验分析。采用Shapiro-Wilk检验进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，采用独立样本t检验分析；非正态分布的计量资料以中位数(第1四分位数，第3四分位数)表示，采用Mann-Whitney U检验分析。采用R软件绘制ROC曲线、校准曲线、决策曲线分析(decision curve analysis，DCA)对模型进行评价。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. 一般资料

训练集和验证集中2组患者基线特征详见表1。统计分析结果显示，2组在Ki-67、性别、年龄等基线特征方面差异均无统计学意义(P>0.05)，表明训练集与测试集在基线特征上具有良好的一致性，适合用于模型的构建与验证。其中Ki-67高表达123例和Ki-67低表达91例。

表1.

2组患者的临床特征

Table 1 Clinical characteristics of the 2 groups of patients

组别	n	Ki-67/[例(%)]		性别/[例(%)]		年龄/岁	总蛋白质/ (g·L-1)
		高表达	低表达	女	男
训练集	149	84(39.3)	65(30.4)	57(26.6)	92(43.0)	57(49, 67)	67.36±8.15
验证集	65	39(18.2)	26(12.1)	24(11.2)	41(19.2)	61(50, 68)	66.32±7.76
χ 2/t/U		0.240*		0.030*		-1.062†	-0.872‡
P		0.622		0.853		0.287	0.384

组别	白蛋白/(g·L-1)	碱性磷酸酶/(U·L-1)	FAR	血肌酐/(μmol·L-1)	纤维蛋白原/(g·L-1)
训练集	40.1(36.1, 43.4)	75(61, 92)	0.083(0.066, 0.109)	70.6(60.2, 84.8)	3.14(2.79, 4.29)
验证集	39.8(36.7, 43.2)	76(64, 83)	0.075(0.062, 0.103)	70.8(60.1, 85.0)	2.99(2.56, 3.91)
χ 2/t/U	-0.023†	-0.062†	-1.116†	-0.046†	-1.581†
P	0.982	0.950	0.264	0.964	0.114

组别	白细胞/(×109·L-1)	中性粒细胞/(×109·L-1)	淋巴细胞/(×109·L-1)	单核细胞/(×109·L-1)	红细胞/(×109·L-1)
训练集	6.2(5.1, 7.7)	3.93(3.03, 5.46)	1.45(1.05, 1.92)	0.46(0.36, 0.59)	4.63(4.17, 5.15)
验证集	6.2(4.9, 7.4)	3.76(2.99, 5.64)	1.39(1.08, 1.81)	0.44(0.37, 0.63)	4.67(4.23, 5.09)
χ 2/t/U	-0.645†	-0.359†	-0.609†	-0.231†	-0.180†
P	0.519	0.720	0.543	0.818	0.857

组别	血红蛋白/(g·L-1)	血小板/(×109·L-1)	体重指数/(kg·m-2)	SII
训练集	140.52±25.90	212(163, 266)	23.51(21.45, 25.96)	578.08(355.77, 1022.70)
验证集	141.58±21.79	194(153, 243)	24.22(21.63, 26.73)	538.50(337.26, 1029.20)
χ 2/t/U	0.289‡	-1.084†	-0.756†	-0.269†
P	0.773	0.278	0.450	0.788

分类变量以频数和百分比表示；符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示；非正态分布的计量资料以中位数(第1四分位数，第3四分位数)表示。*χ ²值；†U值；‡t值。SII：系统免疫炎症指数，SII=血小板计数×中性粒细胞计数/淋巴细胞计数；FAR：纤维蛋白原与白蛋白比值。

2.2. 影像组学特征筛选及模型构建

采用FAE工具包对勾画的ROI进行影像组学特征提取，共提取到107个原始影像组学特征。采用LASSO法进行特征选择(图2A、2B)，筛选出21个与Ki-67表达密切相关的影像组学特征(图2C)。基于这些被选中的特征，分别采用LR、MLP、SVM分类器建立预测模型。

图2.

特征提取及筛选

Figure 2 Feature extraction and selection

A: Plot of Lambda value and variation of feature coefficient in LASSO regression feature selection. B: Cross-validation error plots in feature selection for LASSO regression. C: Imaging histologic features and coefficients screened by the LASSO model. LASSO: Least absolute shrinkage and selection operator; MSE: Mean squared error; GLDM: Gray level dependence matrix; GLSZM: Gray level size zone matrix; NGTDM: Neighbourhood gray-tone difference matrix; GLCM: Gray level cooccurrence matrix; GLRLM: Gray level run length matrix; Shape: Shape-based; Firstorder: First order statistics.

2.3. 模型结果及评价

LR模型、MLP模型、SVM模型在训练集中的AUC分别为0.904(95% CI 0.852~0.956)、0.859(95% CI 0.794~0.923)、0.917(95% CI 0.865~0.969)，在验证集中的AUC分别为0.818(95% CI 0.710~0.926)、0.823(95% CI 0.716~0.929)、0.857(95% CI 0.760~0.953)(图3)，3种模型在训练集和验证集中都表现出良好的预测性能。通过临床DCA(图4)和校准曲线(图5)进一步证实了这些模型的有效性，3种模型不仅在准确率上表现良好，而且在其他关键指标如敏感度、特异度以及F1分数等方面也都表现出色(表2)。研究结果表明基于5 mm动脉期CT的影像组学模型能够有效预测ccRCC患者Ki-67的表达。

图3.

基于3种模型预测ccRCC患者Ki-67表达水平的ROC曲线

Figure 3 ROC curves for predicting Ki-67 expression levels in ccRCC patients based on the 3 models

A: LR model; B: MLP model; C: SVM model. ccRCC: Clear cell renal cell carcinoma; ROC: Receiver operating characteristic; LR: Logistic regression; MLP: Multilayer perceptron; SVM: Support vector machine. Train: Training set; Test: Test set.

图4.

基于3种模型预测ccRCC患者Ki-67表达水平的DCA

Figure 4 DCA for predicting Ki-67 expression levels in ccRCC patients based on the 3 models

A: LR model; B: MLP model; C: SVM model. ccRCC: Clear cell renal cell carcinoma; DCA: Decision curve analysis; LR: Logistic regression; MLP: Multilayer perceptron; SVM: Support vector machine.

图5.

基于3种模型预测ccRCC患者Ki-67表达水平的校准曲线

Figure 5 Calibration curves for predicting Ki-67 expression levels in ccRCC patients based on the 3 models

A: LR model; B: MLP model; C: SVM model. ccRCC: Clear cell renal cell carcinoma; LR: Logistic regression; MLP: Multilayer perceptron; SVM: Support vector machine.

表2.

3种模型的预测效能

Table 2 Prediction performance of the 3 models

模型名称	分组	n	准确率	AUC	95% CI	敏感度	特异度	阳性 预测值	阴性 预测值	精确度	召回率	F1分数	阈值
LR	训练集	149	0.862	0.904	0.852~0.956	0.854	0.868	0.863	0.858	0.863	0.854	0.858	0.495
	验证集	65	0.762	0.818	0.710~0.926	0.712	0.813	0.786	0.742	0.786	0.712	0.747	0.614
MLP	训练集	149	0.832	0.859	0.794~0.923	0.821	0.842	0.832	0.830	0.832	0.821	0.826	0.469
	验证集	65	0.808	0.823	0.716~0.929	0.727	0.891	0.857	0.780	0.857	0.727	0.786	0.539
SVM	训练集	149	0.885	0.917	0.865~0.969	0.892	0.888	0.885	0.888	0.885	0.885	0.882	0.500
	验证集	65	0.823	0.857	0.760~0.953	0.758	0.891	0.862	0.800	0.862	0.758	0.807	0.500

LR：逻辑回归；MLP：多层感知器；SVM：支持向量机；AUC：曲线下面积；CI：置信区间。

3. 讨 论

本研究利用5 mm动脉期CT图像提取并筛选出21个影像组学特征，基于LASSO回归算法构建3种影像组学模型预测ccRCC患者Ki-67的表达。研究结果显示：LR模型在训练集和验证集的AUC分别为0.904和0.818，MLP模型在训练集和验证集的AUC分别为0.859和0.823，SVM模型在训练集和验证集的AUC分别为0.917和0.857。3种模型都有较好的预测性能，实现了术前非侵入性预测ccRCC患者Ki-67的表达，有助于指导临床治疗，并估计患者的预后。

Ki-67在肾癌的发生、治疗和预后中扮演重要角色。研究^[23-24]表明Ki-67能够提供有关肿瘤组织学和分期的重要信息。Dudderidge等^[25]研究指出，Ki-67作为肾癌的独立预后标志物，可以单独或与其他标志物如存活素B7-H1^[26]、碳酸酐酶IX^[27]和磷酸化S6蛋白(pS6)^[28]等联合使用预测患者预后。此外，Ki-67标志物^[29]还可用于区分ccRCC不同的转移情况，例如无转移、原发性转移和晚期转移。当前，肾癌的预后主要取决于肿瘤的大小、分期和分级等因素，由于缺乏对肾癌生物学异质性的深入理解，这在一定程度上阻碍了临床上为肾癌患者提供更精准的治疗选择，并限制了改善患者预后的可能性。Kim等^[28]和Gayed等^[30]的研究表明：Ki-67高表达与较低的5年DFS和高复发率相关，对于术后免疫组织化学染色提示Ki-67高表达的患者需要密切随访，制订个体化的治疗方案以改善患者的预后。这说明Ki-67在肾癌预后中具有潜在作用。因此，开发一种无创性可重复地评估肾癌患者Ki-67表达水平的技术，对于指导临床治疗和改善患者预后具有重要意义。

影像组学的出现使得对肿瘤分子特征进行非侵入性评估成为可能。通过CT图像提取原始影像组学特征，分析肿瘤的形态、大小及其边缘特性，评估其生长模式和侵袭程度，同时深入探究肿瘤内部的密度与强度变异，以揭示其微观结构组织和潜在的生物学行为。这种综合性的信息能够更全面地反映Ki-67水平，有助于更准确地预测肿瘤的生物学行为。通过影像组学技术预测Ki-67表达水平是一种非侵入性的方法，无需取得组织样本或进行生物标志物检测，从而显著减少了患者的不适和风险，同时可以实现高度可重复性的监测。Ki-67作为细胞增殖的标志物，其在ccRCC中的高表达提示肿瘤具有更强的侵袭性和转移潜力^[31]，如肿瘤大片坏死、国际泌尿病理学学会(international society of urological pathology，ISUP)分级系统中核分级高、血管生成增多等，这些特点在CT图像上与Ki-67低表达的肿瘤可能存在差异。通过影像组学预测Ki-67，可以为临床医师提供额外的辅助信息，帮助制订更精准的治疗方案和预后评估。本研究利用影像组学技术深入分析了ccRCC患者Ki-67不同表达水平在CT图像上的形态、密度和纹理差异，以此预测个体患者的Ki-67表达水平，从而为制订个性化医疗方案和精准治疗策略提供有力支持，为肿瘤生物学研究和临床实践带来了新的视角和可能性。影像组学在评估肿瘤特性方面展现出巨大潜力，特别是在预测Ki-67表达水平上的应用，为提高癌症诊断的准确性和治疗水平开辟了新的路径。

国内外通过影像组学预测肿瘤患者Ki-67表达水平的研究已有很多，然而在ccRCC方面的相关研究相对较少。Zhou等^[32]利用基于双参数磁共振成像的影像组学机器学习(machine learning，ML)模型，成功预测了前列腺癌中Ki-67的表达和Gleason分级分组系统(GGGs)，与谯孝凤等^[33]的研究结果相同。另外，Qian等^[34]则通过构建基于超声影像组学的模型，预测了肝细胞癌患者Ki-67的表达，这种方法为临床诊疗提供了更详尽的疾病图像，有望改善患者的预后和治疗策略。而Zheng等^[15]则利用基于术前磁共振成像的影像组学模型预测了膀胱癌中Ki-67的表达，显示出令人满意的诊断性能，对临床决策具有潜在的价值。在ccRCC中，Li等^[35]在一项多中心研究中通过构建影像组学列线图的方式预测ccRCC患者的Ki-67表达水平并进一步分析其对患者预后的影响，结果显示影像组学列线图可以准确预测Ki-67的表达水平，且对患者预后有较强的预测能力。本研究基于术前CT影像构建影像组学模型，用以预测ccRCC患者Ki-67表达水平的高低，3种模型均展现出良好的预测效能，有助于指导临床治疗决策，并评估患者的预后情况。

本研究构建了基于LR、MLP、SVM分类器的3种预测模型，并深入分析了它们各自的性能特点。LR分类器以其简单性和强解释性脱颖而出，易于理解和实现，为影像组学任务提供了一个直观且有效的基准^[36]；MLP分类器则以其深层结构和端到端学习方式为特色，能够自动从原始数据中学习复杂的特征表示，展现出强大的学习能力；而SVM分类器则凭借其坚实的理论基础和卓越的非线性建模能力，通过核技巧有效处理高维数据，在复杂数据集上表现出色^[37]。本研究结果显示，LR模型在训练集上的AUC为0.904，表现出色，但在验证集上的AUC仅为0.818，提示可能存在一定的过拟合现象，即在未见过的数据上表现不佳，这可能与LR模型在处理复杂非线性关系时的局限性有关；相比之下，MLP模型在训练集和验证集上的表现相对稳定，AUC分别为0.859和0.823，展现出较好的泛化能力，但相比LR和SVM而言，其性能稍显逊色，可能未能充分利用数据特征；SVM模型则在训练集和验证集上都表现出色，AUC分别为0.917和0.857，不仅表现出色且泛化能力较强，尽管验证集AUC略低于训练集，但波动范围小，整体性能稳定。综合评估3种模型的性能，SVM模型在各方面表现较为均衡，适合实际应用场景的需求。因此，在实际应用中优先考虑使用SVM模型进行影像组学的分析和预测。

本研究存在局限性。首先，由于本研究是一项回顾性研究，可能引入了选择偏差，并且样本量相对较小，未来需要进行更大样本量的前瞻性多中心研究以验证本研究的结果，使其能够在临床实践中得到应用。其次，本研究使用手动勾画的二维ROI来进行影像组学特征提取。然而，三维分析能更好地反映肿瘤的异质性。期待未来能有半自动化或全自动化软件来识别CT图像中的肿瘤区域，从而实现更精确的三维分割。最后，本研究未对患者的生存预后进行分析以验证模型的临床适用性。未来的工作将继续跟踪这些样本并记录生存数据以进一步验证模型。

综上所述，建立基于CT影像组学的ccRCC患者Ki-67表达预测模型，有助于指导临床医师制订ccRCC患者的治疗方案，并改善患者的预后。

基金资助

甘肃省自然科学基金(22JR5RA650)；甘肃省人民医院院内科研基金(23GSSYD-12)。This work was supported by the Natural Science Foundation of Gansu Province (22JR5RA650) and the Gansu Provincial Hospital Intramural Research Fund (23GSSYD-12), China.

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

杨志军 研究设计，数据处理，论文撰写；何涵、王佳、张文博 数据收集与处理；张云峰 研究设计，论文审校；周逢海 论文指导。论所有作者阅读并同意最终的文本。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/2024111722.pdf