水凝胶促进创面血管化的研究进展

Abstract

High glucose-induced vascular endothelial cell injury serves as a primary pathological factor contributing to delayed healing of diabetic wounds. Effective wound vascularization remains a core challenge in tissue engineering research. Hydrogel-based injectable technology and three-dimensional (3D) bioprinting technology, through synergistic innovation of biomaterials and advanced manufacturing processes, enable precise construction of bionic tissue structures, laying the foundation for functional organ replacement. This review focuses on discussing the synergistic strategies of injectable hydrogels and 3D bioprinted hydrogels in tissue engineering vascularization, as well as the clinical translation of intraoperative bioprinting and its synergistic vascularization strategies, which is currently in urgent need of development. These advancements are expected to provide novel strategies for the repair of diabetic wounds.

糖尿病是一种慢性代谢性疾病, 全球近4.63亿成年人受其影响^[1]。由于人口老龄化加剧, 糖尿病的发病率持续提高, 大约1/4的糖尿病患者发展为糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer, DFU）^[2]。目前针对DFU的治疗是在积极控制血糖的同时, 应用抗菌药物及各类生长因子、富血小板血浆和富血小板纤维蛋白等换药或外科清创后植皮及皮瓣修复, 但治疗效果仍不尽如人意^[3-4]。与非糖尿病创面不同, 糖尿病创面由于高糖诱导的内皮细胞损伤和细胞器功能障碍, 血管生成的启动受到损害, 造成创面血管生成不良及组织缺氧, 并激活炎症级联反应, 从而阻碍创面愈合进程^[5]。因此, 促进血管生成是治疗糖尿病创面的关键。

水凝胶作为湿性敷料, 基于湿性愈合理论及其与ECM结构相似的特点, 在创面愈合领域较传统敷料治疗DFU效果更佳^[6]。多糖^[7]、多肽^[8]和蛋白质^[9]等天然聚合物制备的具有高生物相容性的预成型水凝胶, 具有优良的生物相容性和可降解性, 为生物体细胞黏附生长及血管生成提供了有效支撑。然而, 难以控制的膨胀性和较差的机械性能大大限制了水凝胶在体内的长期应用, 特别是在复杂的创面环境中, 预成型水凝胶无法提供与创面紧密契合的外形^[10]。作为植入材料, 可注射及三维生物打印水凝胶比预成型水凝胶更有优势, 因为它们的可编程性能够帮助它们迅速适应创面形状并有效促进创面血管化^[11]。功能化水凝胶和组织工程血管化策略之间的协同耦合是至关重要的, 因为血管化通过提供有效的血流灌注来提高组织的活力和功能, 而可注射性和三维打印性能可以创建高度专业化的、组织特定的血管网络^[12]。因此, 开发和优化满足可注射性和三维打印性能的生物墨水, 包括合适的生物材料、细胞源和生物活性因子也是重要的一环^[13]。为了指导未来的研究, 本文对可注射水凝胶与三维生物打印水凝胶在组织工程血管化中的协同策略、目前亟待发展的术中生物打印（intraoperative bioprinting, IOB）及其协同血管化策略的临床转化进行综述。

1. 血管生成策略

在芽生过程中, 细胞分泌的蛋白水解酶降解基底膜, 使内皮细胞暴露于富含Ⅰ型胶原和弹性蛋白的ECM, 启动血管生成。内皮顶端细胞（endothelial tip cell）位于血管分支最前端且高度极化, 伸出大量丝状伪足探索微环境信号, 并通过前端区域的黏附作用与后部区域的去黏附作用实现机械力传导, 最终引导细胞定向迁移。内皮柄细胞紧接其后增殖形成高通透性新生血管, 随后通过血流灌注稳定、基底膜沉积和周细胞等壁细胞的募集逐步实现血管重塑。经修剪重塑后, 新生血管最终形成具有层级结构的稳定脉管网络。需要特别注意的是, 此过程中ECM刚度可通过激活Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物-Yes相关蛋白信号轴, 同时调控细胞间连接, 正向调节顶端细胞分化及血管生成进程^[14]。目前, 大量基于血管生成相关影响因素的功能化水凝胶敷料受到关注。

1.1. 基于生长因子的血管生成策略

新生血管出芽式生成（sprouting angiogenesis）是由多种血管生成因子协同调控的病理生理过程, 此类因子在缺血、缺氧及炎症微环境中呈现特征性高表达。VEGF通过激活管腔形成、内皮细胞-壁细胞协同组装及微血管成熟等关键信号通路, 系统调控血管网络形态构建, 从而驱动功能性血管生成。此外, 酸性FGF、碱性FGF、TGF-β、血管生成素和EGF等也直接或间接协同促进血管成熟, 需要关注的是, 血小板源性生长因子可通过壁细胞的招募, 产生血管生成素-1来加强内皮细胞-内皮细胞连接, 促进新生血管的稳定^[15]。研究者利用二甲双胍、FGF21和聚乙烯醇制备了活性氧响应性FGF21/二甲双胍可注射水凝胶, 该水凝胶可在清除活性氧的同时, 通过上调血管生成素-1表达来募集内皮祖细胞进而促进血管生成, 最终促进糖尿病创面修复^[16]。Nuutila等^[17]利用原位打印技术, 将含有VEGF的甲基丙烯酸酐化明胶（gelatin methacrylate anhydride, GelMA）水凝胶打印到猪创面中。体外和体内实验结果均表明, 该支架可持续释放VEGF, 促进血管内皮细胞在体外的迁移, 并显著提高了创面的愈合质量。

1.2. 基于体细胞和干细胞及其衍生物的血管生成策略

细胞疗法递送的细胞可以自发分泌细胞因子或通过基因工程释放大量特定分子, 从而增强血管生成、抗炎和抗凋亡, 最终促进组织的自我修复^[18]。学者基于硫化γ-聚谷氨酸-甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚体系, 构建负载过表达VEGF165的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC）功能化水凝胶。实验表明, VEGF165的持续释放通过阻碍促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白诱导线粒体膜孔的形成, 从而减轻血管内皮细胞线粒体损伤和促进血管生成, 促进糖尿病大鼠创面愈合^[13]。Haase等^[19]建立的三维共灌注胎盘微血管模型揭示了周细胞通过酪氨酸激酶受体-2/血管生成素-2信号轴负调控Fb的促血管生成活性, 而外源性补充VEGF与FGF可逆转该抑制效应, 证实了生长因子-受体信号网络在微血管稳态中的核心作用。

细胞衍生物如外泌体通过调控生物活性分子表达及创面修复相关细胞间通讯, 发挥促血管生成、促胶原合成及抗炎等多重生物学效应, 现已成为再生医学研究热点^[20]。研究者将透明质酸-己二酸二酰肼/氧化海藻酸钠负载镁离子复合体系与人参源性工程化小细胞外囊泡悬浮液混合, 成功制备可注射水凝胶并应用于糖尿病小鼠背部全层皮肤缺损创面。在炎症阶段, 骨髓间充质干细胞被募集至创面部位并定向分化为神经源性细胞, 同时介导M2型巨噬细胞重编程, 提供促愈合的免疫微环境。在增殖阶段, 新分化神经细胞与镁离子通过神经-血管耦联机制协同激活神经再生与血管新生双向调控环路, 显著加速糖尿病创面修复进程^[21]。

随着更多生理相关器官类型培养平台的发展, 血管内皮细胞与特定组织细胞共培养已成为热门研究领域^[22]。例如, 内皮细胞和神经细胞的共培养已成为用于探索神经发育和相关疾病的模型^[23]。骨骼肌的功能也与血管功能密切相关, 肌细胞与血管内皮细胞的体外模型已在组织工程和再生医学领域被用来研究血管化肌肉组织的形成^[24]。这些研究为Wagner 4级以上伴有周围神经系统病变的DFU创面的治疗带来了希望。

1.3. 基于纳米材料的血管生成策略

近年来, 纳米材料因在促进血管生成方面的独特性质而在生物医学应用中受到重点关注。纳米材料不仅能作为血管生成相关蛋白及mRNA的高效递送载体, 还可模拟天然血管ECM中的纳米拓扑结构^[25]。该促血管生成特性通过增强血管新生相关基因表达, 协同调控复杂的血管形成过程, 进而促进组织再生及缺血性疾病治疗。如金纳米颗粒可高效递送VEGF, 并模仿天然血管ECM的纳米结构促进血管生长^[26]；氧化石墨烯等石墨烯衍生物与血管生成因子协同构建的功能化生物支架, 展现出巨大的促血管生成潜力^{[6, 27]}。

研究人员开发了负载Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶抑制剂Y-27632的纳米二氧化铈包覆型沸石咪唑酯骨架-8复合体系, 并将其封装于GelMA水凝胶中, 最终成功制备兼具抗菌、抗炎及促血管化功能的仿生复合水凝胶。体外实验证实, 该水凝胶可持续释放具有SOD与过氧化氢酶活性的纳米二氧化铈, 通过催化超氧阴离子自由基歧化及过氧化氢分解为氧气与水, 抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3/胱天蛋白酶-1/IL-1β炎症信号通路。同时, Y-27632通过修复氧化损伤的线粒体DNA改善免疫微环境血管生成功能, 从而加速糖尿病创面愈合^[28]。

另有学者将多巴胺修饰明胶、载铜聚多巴胺纳米颗粒（copper-loaded polydopamine nanoparticle, CuPDA NP）与苯基硼酸修饰透明质酸通过动态苯基硼酸酯键合, 构建具有良好可注射性、自愈性、黏附性及1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力的二甲双胍CuPDA NP复合水凝胶并应用于糖尿病SD大鼠背部全层皮肤缺损处。研究表明, 二甲双胍和透明质酸可抑制核因子κB信号通路从而显著减轻炎症反应, CuPDA NP通过清除过量活性氧及缓释铜离子实现高效抗菌（抗菌率 > 85%）, 其中铜离子可原位募集小鼠Fb（L929细胞）与HUVEC, 促进创面血管新生及ECM-胶原网络重构, 最终加速糖尿病创面愈合进程^[29]。

1.4. 复合血管生成策略

复合血管生成策略通过整合生长因子、体细胞/干细胞及其衍生物与纳米材料的多维调控优势, 在抗菌-抗炎-促血管生成协同作用中展现显著疗效^[30-31]。研究人员基于硫化γ-聚谷氨酸动态交联体系, 构建具有抗菌、活性氧清除、产氧及一氧化氮生成能力的多功能可注射水凝胶。将该水凝胶用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的糖尿病小鼠创面后, 转录组学分析表明超支化聚L-赖氨酸可抑制细菌群体感应系统, 下调毒力基因, 干扰细菌代谢从而有效杀伤耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；同时纳米酶级联催化清除活性氧和极化M2型巨噬细胞, 实现糖尿病感染创面的炎症-血管化微环境重构, 最终促进TGF-β介导的血管新生与胶原重塑, 加速糖尿病创面的愈合^[30]。

针对糖尿病创面微环境特征, 研究者通过复合血管生成策略设计pH值、活性氧、葡萄糖、酶、温度或光磁响应型可注射水凝胶, 结合三维打印技术开发具有时空控释特性的双/多阶段智能响应敷料, 已成为当前研究热点^[32]。研究人员利用N-异丙基丙烯酰胺、聚丙烯酸和甲基丙烯酸羟乙酯-丙交酯三亚甲基碳酸酯大分子单体构建温敏/pH双响应可注射水凝胶, 负载聚乙烯吡咯烷酮/过氧化氢与聚乳酸-羟基乙酸[poly（lactic-co-glycolic acid）, PLGA]共聚物核壳结构释氧微球。实验表明微球表面的过氧化氢酶可迅速将PLGA降解释放的过氧化氢转化为氧气, 显著提升移植心肌球源性干细胞存活率；该体系通过旁分泌途径抑制IL-6等炎症因子的表达, 上调相关生长因子的表达, 有效提高小鼠溃疡组织血管新生密度, 加速糖尿病创面愈合^[33]。Wu等^[34]基于创面愈合时序特征, 采用苯硼酸接枝氧化葡聚糖与咖啡酸接枝ε-聚赖氨酸构建pH/活性氧双响应糖肽水凝胶, 将具有促血管生成作用的芒果苷封装于pH响应胶束, 并将含双氯芬酸钠（diclofenac sodium, DS）的抗炎组分与芒果苷胶束共载于水凝胶不同空间位点。该体系通过pH/活性氧双响应特性实现DS与芒果苷的时序控释：炎症期释放咖啡酸接枝ε-聚赖氨酸与DS发挥杀菌抗炎作用并促进M2型巨噬细胞极化, 增殖期持续释放芒果苷促进血管新生。这种血管生成策略与生物打印技术的耦合应用, 为糖尿病创面个体化治疗提供了创新解决方案。

2. 预血管化策略

针对大面积皮肤缺损修复, 基于血管生成策略的功能化水凝胶因无法充分血管化而易在低氧微环境引发细胞坏死及细胞间通讯障碍^[35]。因此, 使用预先建立有血管网络的组织工程皮肤, 即预血管化策略或许更有优势。预血管化策略是指在将组织工程皮肤应用于创面修复之前, 将支架提前血管化的技术。

2.1. 体外预血管化策略

2.1.1. 直接生物打印技术

直接生物打印技术利用负载细胞的水凝胶作为生物墨水来主动和直接打印中空血管结构。研究人员根据所需组织类型混合不同的生物材料来制作生物墨水, 以优化组织机械强度和生物活性之间的平衡, 如最常用的GelMA生物墨水, 此外还包括基质墨水、支撑墨水和牺牲墨水等^[36]。研究者采用微尺度连续光学生物打印技术, 将HUVEC和间充质干细胞共载于明胶-甲基丙烯酰化透明质酸复合水凝胶及GelMA水凝胶体系, 并将其精确打印至预设血管通道内, 实现多细胞类型与生物材料成分的空间可控分布, 成功构建具有复杂三维微结构的预血管化组织。实验证实, 该体系在体外及体内均能自发形成管腔样结构与功能性内皮网络, 为复杂组织结构工程化构建提供了高效解决方案^[37]。还有学者基于挤压式生物打印技术开发同轴直接成型系统, 通过优化脱细胞人羊膜与海藻酸盐比例制备新型生物墨水, 并将负载HUVEC及交联剂氯化钙的墨水分别经鞘层-芯层双通道挤出, 实现可灌注三维血管网络的直接成型。研究显示, 优化生物墨水可显著增强HUVEC的增殖、迁移、管腔形成能力及VEGF受体-2表达水平；同时, 无微通道交联型墨水与含三维网状/内置微通道结构的打印血管相比, 在细胞存活率及小管形成密度方面比较差异均有统计学意义（P<0.05）, 证实了预血管化策略在大尺度工程化组织构建中的关键作用^[38]。

2.1.2. 间接生物打印技术

受重力影响和软水凝胶生物墨水的结构完整性和机械稳定性不足, 直接生物打印大型或精细组织结构面临着显著挑战。相较于直接打印, 间接生物打印通过牺牲墨水（逃逸墨水）嵌入或共打印至生物材料墨水后移除, 形成中空血管样结构并接种内皮细胞与平滑肌细胞, 在构建复杂结构方面展现了更高的自由度^[39]。嵌入式生物打印作为新兴间接策略, 涵盖全向打印、客体写入、颗粒凝胶介质、自由形式可逆嵌入悬浮水凝胶（fresh悬浮打印技术）、多材料嵌入式挤压打印、琼脂糖浆悬浮构建、牺牲写入功能性组织（swift技术）、体积生物打印等多元方法, 可实现复杂自由形态结构的精准构建^[40]。

研究人员整合fresh悬浮打印技术与swift技术, 创新性开发顺序打印-可逆墨水转化（sequential printing with transient reversible ink transformation, SPTRIT）技术体系。SPTRIT技术体系首先将人诱导多能干细胞封装在明胶/海藻酸钠水凝胶中制备微凝胶基生物墨水, 在微凝胶悬浮介质中利用牺牲墨水打印自由形态血管结构并接种HUVEC, 观察到细胞增殖后形成连续融合内皮层, 最终成功构建功能性血管模型。进一步实验采用微凝胶基生物墨水打印心室结构并诱导人诱导多能干细胞分化为心肌细胞, 随后以明胶为牺牲墨水, 通过固定打印速度和调控挤出速率实现分支管径梯度化调整, 最终构建含可灌注层级血管网络的心室模型。结果表明, 该血管网络在体外培养过程中显著提升工程化组织活性, 且SPTRIT技术可高效构建复杂器官几何形态与内部脉管系统, 为组织工程产品的生物医学转化提供创新技术支撑^[41]。

2.2. 体内预血管化策略

体内预血管化策略通过将水凝胶支架作为生物反应器预先植入高灌注组织（如大网膜、肾被膜或肌肉）, 借助机体血管自发长入支架完成血管网络构建。该策略中, 皮下部位因具备充足容量与操作便利性, 成为理想的预血管化移植位点^[42]。研究者在大鼠皮下植入聚己内酯聚合物微纤维组成的牺牲模板, 孵育后去除模板和细胞成分, 成功制备含平行微通道的ECM-通道支架。实验表明ECM-通道支架在体外可精密调控细胞行为, 体内植入后促进细胞增殖迁移、血管形成以及免疫调节；同时, 50~160 μm孔径支持毛细血管生长, 而孔径 > 140 μm为致密组织血管化的必需条件^[43]。

然而, 未经修饰的皮下空间血管分布不良, 其低氧合与代谢交换效率可能导致移植物存活率下降^[44]。如何在皮下位点预血管化期间最大限度保证移植支架的留存成了亟待解决的问题。刺激皮下空间早期血管生成的方法之一是将促血管生成细胞、生长因子和水凝胶支架共同移植, 这一策略已被证明能有效促进小鼠胰岛移植存活并逆转糖尿病^[45]。另一种方法是在移植前预制预血管化的皮下移植床。研究人员开发了一种“无装置”技术, 通过临时放置尼龙血管导管30 d, 将血运欠佳的皮下空间转化为可行的血管化移植床, 在移除血管导管后移植原代胰岛或人类胚胎干细胞衍生的胰腺内胚层细胞后观察到广泛的血管形成^[46]。类似地, 可利用聚己内酯支架、PLGA支架、Vicryl网状支架及silon单丝支架等合成材料的天然异物反应, 在皮下预诱导血管网络形成^[47]。这些生物材料联合预血管化策略显示出通过提供灵活性和多功能性来开发较大体积的组织或器官替代品的可能性。

3. IOB血管化策略

IOB, 也被称为体内或原位生物打印, 是指在外科环境中对活体受试者进行生物打印的过程, 有助于以解剖学上精确和准确的方式将生物医学制剂递送到缺损处^[48]。

IOB目前被用于各种组织的重建。研究人员开发移动式原位皮肤生物打印系统, 整合三维成像技术可根据创面尺寸与拓扑特征, 将含异体/自体真皮Fb及表皮KC的生物墨水精准沉积于裸鼠及猪全层皮肤缺损处, 实现创面原位快速修复。研究显示, 经IOB处理的动物模型术后3~6周可见KC与Fb活性维持良好, 术后10~14 d完成表皮-真皮双层重建, 证实该技术具有经济高效的临床转化潜力^[49]。另一研究采用IOB技术修复大鼠全层皮肤缺损, 设计双层生物墨水体系：真皮层使用负载大鼠原代真皮Fb的软组织墨水, 表皮层采用含角质细胞生长因子的胶原蛋白-纤维蛋白原复合软组织墨水。术后4周组织学分析显示再生皮肤具备致密胶原排列与成熟血管网络, 波形蛋白及角蛋白免疫组织化学染色证实皮肤附属器成功再生^[50]。

尽管IOB技术在器官原位重建领域取得突破, 但其临床转化仍面临关键挑战。首先, 现有技术侧重宏观组织形态重建而忽视微脉管系统构建, 导致血运重建效率有限^[51]。其次, 当前IOB血管化策略多依赖外源性血管生成因子或宿主血管侵入, 难以实现可灌注血管网络的原位成型。因此可将内皮细胞/间充质干细胞与微穿孔技术整合, 通过“生物打印-外科干预”协同策略促进快速血管化；此外, 还可开发含预成型脉管通道的生物墨水体系, 结合梯度交联技术维持打印后通道通畅性。这些改进有望推动IOB技术构建血管化且功能完善的组织器官。

4. 总结与展望

三维生物打印技术的突破性进展为组织工程、再生医学及临床疾病治疗领域开辟了前景广阔的发展路径。可注射水凝胶与生物打印技术耦合的血管化策略在糖尿病复杂创面修复中展现出巨大应用潜力。未来研究工作应聚焦于生物墨水配方的精准优化, 实现特定组织内血管生成的可控调控。此外, 工程化血管网络的长期功能维持及宿主循环整合机制阐明、仿生级三维培养体系开发以突破二维-体内微环境差异壁垒, 仍是该领域亟待突破的核心挑战。随着生物打印逐步成为组织工程研究的基础工具, 其与血管化策略的深度整合将推动创面修复从结构重建向功能再生跨越。

Funding Statement

国家自然科学基金地区科学基金项目（82360444）；甘肃省高校产业支撑项目（2023CYZC-02）

Regional Science Foundation Program of National Natural Science Foundation of China (82360444); Gansu Province University Industry Support Project (2023CYZC-02)