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. 2025 Jun 20;41(6):559–568. [Article in Chinese] doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20240925-00348

人真皮毛乳头细胞来源的细胞外囊泡对小鼠皮肤纤维化的影响及其机制

Influence and mechanism of extracellular vesicles derived from human dermal papilla cells on skin fibrosis in mice

王 运帷 1, 蔡 飞宇 1, 石 傲 1, 康 宇晨 1, 赵 若梅 1, 胡 智瀚 1, 邸 晓宇 1, 刘 毅 1,*
PMCID: PMC12242940  PMID: 40588404

Abstract

目的

探究人真皮毛乳头细胞（hDPC）来源的细胞外囊泡（hDPC-EV）对小鼠皮肤纤维化的影响及其机制。

方法

该研究为实验研究。收集2024年9月于兰州大学第二医院行毛发移植手术的2例分别为25、40岁的男性患者的100个废弃的毛囊单位，提取原代hDPC并成功鉴定。取第3~5代hDPC，培养后提取hDPC-EV并成功鉴定。采用实时荧光定量反转录PCR（RT-PCR）法检测hDPC和hDPC-EV中微小RNA-182-5p（miRNA-182-5p）的表达（样本数为4）。取30只6周龄雄性C57BL/6J小鼠，皮内注射博来霉素4周制作小鼠皮肤纤维化模型。采用随机数字表法（后续分组方法同此）选取6只造模后的小鼠，另取6只健康未处理6周龄雄性C57BL/6J小鼠，采用蛋白质印迹法检测小鼠正常皮肤组织与纤维化皮肤组织中转化生长因子β1（TGF-β1）的蛋白表达（样本数为3）。将剩余24只造模后的小鼠分为磷酸盐缓冲液（PBS）+miRNA模拟物对照组、细胞外囊泡（EV）+miRNA模拟物对照组、EV+miRNA抑制剂组、miRNA模拟物组（每组6只），分别于注射与组名相对应的试剂2周后，采用蛋白质印迹法检测纤维化皮肤组织中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ⅰ型胶原的蛋白表达（样本数为3），采用实时荧光定量RT-PCR法检测纤维化皮肤组织中miRNA-182-5p的表达和TGF-β1的mRNA表达（样本数为4）。取人增生性瘢痕成纤维细胞（HSF），分为miRNA-182-5p模拟物+野生型-TGF-β1组、miRNA-182-5p对照+野生型-TGF-β1组、miRNA-182-5p模拟物+突变型-TGF-β1组、miRNA-182-5p对照+突变型-TGF-β1组并转染相应质粒培养36 h后，行双荧光素酶报告基因实验检测miRNA-182-5p与TGF-β1的相互作用，以相对荧光素酶活性表示（样本数为5）。

结果

hDPC-EV中miRNA-182-5p的表达明显高于hDPC（t=5.48，P < 0.05）。与小鼠正常皮肤组织比较，小鼠纤维化皮肤组织中TGF-β1的蛋白表达升高。处理2周后，与PBS+miRNA模拟物对照组比较，EV+miRNA模拟物对照组小鼠纤维化皮肤组织中α-SMA、Ⅰ型胶原的蛋白表达均明显降低（P < 0.05）；与EV+miRNA模拟物对照组比较，EV+miRNA抑制剂组小鼠纤维化皮肤组织中α-SMA、Ⅰ型胶原的蛋白表达均明显升高（P < 0.05）；与EV+miRNA抑制剂组比较，miRNA模拟物组小鼠纤维化皮肤组织中α-SMA、Ⅰ型胶原的蛋白表达均明显降低（P < 0.05）。处理2周后，与EV+miRNA模拟物对照组比较，PBS+miRNA模拟物对照组和EV+miRNA抑制剂组小鼠纤维化皮肤组织中miRNA-182-5p表达均明显降低（P < 0.05）而TGF-β1的mRNA表达均明显升高（P < 0.05）；与EV+miRNA抑制剂组比较，PBS+miRNA模拟物对照组小鼠纤维化皮肤组织中miRNA-182-5p表达明显升高（P < 0.05），miRNA模拟物组小鼠纤维化皮肤组织中miRNA-182-5p表达明显升高（P < 0.05）而TGF-β1的mRNA表达明显降低（P < 0.05）。培养36 h后，miRNA-182-5p模拟物+野生型-TGF-β1组HSF的相对荧光素酶活性为0.594±0.019，明显低于miRNA-182-5p对照+野生型-TGF-β1组的1.000±0.153（t=5.87，P < 0.05）；miRNA-182-5p模拟物+突变型-TGF-β1组HSF的相对荧光素酶活性为0.911±0.085，与miRNA-182-5p对照+突变型-TGF-β1组的0.934±0.027比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。表明miRNA-182-5p可靶向调控TGF-β1。

结论

hDPC-EV可通过递送miRNA-182-5p靶向抑制TGF-β1信号通路来减轻博来霉素诱导的小鼠皮肤纤维化。

Keywords: 皮肤, 瘢痕, 纤维化, 胞外囊泡, 转化生长因子β1, 微RNAs, 真皮毛乳头细胞

增生性瘢痕（hypertrophic scar，HS）是一种皮肤纤维增生性疾病，表现为肌Fb活化和胶原沉积，经常发生在严重烧伤或皮肤外伤后[1-2]。HS Fb（hypertrophic scar fibroblast，HSF）受TGF-β1信号的诱导向肌Fb的转分化是HS发病机制中的一个关键过程。真皮毛乳头细胞（dermal papilla cell，DPC）是位于毛囊基底部的一群特化的间充质干细胞，处于诱导毛囊形态发生、维持毛囊生物学性状和调控毛囊周期循环的信号交换中心[3]。研究证实，DPC可加快创面愈合速度[4]。最新研究也显示，小鼠DPC在HS中具有明显的抗纤维化效果，且抗纤维化特性主要归因于其分泌的细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）[5]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类由内源基因编码的非编码单链RNA分子，可通过靶向调控mRNA的降解或抑制其翻译来调节基因表达，DPC分泌的包含miRNA的EV被靶细胞摄取后，其携带的miRNA能够靶向调控纤维化相关信号通路，从而抑制靶细胞的促纤维化表型，发挥抗纤维化作用[6-7]。最近研究表明，miRNA-182-5p是间充质干细胞来源的EV中富含的一种抗纤维化因子，在抑制内脏纤维化方面具有积极作用[8]。TGF-β1信号通路调节纤维化和胶原合成，在瘢痕形成过程中起着重要作用[9-10]。但是DPC能否通过分泌EV递送miRNA-182-5p从而调控HS纤维化及其可能机制尚不清楚。综上，本研究采用人DPC（human dermal papilla cell，hDPC）来源的EV（extracellular vesicle derived from human dermal papilla cell，hDPC-EV）治疗小鼠皮肤纤维化，旨在探讨hDPC-EV对小鼠皮肤纤维化的影响，为丰富HS的EV疗法提供理论基础。

1. 材料与方法

本实验研究遵循兰州大学第二医院（下称本单位）伦理委员会批准，批号：2024A-558，实验步骤严格遵守国际生物医学研究指导原则和相关规定，废弃毛囊单位收集已免除患者知情同意。

1.1. 主要材料来源

100个废弃的毛囊单位取自2024年9月于本单位行毛发移植手术的2例分别为25、40岁的男性患者，患者传染病检查确定均无甲肝、乙肝、梅毒、获得性免疫缺陷综合征等传染性疾病。

36只6周龄体重16~18 g雄性健康无特殊病原体级C57BL/6J小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所，许可证号：SCXK（甘）2020-0002。胎牛血清、DMEM低糖培养基购自美国Gibco公司，小鼠抗人肿瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）单克隆抗体、小鼠抗人CD63单克隆抗体、小鼠抗人CD9单克隆抗体、小鼠抗人钙联蛋白多克隆抗体、兔抗小鼠TGF-β1单克隆抗体、兔抗小鼠Ⅰ型胶原单克隆抗体、兔抗小鼠α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）单克隆抗体、兔抗小鼠GAPDH单克隆抗体均购自美国Abcam公司。PBS、二喹啉甲酸试剂盒、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体、蛋白提取试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，HE染色试剂盒、Masson染色试剂盒均购自上海歌凡生物科技公司。总RNA提取试剂盒、miRNA反转录试剂盒及配套荧光定量试剂盒均购自日本TaKaRa公司，miRNA模拟物对照、miRNA-182-5p抑制剂、miRNA-182-5p模拟物、pGL3荧光素酶载体购自上海吉玛制药技术有限公司。海肾荧光素酶质粒购自上海碧云天生物技术有限公司。人HSF取自兰州大学第二医院实验室细胞库。N30E型流式细胞仪购自美国NanoFCM公司，Zeta VIEW S/N 17-310型纳米颗粒跟踪分析仪购自美国Particle Metrix公司，Tecnai G2 Spirit BioTwin型透射电子显微镜购自美国FEI公司，IQ5型实时荧光定量PCR仪、Mini型蛋白电泳系统购自美国Bio-Rad公司，FSX100型生物导航仪购自日本Olympus公司，Axiovert 200M型倒置相差显微镜购自德国ZEISS公司，Alpha magerTM 2200型凝胶成像分析系统购自美国Alpha Innotech公司。

1.2. hDPC的提取与鉴定

采用显微分离结合酶消化法，提取100个废弃毛囊单位的原代hDPC[11]。将提取的原代hDPC接种于培养瓶中，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM低糖培养基于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳（常规培养条件下同）培养箱中培养24 h后传代。取培养24 h后的第3代细胞，经免疫荧光法鉴定为hDPC[12]。

1.3. hDPC-EV的提取与鉴定

取第3~5代hDPC常规培养，待细胞生长达80%融合时，更换为含体积分数10%无EV血清（将培养基中血清以100 000×g离心16 h去除血清中EV）的DMEM低糖培养基，培养24 h后收集细胞培养上清液，超高速离心法提取hDPC-EV。取适量hDPC-EV，在100 kV透射电子显微镜40 000倍放大倍数下观察形态，并采用纳米颗粒跟踪分析仪检测粒径。取第3代hDPC及从中提取的hDPC-EV，采用蛋白质印迹法检测EV阳性标志物CD9、CD63、TSG101和阴性标志物钙联蛋白的蛋白表达，其中一抗为小鼠抗人CD9、CD63、TSG101单克隆抗体及小鼠抗人钙联蛋白多克隆抗体（稀释比均为1∶1 000），二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体（稀释比为1∶5 000），采用凝胶成像分析系统获取条带。本实验样本数为3。

1.4. hDPC和hDPC-EV中miRNA的表达检测

取适量hDPC-EV，提取总RNA，将其交由广州基迪奥生物科技有限公司进行RNA质检和高通量测序，分析hDPC-EV中miRNA的丰度。采用实时荧光定量RT-PCR法分别检测hDPC和hDPC-EV中miRNA-182-5p的表达。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。miRNA-182-5p的上游引物为5′-AACAGTGTATGGCACTGGTAGA-3′，下游引物为5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，产物大小为70 bp；U6的上游引物为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，产物大小为100 bp。以U6作为内参照，基于Δ循环阈值对hDPC和hDPC-EV中miRNA-182-5p的表达进行定量。本实验样本数为4。

1.5. 小鼠分组与处理

取30只小鼠，吸入体积分数4%异氟烷麻醉，剔除背部毛发后于皮内每日注射100 μL博来霉素（1 mg/mL）共4周制作小鼠皮肤纤维化模型[13]。采用随机数字表法（后续分组方法同此）选取6只造模后的小鼠经过量异氟烷麻醉处死（处死方法下同），另取6只健康未处理小鼠处死，切取上述12只小鼠背部全层皮肤组织用于检测TGF-β1的蛋白表达。将剩余24只造模后的小鼠分为PBS+miRNA模拟物对照组、EV+miRNA模拟物对照组、EV+miRNA抑制剂组、miRNA模拟物组，每组6只，分别于成功造模后每隔1 d对小鼠背部皮内注射100 μL的PBS+miRNA模拟物对照、hDPC-EV+miRNA模拟物对照、hDPC-EV+miRNA-182-5p抑制剂、miRNA-182-5p模拟物。2周后，处死4组小鼠并收集背部注射部位全层皮肤组织备用。

1.6. 检测指标

1.6.1. 正常皮肤组织与纤维化皮肤组织中TGF-β1的蛋白表达

取1.5中健康未处理小鼠的正常皮肤组织和造模后的小鼠的纤维化皮肤组织提取总蛋白，采用蛋白质印迹法检测TGF-β1的蛋白表达。一抗为兔抗小鼠TGF-β1单克隆抗体、兔抗小鼠GAPDH单克隆抗体（稀释比均为1∶1 000），二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（稀释比为1∶5 000）。本实验样本数为3。

1.6.2. 纤维化皮肤组织病理学和胶原沉积情况

取1.5中4组小鼠的部分纤维化皮肤组织，常规制作成切片（厚5 μm），分别行常规HE染色和Masson染色，于倒置相差显微镜40倍放大倍数下观察皮肤组织病理学和胶原沉积情况。

1.6.3. 纤维化皮肤组织中α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白表达

取1.5中4组小鼠部分纤维化皮肤组织，提取总蛋白，采用蛋白质印迹法检测α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白表达。一抗为兔抗小鼠α-SMA单克隆抗体、兔抗小鼠Ⅰ型胶原单克隆抗体、兔抗小鼠GAPDH单克隆抗体（稀释比均为1∶1 000），二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（稀释比为1∶5 000）。以GAPDH为内参照，计算α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白表达。本实验样本数为3。

1.6.4. 纤维化皮肤组织中miRNA-182-5p的表达和TGF-β1的mRNA表达

取1.5中4组小鼠的部分纤维化皮肤组织，采用总RNA提取试剂盒提取总RNA，采用实时荧光定量RT-PCR法分别检测miRNA-182-5p的表达和TGF-β1的mRNA表达。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。TGF-β1的上游引物为5′-CGCATCCTAGACACCCTTTCTCCTC-3′，下游引物为5′-GGTGTCTCAGTATCCCACGGAAAT-3′，产物大小为156 bp；GAPDH的上游引物为5′-CGCTTCGGCAGCACTATAC-3′，下游引物为5′-CAGGGGCCATGCTAATCTT-3′，产物大小为197 bp。miRNA-182-5p和U6的引物序列和产物大小同1.4，TGF-β1的内参照为GAPDH、miRNA-182-5p的内参照为U6，同1.4定量。本实验样本数为4。

1.6.5. miRNA-182-5p与TGF-β1的相互作用

通过查询Starbase数据库（http://starbase.sysu.edu.cn/）得到miRNA-182-5p与TGF-β1的结合位点。由武汉金开瑞生物工程有限公司合成野生型-TGF-β1序列和突变型-TGF-β1序列并构建野生型-TGF-β1质粒和突变型-TGF-β1质粒。取HSF分为miRNA-182-5p模拟物+野生型-TGF-β1组、miRNA-182-5p对照+野生型-TGF-β1组、miRNA-182-5p模拟物+突变型-TGF-β1组、miRNA-182-5p对照+突变型-TGF-β1组，分别将0.67 μg miRNA-182-5p模拟物和1 μg野生型-TGF-β1质粒、0.67 μg miRNA模拟物对照和1 μg野生型-TGF-β1质粒、0.67 μg miRNA-182-5p模拟物和1 μg突变型-TGF-β1质粒、0.67 μg miRNA模拟物对照和1 μg突变型-TGF-β1质粒扩增到pGL3荧光素酶载体的下游位点，然后将它们分别与150 ng的海肾荧光素酶质粒使用EntransterTM-R4000在37 ℃下分别转染到3×104个HSF中[14]。培养36 h后，行双荧光素酶报告基因实验检测miRNA-182-5p与TGF-β1的相互作用，结果以HSF中相对荧光素酶活性表示。本实验样本数为5。

1.7. 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布，以x ± s表示。hDPC和hDPC-EV中miRNA的表达比较行独立样本t检验；4组分组的组间总体比较行单因素方差分析，两两比较行LSD检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. hDPC-EV的鉴定

培养24 h后，提取的hDPC-EV为盘状囊泡结构，平均粒径142.91 nm，符合EV粒径；hDPC-EV的囊泡阳性标志物TSG101、CD63、CD9阳性，阴性标志物钙联蛋白阴性。hDPC-EV鉴定成功。见图 1。

图 1.

hDPC-EV的鉴定。1A.hDPC-EV为盘状囊泡结构 透射电子显微镜×40 000；1B.hDPC-EV平均粒径为142.91 nm；1C.hDPC-EV的囊泡阳性标志物TSG101、CD63、CD9阳性，阴性标志物钙联蛋白阴性

Identification of hDPC-EVs

注：hDPC-EV为人真皮毛乳头细胞来源的细胞外囊泡，TSG101为肿瘤易感基因101；条带上方1、2分别指示hDPC-EV、人真皮毛乳头细胞

图 1

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2.2. hDPC和hDPC-EV中miRNA的表达

hDPC-EV中，miRNA-182-5p丰度较高，排名第3，见图 2。hDPC-EV中miRNA-182-5p的表达为1.08±0.06，明显高于hDPC中的0.72±0.12（t=5.48，P=0.002）。

图 2.

高通量测序检测的人真皮毛乳头细胞来源的细胞外囊泡中miRNA的丰度（%）

The abundance of miRNAs in extracellular vesicles derived from human dermal papilla cells detected by high-throughput sequencing

注：miRNA为微小RNA；其他miRNA为丰度 < 1%的miRNA

图 2

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2.3. 正常皮肤组织与纤维化皮肤组织中TGF-β1的蛋白表达

与小鼠正常皮肤组织比较，小鼠纤维化皮肤组织中TGF-β1的蛋白表达升高，见图 3。

图 3.

蛋白质印迹法检测的小鼠正常皮肤组织和纤维化皮肤组织中TGF-β1的蛋白表达

The protein expression of TGF-β1 in normal skin tissue and fibrotic skin tissue of mice detected by Western blotting

注：TGF-β1为转化生长因子β1，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条带上方1、2分别指示行博来霉素注射4周的小鼠的纤维化皮肤组织和未行博来霉素注射的小鼠的正常皮肤组织

图 3

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2.4. 纤维化皮肤组织病理学和胶原沉积情况

处理2周后，PBS+miRNA模拟物对照组和EV+miRNA抑制剂组小鼠皮肤组织胶原过度沉积、纤维排列紊乱、皮肤附属器较少、炎症细胞浸润和毛细血管增生；与这2组相比，EV+miRNA模拟物对照组和miRNA模拟物组小鼠皮肤组织胶原沉积良好、纤维排列有序、皮肤附属器丰富。见图 4。

图 4.

4组皮肤纤维化小鼠处理2周后纤维化皮肤组织病理学和胶原沉积情况。4A、4B、4C、4D.分别为PBS+miRNA模拟物对照组、EV+miRNA抑制剂组、EV+miRNA模拟物对照组、miRNA模拟物组小鼠纤维化皮肤组织，图4A和图4B中皮肤附属器缺乏，图4C和图4D中皮肤附属器丰富 苏木精-伊红×40；4E、4F、4G、4H.分别为PBS+miRNA模拟物对照组、EV+miRNA抑制剂组、EV+miRNA模拟物对照组、miRNA模拟物组小鼠纤维化皮肤组织，图4E和图4F中胶原大量沉积、纤维排列紊乱，图4G和图4H中胶原沉积良好、纤维排列趋于正常 Masson×40

Histopathology and collagen deposition in the fibrotic skin tissue of 4 groups of mice with skin fibrosis after 2 weeks of treatment

注：对磷酸盐缓冲液（PBS）+微小RNA（miRNA）模拟物对照组、细胞外囊泡（EV）+miRNA抑制剂组、EV+miRNA模拟物对照组、miRNA模拟物组小鼠分别注射PBS+miRNA模拟物对照、人真皮毛乳头细胞来源的EV（hDPC-EV）+miRNA-182-5p抑制剂、hDPC-EV+miRNA模拟物对照、miRNA-182-5p模拟物

图 4

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2.5. 纤维化皮肤组织中α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白表达

处理2周后，PBS+miRNA模拟物对照组、EV+miRNA模拟物对照组、EV+miRNA抑制剂组、miRNA模拟物组小鼠纤维化皮肤组织中α-SMA的蛋白表达分别为0.851±0.072、0.313±0.021、0.910±0.110、0.353±0.040，Ⅰ型胶原的蛋白表达分别为0.921±0.123、0.212±0.030、0.885±0.082、0.254±0.021，组间总体比较，差异均有统计学意义（F值分别为171.30、220.50，P < 0.001）。与PBS+miRNA模拟物对照组比较，EV+miRNA模拟物对照组小鼠纤维化皮肤组织中α-SMA、Ⅰ型胶原的蛋白表达均明显降低（P < 0.001）；与EV+miRNA模拟物对照组比较，EV+miRNA抑制剂组小鼠纤维化皮肤组织中α-SMA、Ⅰ型胶原的蛋白表达均明显升高（P < 0.001）；与EV+miRNA抑制剂组比较，miRNA模拟物组小鼠纤维化皮肤组织中α-SMA、Ⅰ型胶原的蛋白表达均明显降低（P < 0.001）。见图 5。

图 5.

蛋白质印迹法检测的4组皮肤纤维化小鼠处理2周后纤维化皮肤组织中α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白表达

The protein expressions of α-SMA and type Ⅰ collagen in the fibrotic skin tissue of 4 groups of mice with skin fibrosis after 2 weeks of treatment detected by Western blotting

注：α-SMA为α-平滑肌肌动蛋白，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶，条带上方1、2、3、4分别指示对小鼠注射磷酸盐缓冲液（PBS）+微小RNA（miRNA）模拟物对照、人真皮毛乳头细胞来源的细胞外囊泡（hDPC-EV）+miRNA模拟物对照、hDPC-EV+miRNA-182-5p抑制剂、miRNA-182-5p模拟物的PBS+miRNA模拟物对照组、细胞外囊泡（EV）+miRNA模拟物对照组、EV+miRNA抑制剂组、miRNA模拟物组

图 5

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2.6. 纤维化皮肤组织中miRNA-182-5p的表达和TGF-β1的mRNA表达

处理2周后，与EV+miRNA模拟物对照组比较，PBS+miRNA模拟物对照组和EV+miRNA抑制剂组小鼠纤维化皮肤组织中miRNA-182-5p表达均明显降低（P < 0.05）而TGF-β1的mRNA表达均明显升高（P < 0.05）；与EV+miRNA抑制剂组比较，PBS+miRNA模拟物对照组小鼠纤维化皮肤组织中miRNA-182-5p表达明显升高（P < 0.05），miRNA模拟物组小鼠纤维化皮肤组织中miRNA-182-5p表达明显升高（P < 0.05）而TGF-β1的mRNA表达明显降低（P < 0.05）。见表 1。

表 1.

4组皮肤纤维化小鼠处理2周后纤维化皮肤组织中miRNA-182-5p的表达和TGF-β1的mRNA表达（x ± s）

Expression of miRNA-182-5p and mRNA expression of TGF-β1 in the fibrotic skin tissue of 4 groups of mice with skin fibrosis after 2 weeks of treatment

组别 样本数 miRNA-182-5p TGF-β1
注：miRNA为微小RNA，TGF-β1为转化生长因子β1；对磷酸盐缓冲液（PBS）+miRNA模拟物对照组、细胞外囊泡（EV）+miRNA模拟物对照组、EV+miRNA抑制剂组、miRNA模拟物组小鼠分别注射PBS+miRNA模拟物对照、人真皮毛乳头细胞来源的EV（hDPC-EV）+miRNA模拟物对照、hDPC-EV+miRNA-182-5p抑制剂、miRNA-182-5p模拟物；F值、P值为组间各指标总体比较所得；P1值、P2值、P3值、P4值、P5值分别为PBS+miRNA模拟物对照组与EV+miRNA模拟物对照组、EV+miRNA模拟物对照组与EV+miRNA抑制剂组、EV+miRNA抑制剂组与PBS+miRNA模拟物对照组、miRNA模拟物组与EV+miRNA抑制剂组、miRNA模拟物组与EV+miRNA模拟物对照组各指标比较所得
PBS+miRNA模拟物对照组 4 0.31±0.04 0.76±0.09
EV+miRNA模拟物对照组 4 1.19±0.11 0.29±0.05
EV+miRNA抑制剂组 4 0.13±0.06 0.88±0.08
miRNA模拟物组 4 1.30±0.05 0.23±0.03
F值 289.00 118.60
P值 < 0.001 < 0.001
P1值 < 0.001 < 0.001
P2值 < 0.001 < 0.001
P3值 0.021 0.115
P4值 < 0.001 < 0.001
P5值 0.119 0.085
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2.7. miRNA-182-5p与TGF-β1的相互作用

miRNA-182-5p与TGF-β1存在结合位点。培养36 h后，miRNA-182-5p模拟物+野生型-TGF-β1组HSF的相对荧光素酶活性为0.594±0.019，明显低于miRNA-182-5p对照+野生型-TGF-β1组的1.000±0.153（t=5.87，P < 0.001）；miRNA-182-5p模拟物+突变型-TGF-β1组HSF的相对荧光素酶活性为0.911±0.085，与miRNA-182-5p对照+突变型-TGF-β1组的0.934±0.027比较，差异无统计学意义（t=0.58，P=0.575）。表明miRNA-182-5p可靶向调控TGF-β1。

3. 讨论

HS是一种导致皮肤结构破坏和关节功能受限的严重纤维化皮肤病，因缺乏针对HS的有效防治策略，其并发症常影响患者的生活质量，HS现已成为临床亟待解决的难题[15-17]。

近年来，对毛囊及其相关干细胞在缓解HS方面的研究结果显示，毛囊相关干细胞可通过改善创面局部微环境、减轻炎症反应、促进血管生成和上皮化以及影响Fb转归来改善HS[18]。最近的多项研究结果表明，位于毛囊基底部的DPC可缓解皮肤HS纤维化，如DPC可分化为真皮Fb，参与创面真皮修复，促进创面愈合[19]；使用DPC制成的组织工程皮肤可以促进表皮基底膜的再生，使创面收缩减少，皮肤弹性及抗张能力增强，愈合后更接近正常组织的生理特性[20]；此外，用DPC构建的组织工程皮肤中成熟血管较多、炎症减轻，可明显减少瘢痕形成和创面收缩[21-22]。

EV是粒径为30~5 000 nm的囊泡，几乎所有类型的细胞都会分泌EV，因与其他基因传递载体相比，EV对受体的免疫原性、非细胞毒性和非诱变性均较低，使其成为一种有前途的HS治疗策略[23-25]。毛囊来源丰富，在人体全身分布广泛，DPC作为毛囊来源的间充质干细胞已被证明具有高效分泌EV的功能[12]。故本研究选取hDPC作为提取EV的来源干细胞，探究hDPC-EV对小鼠皮肤纤维化的治疗效果。在HS的形成过程中，最常见的皮肤纤维化组织检测指标α-SMA、Ⅰ型胶原表达均有所增加[13]。最新研究结果证实，小鼠DPC来源的EV可抑制人HSF的增殖和迁移，并通过激活Krüppel样因子4抑制人HSF中α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白表达，进而调控HS纤维化[5]。然而，目前尚缺少hDPC-EV对HS抑制作用及其作用机制的研究结果，故本研究采用hDPC-EV作为研究对象，旨在丰富hDPC-EV防治HS的理论基础。

尽管博来霉素诱导的皮肤纤维化模型与临床HS在病因学上存在差异，博来霉素诱导的皮肤纤维化模型更接近系统性硬化症或硬皮病的病理特征，但该模型已被广泛用于模拟HS的关键病理机制研究[26-30]。研究表明，博来霉素可通过诱导TGF-β1信号通路的激活、促进Fb向肌Fb转化以及胶原过度沉积，从而复现HS的纤维化表型[26，31]。近期研究证实，博来霉素诱导的小鼠皮肤纤维化模型中α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白表达均明显升高，且其分子机制与HS中Fb代谢异常和ECM重塑紊乱高度一致[31]。此外，多项针对HS治疗策略的临床前研究均采用此模型验证干预效果，如间充质干细胞来源的EV的抗纤维化作用[13，30]。因此，尽管存在临床病理背景的差异，但博来霉素诱导的皮肤纤维化模型仍为揭示HS的纤维化调控机制提供了可靠的实验平台。

本研究成功分离和鉴定了hDPC-EV，并将其用于博来霉素诱导的小鼠皮肤纤维化这一模型进行HS的研究，结果显示，处理2周后，与PBS+miRNA模拟物对照组比较，EV+miRNA模拟物对照组小鼠纤维化皮肤组织中α-SMA、Ⅰ型胶原的蛋白表达均明显降低，且小鼠纤维化皮肤的胶原沉积良好，皮肤附属器再生丰富。研究表明，人间充质干细胞分泌的EV可通过抑制肝星状细胞TGF-β1蛋白缓解内脏纤维化[32]。瘢痕也是一种异常纤维化疾病，HS表现为大量胶原纤维和ECM沉积。有学者指出，TGF-β1参与Fb增殖、胶原合成和ECM的重塑，同时，瘢痕形成与TGF-β1密切相关[33]，如HS组织中TGF-β1增加，而正常皮肤组织中TGF-β1缺乏[19，34]。本研究结果显示，与小鼠正常皮肤组织比较，小鼠纤维化皮肤组织中的TGF-β1的蛋白表达升高，而经hDPC-EV治疗的小鼠皮肤组织中TGF-β1的mRNA表达明显降低，此结果与文献报告[34]相一致，表明hDPC-EV可能通过调控TGF-β1信号通路来降低纤维化皮肤组织中α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白表达进而抑制皮肤纤维化。

此外，miRNA是皮肤形态发生改变和创面愈合中的关键调节剂，其在HS形成中也起着重要作用。miRNA作为EV发挥作用的重要内容物，已被证明是参与调控HS纤维化的介质[35-36]。miRNA的紊乱会导致细胞周期和ECM分泌异常，这与器官纤维化的发生和发展密切相关[37]。为进一步明确hDPC-EV是否通过递送miRNA发挥抗HS纤维化的作用，本研究对hDPC-EV进行了转录组学测序分析，结果显示，hDPC-EV中miRNA-182-5p的丰度较高（排名第3），进一步的实时荧光定量RT-PCR实验也验证了测序结果。最新研究表明，miRNA-182-5p与患者瘢痕疙瘩及HS的治疗密切相关[38]。经检索，尚无关于丰度排名前2位miRNA-30d-5p和miRNA-184-3p与HS或皮肤纤维化是否相关的研究。而有研究指出，miRNA-182-5p在多种器官的纤维化过程中发挥了重要作用[8]。此外，数据库预测结果显示，miRNA-182-5p与TGF-β1存在结合位点，故本研究团队推测hDPC-EV可能通过递送miRNA-182-5p发挥抗纤维化的作用。本研究结果也显示，hDPC-EV治疗会提高小鼠纤维化皮肤组织中miRNA-182-5p的表达，而添加miRNA-182-5p抑制剂后，采用hDPC-EV治疗的小鼠纤维化皮肤组织中miRNA-182-5p的表达降低，并且抑制miRNA-182-5p后，hDPC-EV的抑制α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白表达及缓解纤维化的作用被削弱，加入miRNA-182-5p模拟物可减少小鼠纤维化皮肤组织中α-SMA、Ⅰ型胶原的蛋白表达，表明miRNA-182-5p调控纤维化皮肤组织中α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白表达，即miRNA-182-5p对α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白表达具有抑制作用。这一结果证实hDPC-EV抑制纤维化的机制与其递送miRNA-182-5p密切相关。抑制TGF-β1合成或阻止TGF-β1信号转导已被认为是降低HS形成风险的一种重要手段[39]。最新研究表明，miRNA-182-5p可抑制人TGF-β的表达进而调控上皮间充质的转化[40]。本研究中，hDPC-EV和miRNA-182-5p模拟物均可明显抑制小鼠纤维化皮肤组织中TGF-β1的mRNA表达和α-SMA、Ⅰ型胶原的蛋白表达，而添加miRNA-182-5p抑制剂的hDPC-EV对TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型胶原的抑制作用被明显阻断。这提示hDPC-EV抑制HS纤维化的机制可能与其内容物miRNA-182-5p对TGF-β1蛋白的靶向抑制作用有关。而后，本研究通过进一步的双荧光素酶报告基因实验证实miRNA-182-5p可靶向调控TGF-β1。

综上所述，本研究证实了hDPC-EV通过递送miRNA-182-5p从而靶向抑制TGF-β1信号通路，最终减轻小鼠皮肤纤维化，且hDPC-EV对改善纤维化皮肤组织纤维排列、皮肤附属器再生具有明显的优势。预示着毛囊来源的EV与脂肪、骨髓等间充质干细胞来源的EV相比较，可能在促进创面愈合及组织重塑方面具有巨大应用潜力。尽管本研究证实hDPC-EV具有明显的抗纤维化效果，但已有研究提示miRNA可发挥多靶点调控作用，且EV中还含有mRNA、蛋白质等其他功能性成分。虽然，hDPC-EV可通过递送miRNA-182-5p靶向抑制TGF-β1信号通路发挥抗皮肤纤维化作用，但hDPC-EV作用的发挥还可能存在其他潜在机制的贡献。下一步课题组还应深入探究hDPC-EV发挥抗HS作用的下游分子机制及其缓解或逆转HS的新靶点，为未来hDPC-EV的临床应用奠定理论基础。

Funding Statement

国家自然科学基金地区科学基金项目（82360444）；甘肃省高校产业支撑项目（2023CYZC-02）；兰州大学第二医院萃英科技创新项目（CY2022-MS-A04）

Regional Science Foundation Program of National Natural Science Foundation of China (82360444); Gansu Province University Industry Support Project (2023CYZC-02); Cuiying Technology Innovation Project of Lanzhou University Second Hospital (CY2022-MS-A04)

本文亮点

(1) 揭示人真皮毛乳头细胞来源的细胞外囊泡（hDPC-EV）通过递送微小RNA-182-5p靶向抑制转化生长因子β1信号通路，减轻博来霉素诱导的小鼠皮肤纤维化。

(2) 证实hDPC-EV中的微小RNA-182-5p可抑制皮肤纤维化标志物的表达，为毛囊来源干细胞在体应用提供新靶点。

Highlights

(1) It was revealed that extracellular vesicles derived from human dermal papilla cells (hDPC-EVs) could alleviate bleomycin-induced skin fibrosis in mice by delivering microRNA-182-5p to target inhibiting transforming growth factor β1 signal pathway.

(2) It was confirmed that microRNA-182-5p in hDPC-EVs could suppress the expression of skin fibrosis markers, offering a novel target for in vivo application of hair follicle-derived stem cells.

利益冲突  所有作者声明不存在利益冲突

作者贡献声明  王运帷、蔡飞宇、石傲：实验操作、论文撰写；康宇晨、赵若梅、胡智瀚：数据整理；邸晓宇：统计学分析；刘毅：研究指导、论文修改、经费支持

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Articles from Chinese Journal of Burns and Wounds are provided here courtesy of Chinese Medical Association

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