外泌体多组学分析技术在烧伤脓毒症预警与诊断中应用的研究进展

Abstract

作为导致烧伤患者死亡的主要原因之一, 脓毒症的早期预警与诊断面临挑战, 这主要源于其非特异性临床表现和传统生物标志物检测效能的局限性。作为细胞间信息传递的重要载体, 外泌体及其内含物（RNA、蛋白质、代谢物）可反映机体病理生理状态, 在疾病诊断领域备受关注。该文旨在综述外泌体多组学（转录组学、蛋白质组学、代谢组学等）分析技术在烧伤脓毒症预警和诊断中应用的研究进展, 探讨其在揭示疾病机制、筛选特异性早期生物标志物及结合新兴生物信息学技术方面的应用潜力, 以期为实现烧伤脓毒症的精准诊断和治疗提供新的策略和方向。

脓毒症是烧伤患者的主要死亡原因之一^[1], 其本质是由感染引发宿主反应失调所致的危及生命的器官功能障碍^[2]。烧伤等急性损伤会破坏机体的免疫屏障, 从而为病原体入侵创造条件, 进而激活机体固有免疫应答；若这一过程所导致的炎症反应与氧化应激失控, 则会诱发脓毒症, 甚至导致MODS和死亡^[3]。尽管烧伤救治已取得显著进展, 但脓毒症相关致死率仍居高不下。烧伤后SIRS与脓毒症的临床表现高度相似, 导致烧伤脓毒症早期识别困难, 常延误最佳治疗时机^[4-5]。脓毒症发病机制复杂, 涉及免疫紊乱、炎症失控等多重因素^[6]。传统诊断主要依赖临床体征、实验室检查结果及病原学证据, 并结合脓毒症相关性器官功能衰竭评价（sepsis-related organ failure assessment, SOFA）评分^[7], 但现有方法存在耗时长、特异度不足等局限^[8-9]。因此, 开发快速、精准的烧伤脓毒症预警与诊断新技术, 对改善患者预后至关重要。近年来, 外泌体作为细胞间通讯的重要载体, 具有来源便捷、稳定性好及富含疾病特异性分子等优点, 已成为肿瘤、感染性疾病等领域极具潜力的液体活检标志物。

组学分析技术能够多层面、系统性地揭示疾病的分子全貌, 为疾病的诊断、预后评估与个体化治疗提供有力工具^[10]。将多组学分析技术应用于烧伤患者的外泌体研究, 有望深入解析烧伤脓毒症的特异性分子机制, 筛选出具有临床应用价值的早期预警与诊断生物标志物, 为优化临床诊断和治疗策略提供新思路。本文旨在综述外泌体多组学分析技术在烧伤脓毒症预警与诊断中应用的研究进展, 并展望其应用前景。

1. 烧伤脓毒症的发病机制与诊断挑战

严重烧伤是一种复杂的创伤性疾病, 可诱发机体多系统级联性病理生理改变^[11]。在组织病理学方面, 大面积烧伤导致的皮肤完整性破坏和屏障功能丧失会显著增加病原体易位进入机体导致感染的风险。

Toll样受体4/核因子κB等炎症信号通路被激活后, 会促使TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子风暴的发生, 进而引发全身性炎症反应失控。这种失控的炎症反应是烧伤后机体病理生理改变的核心特征之一^[5]。与此同时, 烧伤会引发双重免疫紊乱, 即固有免疫与适应性免疫功能同步受损, 显著削弱宿主防御能力^[12]；中性粒细胞功能缺陷作为免疫抑制的核心表型, 具体表现为吞噬活性降低、呼吸爆发能力减弱及中性粒细胞胞外诱捕网生成障碍^[13], 均为烧伤脓毒症形成的重要因素。此外, 创伤后代谢重构导致的持续负氮平衡与能量代谢异常^[6], 可进一步加剧组织器官功能障碍, 显著增加脓毒症风险。

在烧伤脓毒症的诊断过程中, 血液标本的病原微生物培养仍然是不可或缺的步骤, 但是血液标本的病原微生物培养通常需要48~72 h的检测周期, 并且在烧伤患者中只有27.4%的阳性率^[14], 这就给脓毒症的快速诊断和及时治疗造成了很大的困难。虽然2016年脓毒症3.0共识将SOFA评分定为脓毒症诊断的新标准, 通过快速SOFA评分[意识状态变化、收缩压≤100 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）、呼吸频率≥22次/min, 快速SOFA评分≥2分提示可能有脓毒症], 以实现快速筛查^[7], 但在其有效性验证的研究中, 烧伤患者群体常因代表性不足被直接排除, 从而限制了该评分在该特殊人群中的直接适用性^[15]。因此, 将脓毒症3.0共识中标准直接应用于烧伤患者的脓毒症筛查与评估是否恰当, 仍有待更深入地研究和讨论^[16]。在此背景下, 一些其他的脓毒症诊断相关早期预警评分也逐渐进入研究者的视野。例如, 英国国家早期预警评分是一种基于多项生理参数的评估工具, 据报道, 该评分能够动态评估患者的病情进展和恶化风险^[17]。尽管英国国家早期预警评分有其优势, 但在将其应用于中国等不同国家医疗体系时, 如何有效整合本土的医疗常规、资源状况及个体化治疗需求, 构成了将其本土化应用的核心问题。这种整合上的困难, 使得该评分在中国临床领域内至今缺乏一个统一且广泛认可的应用标准。因此, 对于该评分在烧伤脓毒症早期预警方面的真实价值及通用性, 还需要进一步评估和确认。

2. 传统脓毒症生物标志物在烧伤患者中的应用及局限性

当前临床实践中, 降钙素原、C反应蛋白（C-reactive protein, CRP）、IL-6等炎症生物标志物, 仍是脓毒症辅助诊断的主要指标。由于烧伤患者常伴有创面持续炎症反应及代谢紊乱等, 使得这些生物标志物在临床应用中面临特异性不足的局限性^[17]。例如降钙素原的诊断价值, 在多项研究中存在矛盾性结果。有学者针对降钙素原在烧伤患者脓毒症诊断中的应用进行荟萃分析^[18], 结果显示降钙素原在区分烧伤后脓毒症患者和烧伤后非脓毒症患者方面具有一定的诊断价值, 其受试者操作特征曲线下面积为0.83, 但该指标易受创伤、手术等引发的非感染性炎症干扰, 导致假阳性率升高。此外, 有学者在探讨降钙素原指导治疗对严重脓毒症或感染性休克患者病死率影响的研究中观察到, 降钙素原指导的抗菌治疗无法降低脓毒症或者感染性休克患者的28 d或90 d病死率, 表明降钙素原虽然可以作为严重烧伤等感染的生物标志物, 但在指导临床治疗决策方面存在局限性^[19]。值得注意的是, 降钙素原与快速SOFA评分联合应用时, 可显著改善风险分层^[20], 但该结论尚未在烧伤人群中进行验证。

研究新型复合指标是寻找烧伤脓毒症有效诊断方法的重要方向。CRP/白蛋白比值（C-reactive protein to albumin ratio, CAR）被用于评估烧伤患者的脓毒症风险。研究结果显示, 入院时的CAR可以独立预测脓毒症发生的危险, 且CAR≥1.66的烧伤脓毒症患者30 d生存率明显下降, 但是其诊断的特异度和敏感度仍待提高^[21]。另有荟萃分析显示, 中性粒细胞与淋巴细胞比值（neutrophil-to-lymphocyte ratio, NLR）是脓毒症预后的一个重要相关因素, 因为较高的NLR水平表明成年脓毒症患者的预后较差, NLR可以作为预测成年脓毒症患者预后和死亡风险的可靠且有价值的生物标志物^[22]。不过, NLR升高所反映的病理生理过程可能较为繁杂, 既可能是烧伤引发应激反应的表现, 也可能是机体发生感染的信号。另外, 一项回顾性队列研究显示血小板减少症可作为严重烧伤患者并发症的早期警示标志, 还可以作为判断预后的依据, 为帮助学者理解血小板减少在烧伤患者中的作用提供了新的视角。该研究揭示, 血小板减少与公认的烧伤不良预后因素（高龄、大面积烧伤及Ⅲ度烧伤等）显著相关, 同时亦与脓毒症的发生密切相关^[23]。然而, 一个尚未解决的问题是, 该研究未能对血小板减少在脓毒症诊断上的特有价值进行更深层次的评估。

综上, 传统炎症生物标志物和复合指标如降钙素原、CRP、NLR等在脓毒症诊断和预后评估中具有参考价值, 但在烧伤脓毒症诊断中存在特异度低、易受非感染性炎症、创伤应激等干扰的固有缺陷和瓶颈问题。近年来, 外泌体组学分析为突破这一瓶颈提供了新的探索方向。

3. 基于外泌体的多组学分析技术在脓毒症诊断和预警中的应用前景

外泌体富含来源于细胞的核酸、蛋白质、脂类等生物分子, 作为细胞间通讯的重要介质, 能够反映细胞的生理病理状态^[24]。作为一种新型的液体活检指标, 外泌体在判断疾病状态和预测其发展结局上显示出广阔的应用前景。近年快速发展的多组学分析技术, 为揭示疾病内在的分子机制提供了新的有效分析手段^[25]。将多组学分析技术应用于外泌体研究, 有望系统性地揭示脓毒症的发生发展机制, 筛选出具有临床应用价值的早期预警分子。

3.1. 外泌体转录组学分析技术

外泌体转录组学分析技术通过系统解析细胞外囊泡内mRNA、微小RNA（microRNA, miR）、长链非编码RNA等RNA分子的种类、丰度及其动态变化规律, 为脓毒症的分子机制解析、精准诊断和治疗提供重要依据^[26]。新近的一项研究成果, 揭示了脓毒症患者血液循环外泌体中长链非编码RNA与miR表达的特有紊乱现象^[27]。该研究利用通路富集分析, 特别指出了miR-370-3p、miR-3619-3p和miR-4488这3种miR的表达水平出现了显著波动, 并且这些表达变化被证实与程序性死亡受体1/程序性死亡受体配体1信号通路高度关联^[28], 这表明它们有潜力充当脓毒症相关免疫功能失调的早期预警指标。另外, 鉴于外泌体miR在体液内具有出色的稳定性（其半衰期能超过7 d）, 并具备介导细胞间通讯的功能, 它们已被视为极具临床转化前景的候选生物标志物^[29]。

有研究显示, 脓毒症患者差异RNA与细胞因子风暴、补体和凝血级联反应、内皮屏障功能、20S蛋白酶体依赖性蛋白质降解及维生素代谢相关^[4], 小鼠盲肠结扎穿孔术脓毒血症模型也证实差异RNA可直接影响维生素B12、酪氨酸等维生素和氨基酸的代谢过程^[30]。另有小鼠急性肺损伤实验显示, 循环外泌体通过递送促炎性的miR-155来激活巨噬细胞, 从而关键性地介导并加剧了脓毒症相关急性肺损伤^[31]。综上所述, 外泌体miR谱的动态变化能反映脓毒症发生发展中的相关基因表达调控网络变化, 其高敏感度和稳定性为开发新型早期诊断工具和预后评估模型提供了分子基础。

3.2. 外泌体蛋白质组学分析技术

外泌体蛋白质组学分析技术通过对细胞外囊泡内蛋白质进行全面的鉴定与定量, 为寻找脓毒症特异性生物标志物奠定了坚实的技术基础。研究已证实, 脓毒症患者外泌体中特定蛋白质的表达差异与全身炎症及免疫失调紧密相关^[32]。有关脓毒症相关急性肺损伤的一项重要研究显示, 脓毒症患者血浆外泌体里的ECM肌腱蛋白C含量同脓毒症相关急性肺损伤的发生相关。研究通过受试者操作特征曲线分析表明, ECM肌腱蛋白C在诊断急性肺损伤方面的表现很出色, 其临床区分效力很好^[33]。在一项脓毒症相关急性肾损伤亚型的研究里, 学者对疑似感染引起的脓毒症ICU患者尿液外泌体蛋白谱加以分析之后观察到, 肾损伤亚型1和肾损伤亚型2之间存在显著差异, 亚型2含有117种蛋白, 亚型1含有195种蛋白, 亚型1的差异蛋白大多与修复与再生表型相关, 而亚型2的差异蛋白则主要表现为与菌血症相关的免疫炎症表型, 这体现出外泌体蛋白组在疾病细致分型中的应用潜力, 据此进一步创建的尿液蛋白质组学分类模型, 在分辨脓毒症相关急性肾损伤亚型方面有着较高的诊断效能, 这就给脓毒症并发症的非侵入性分型开拓了新的技术路径^[34]。这些研究表明, 外泌体蛋白质组学分析技术不仅能提供脓毒症早期识别的新型分子标志物, 其支持动态监测的特性还有望使其成为评估病情演变和预测结局的生物传感工具。今后的研究重点应在于进一步确认这些候选生物标志物的实际临床应用潜力, 同时也要致力于更深层次地阐明关键蛋白质在脓毒症引发的MODS中所扮演的分子调节角色。

3.3. 外泌体代谢组学分析技术

外泌体代谢组学分析技术旨在通过高通量检测技术全面解析生物体内小分子代谢物的动态变化, 从而精准反映机体的代谢稳态及病理生理改变^[35]。有学者通过比较脓毒症患者和非脓毒症患者血浆外泌体代谢组学差异性, 观察到脓毒症患者的代谢物谱具有线粒体功能障碍特征, 如左旋肉碱和酰基肉碱水平显著异常, 并且与多器官损伤密切相关^[36]。另有实验佐证外泌体和线粒体代谢功能有关, 研究显示脂肪干细胞外泌体可能通过改善LPS诱导的小鼠巨噬细胞线粒体功能障碍, 重新编程巨噬细胞的代谢状态, 脓毒症相关肺损伤的代谢状态异常可能通过外泌体介导的代谢物转运加剧全身炎症反应和器官损伤^[37]。此外, 有研究系统阐述外泌体代谢组学分析技术在危重症诊治研究中的双重价值：既可为早期诊断提供生物标志物（如甲硫氨酸亚砜等氧化应激生物标志物）, 又能揭示能量代谢失衡与免疫麻痹的分子关联机制^[38]。

尽管外泌体组学研究在脓毒症病理机制解析中展现出重要的潜在科学价值, 但该领域仍存在诸多研究空白。脓毒症发生发展的整合基因组、表观组与代谢组的系统性外泌体多组学研究, 尚鲜见报道。由于单维度研究范式可能限制对脓毒症复杂病理网络的整体认知, 因此强化多组学整合分析将有助于揭示脓毒症不同分子层级的交互调控机制。

4. 多组学分析技术和新生物研究技术在脓毒症研究中的应用策略

基于生物信息学的多组学联合分析技术, 可以为脓毒症复杂的细胞分子机制探索提供有效的途径。通过整合相关细胞转录组学、蛋白质组学、代谢组学等多维度数据, 系统解析细胞分子调控网络, 能够获得脓毒症关键分子靶点, 显著提升生物标志物的发现效率。该分析方法的核心技术涉及网络分析、通路富集和机器学习等方法^[39]。

一项最新研究整合了脓毒症小鼠的肾脏蛋白质组学与代谢组学数据, 通过构建相关网络筛选了包括肌苷在内的3种核心代谢物, 并据此建立了一个用于早期识别脓毒症相关急性肾损伤的高精度诊断模型^[40]。另有学者对脓毒症小鼠的肾脏组织进行非靶向肾脏蛋白质组学和代谢组学分析, 并利用Spearman相关分析网络锁定了包括肌苷在内的3种核心代谢物, 最终成功开发出一种用于早期识别脓毒症相关急性肾损伤的诊断模型。此外, 有学者借助单细胞组学分析和机器学习算法, 观察到一种新的中性粒细胞亚型及其独特的基因表达谱, 且该亚群的细胞丰度在脓毒症状态下会显著增加, 其中5个枢纽基因（碱性磷酸酶、CD177、S100钙结合蛋白A8、S100钙结合蛋白A9、突触融合蛋白结合蛋白2）有望为靶向治疗脓毒症提供新型生物标志物^[41]。国内有研究者整合来源于高通量基因表达数据库的成年（编号54514）和新生（编号25504）脓毒症患者的转录组信息, 检测到6 316个差异表达基因^[42], 其中涉及免疫代谢通路的基因变化最为突出。该团队后续进一步运用最小绝对值压缩和选择算法回归构建的25种基因诊断模型在跨数据集验证中表现出高准确性, 尤其是SLC2A6基因被证实可通过调控Th1浸润水平影响患者病死率, 为脓毒症预后评估提供了新靶点。在分子层面, 有研究者通过筛选鉴定出6种关键基因（检查点激酶1、DNA依赖性蛋白激酶催化亚基、酪蛋白激酶2α1亚基、赖氨酸乙酰转移酶2A、蛋白激酶2、MAPK8）, 并观察到它们显著富集于胰高血糖素信号通路, 这一研究指明了可能参与脓毒症发生、进展及风险预测的核心分子机制, 并为开发新的生物标志物或治疗靶点提供了线索^[43]。而在免疫细胞调控层面, B细胞与单核细胞的异常活化已被证实与脓毒症的发病紧密相关, 其中乳酸脱氢酶A、已糖激酶3等关键基因被认为可通过调控相关免疫信号通路, 深刻影响脓毒症病程^[44]。更进一步, 为了探究疾病的动态演进机制, 研究人员通过分析多中心数据集, 揭示了从脓毒症向脓毒性休克转变过程中的动态分子图景, 特别是MAPK14、原癌基因等基因表现出渐进式的表达改变, 且其表达水平还受到DNA甲基化等表观遗传因素的精密调控^[45]。

在从基础研究转向临床应用时, 寻找更易于检测脓毒症的生物标志物成为关键。例如, 血清游离DNA水平的升高已被证实与脓毒症相关急性肾损伤患者较高的病死率显著相关, 提示其作为预后评估工具的潜力^[46]。有研究团队通过对大量患者血浆样本进行高通量质谱分析, 成功绘制出脓毒症血浆蛋白全景图, 并观察到以CRP、血清淀粉样蛋白A1为代表的急性期蛋白模块表达水平显著升高, CRP、血清淀粉样蛋白A1可作为有效的诊断及预警生物标志物^[47]。另有研究证实存在与器官功能障碍和其致死率相关的特定蛋白质组学模式, 例如, 谷胱甘肽过氧化物酶3等9种蛋白与严重器官功能障碍（SOFA评分 > 6分）显著相关, 而簇集蛋白等另外22种蛋白则与最终的致死率紧密关联^[48]。最后, 前沿技术组合策略也为脓毒症研究带来重要启示。例如, 有学者联合外泌体多组学分析技术、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术与深度学习算法构建了针对癌症的精准分型策略, 其整合分析的理念为未来脓毒症的临床研究提供了极具价值的借鉴思路^[49]。

这些突破性进展标志着脓毒症诊断正经历三大转变：从单一组学向多模态数据整合、从静态指标检测向动态过程监控、从经验性判断向分子分型指导的精准干预。然而, 相关研究的临床转化仍需解决生物标志物验证及标准化、多中心数据整合验证等关键问题。

5. 总结与展望

当前, 烧伤脓毒症的早期诊断依然面临巨大挑战, 传统的炎症生物标志物在烧伤患者中应用受到限制。血浆外泌体能够反映细胞的生理病理状态, 具有作为脓毒症预警和诊断生物标志物的潜力。特别是多组学整合分析技术, 结合先进的生物信息学分析方法和机器学习算法, 为全面解析外泌体的分子特征提供了有力的技术支撑。这些技术不仅能够系统揭示外泌体在脓毒症复杂细胞分子调控网络中的作用, 还可通过高通量筛选和智能算法分析, 精准识别脓毒症的早期预警分子和关键调控靶点, 为烧伤脓毒症的早期诊断和精准治疗提供重要的理论依据和技术支持。

Funding Statement

国家自然科学基金重点项目（81530064）；陕西省重点研发计划项目（2023-ZDLSF-24）

Key Program of National Natural Science Foundation of China (81530064); Shaanxi Provincial Key Research and Development Program of China (2023-ZDLSF-24)