Abstract
目的
探讨环状RNA（circ_0000437）对乳腺癌细胞功能的影响及其分子机制。
方法
体外培养人乳腺细胞（MCF-10A）和人乳腺癌细胞（MCF-7和MDA-MB-231），乳腺癌细胞经过分别转染后设置sh-circ_0000437组、mimics组、inhibitor组、si-CTPS1组及其阴性对照组、sh-NC+inhibitor-NC组、sh-circ_0000437+inhibitor-NC组、sh-circ_0000437+inhibitor组、sh-NC+pcDNA-NC组、sh-circ_0000437+pcDNA-NC组、sh-circ_0000437+pcDNA-CTPS1组。qRT-PCR检测乳腺癌细胞株或组织中circ_0000437、let-7b-5p、CTPS1、Notch1、Hes1和Numb的基因表达水平，RNase R检测鉴定circ_0000437的环状结构，亚细胞定位检测显示circ_0000437在乳腺癌细胞中的分布，CCK-8检测细胞增殖能力，Transwell实验检测细胞侵袭能力，划痕实验检测细胞迁移能力，双荧光素酶报告基因和RNA免疫共沉淀实验探究circ_0000437/let-7b-5p/CTPS1间的结合位点，Western blotting检测细胞中CTPS1，E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白表达，小鼠体内成瘤实验验证circ_0000437与CTPS1在体内促癌的作用机制。
结果
Circ_0000437和CTPS1在乳腺癌组织和细胞系中的表达均上调，let-7b-5p在乳腺癌组织和细胞系中的表达下调（P<0.01），敲低circ_0000437或CTPS1均可抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化（P<0.05），过表达let-7b-5p同样抑制乳腺癌的恶性生物学行为，而抑制let-7b-5p则相反（P<0.05），sh-circ_0000437+pcDNA-NC组的乳腺癌细胞在小鼠体内的生长速度低于sh-NC+pcDNA-NC组，sh-circ_0000437+pcDNA-CTPS1组生长速度高于sh-circ_0000437+pcDNA-NC组（P<0.01），circ_0000437和let-7b-5p、let-7b-5p和CTPS1之间存在结合位点（P<0.01），circ_0000437，let-7b-5p和CTPS1在乳腺癌细胞中存在相互作用（P<0.05）。
结论
Circ_0000437在乳腺癌组织和细胞中表达上调，且circ_0000437可以通过let-7b-5p/CTPS1轴促进乳腺癌细胞的增殖，侵袭，迁移以及上皮间质转化。
Keywords: 乳腺癌, 上皮间质转化, 环状RNA, 竞争性内源RNA
Abstract
Objective
To investigate the role of circular RNA circ_0000437 in regulating biological behaviors of breast cancer cells and the molecular mechanism.
Methods
Breast cancer MCF-7 and MDA-MB-231 cells were transfected with sh-circ_0000437, mimics, inhibitor, si-CTPS1, or their respective negative controls. qRT-PCR was used to detect the expression levels of circ_0000437, let-7b-5p, CTPS1, Notch1, Hes1, and Numb in breast cancer cell lines and tissues. RNase R digestion was used to confirm the circular structure of circ_0000437 and its subcellular localization in the breast cancer cells was determined by cellular distribution analysis. The changes in proliferation, invasion and migration of the transfected cells were assessed using CCK-8 assay, Transwell assay and scratch assay. Dual-luciferase reporter gene and RNA immunoprecipitation assays were employed to validate binding interactions among circ_0000437, let-7b-5p, and CTPS1. The cellular expressions of CTPS1, E-cadherin, N-cadherin, and vimentin proteins were detected with Western blotting. A tumor-bearing mouse model was used to verify the oncogenic mechanism of circ_0000437 and CTPS1.
Results
Circ_0000437 and CTPS1 were upregulated while let-7b-5p was downregulated in breast cancer tissues and cell lines. Circ_0000437 or CTPS1 knockdown obviously suppressed breast cancer cell proliferation, invasion, migration and epithelial-mesenchymal transition (EMT). Overexpression of let-7b-5p produced similar inhibitory effects, whereas inhibition of let-7b-5p significantly enhanced malignant behaviors of the cells. In the tumor-bearing mouse models, circ_0000437 knockdown significantly suppressed tumor growth, but co-transfection of the cells with pcDNA-CTPS1 accelerated tumor growth. Binding sites were identified between circ_0000437 and let-7b-5p and between let-7b-5p and CTPS1, and circ_0000437, let-7b-5p, and CTPS1 showed functional interactions in breast cancer cells.
Conclusion
Circ_0000437 is upregulated in breast cancer tissues and cells, and its high expression promotes proliferation, invasion, migration and EMT of breast cancer cells through the let-7b-5p/CTPS1 axis.
Keywords: breast cancer, epithelial-mesenchymal transition, circular RNA, ceRNA
乳腺癌是全球女性健康的首要威胁，其发病率占女性恶性肿瘤的31%［1］。根据分子分型，乳腺癌可分为雌激素或孕激素受体阳性（ER+/PR+）、HER2阳性及三阴性乳腺癌（TNBC）［2］。其中，TNBC因雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体2（HER2）的同步缺失，缺乏有效靶向治疗方案，表现出高侵袭性和不良预后［3］。尽管综合治疗手段（如化疗、免疫治疗）的应用改善了患者生存率，但晚期乳腺癌的转移复发仍是临床治疗失败的核心问题［4］。环状RNA（circRNA）是一类广泛存在于真核细胞的内源性非编码RNA，由前体mRNA通过反向剪接过程生成 ［5， 6］。多数circRNA定位于细胞质，少数分布于细胞核。研究表明，circRNA的表达水平与疾病状态相关，尤其在癌症中可通过“海绵”功能调控基因表达［7-9］。例如，circRNA通过竞争性内源RNA（ceRNA）机制与微小RNA（miRNA）结合，阻断miRNA对靶基因mRNA的抑制作用，从而间接调控下游基因表达［10］。ceRNA机制揭示了RNA间相互作用的新模式：miRNA通过结合mRNA诱导基因沉默，而circRNA等ceRNA通过竞争性结合miRNA调控基因表达［11］。这种circRNA-miRNA-mRNA调控轴在肿瘤发生中尤为显著，通过改变基因转录水平影响乳腺癌等疾病的病理进程。
上皮间质转化（EMT）是上皮细胞向间质细胞表型转变的过程［12］。当EMT激活时，上皮标志物E-cadherin的表达显著下调，而间质标志物Vimentin和N-cadherin的表达则异常上调［13］。E-cadherin作为维持上皮细胞粘附连接的核心蛋白，其功能缺失直接导致细胞脱离原发灶；N-cadherin介导细胞的同型和异型粘附，Vimentin可维持细胞完整性并提供抗应激能力［14-16］。这些分子变化共同赋予癌细胞迁移、浸润及远处定植能力，最终驱动肿瘤转移。研究发现，circEZH2 可以通过上调KLF5以CXCR4诱导的方式促进乳腺癌的EMT导致乳腺癌肝转移［17］；circZFR可以通过miR-223-3p/FABP7轴促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT，并抑制细胞凋亡［18］；circ_0008717通过miR-326/GATA6轴促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭、转移和EMT［19］，这表明非编码RNA之间的竞争性结合也可以影响EMT过程。
Circ_0000437作为新型环状RNA，在肝癌、胃癌和风湿性心脏病中异常高表达并促进疾病进展［20-22］，但其在乳腺癌中的功能及机制尚未明确。本研究基于circRNA-miRNA-mRNA调控轴的理论，推测circ_0000437可能通过ceRNA机制调控乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT。本研究通过生物信息学筛选癌与癌旁组织差异表达的circRNA、miRNA和mRNA，获取基因序列，并预测分子间结合位点，最终构建并验证该调控轴在乳腺癌中的功能。
1. 材料和方法
1.1. 材料
乳腺癌组织标本及其相应的邻近正常组织取自40例未经术前化疗或放疗的患者。切除的组织样本在液氮中快速冷冻，以备后续实验。本研究获得了皖南医学院第一附属医院伦理委员会的批准（伦理批号：2020伦审研第21号）。人正常乳腺细胞株（MCF-10A）和乳腺癌细胞株（MCF-7和MDA-MB-231）购自中国科学院细胞库（上海），在含有10%胎牛血清（Gibco）的Dulbecco's Modified Eagle's Medium （DMEM，Hyclone）中培养，培养箱条件为37 ℃、5% CO2。circRNA逆转录和荧光定量PCR试剂盒［宝日生物技术（北京）有限公司］，miRNA和mRNA逆转录和荧光定量PCR试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］，Lipofectamine 2000转染试剂、PARIS Kit试剂盒（赛默飞世尔科技公司），sh-NC、sh-circ_0000437、pcDNA-NC、pcDNA-CTPS1（苏州吉玛基因股份有限公司），Trizol试剂、mimics-NC、mimics、inhibitor-NC、inhibitor、CTPS1-NC、si-CTPS1（滁州通用生物科技有限公司），RNase R（广州吉赛生物科技股份有限公司），Transwell小室、基质胶（Biozellen），CCK-8试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体（上海碧云天生物技术有限公司），RIP™ RNA 结合蛋白免疫沉淀试剂盒，结晶紫染液（西格玛奥德里奇贸易有限公司），CTPS1（CST），β-actin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin单克隆抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司）。
1.2. 方法
1.2.1. 转染、提取和qRT-PCR
用lipofectamine 2000转染试剂将sh-circ_0000437、sh-NC、mimics、mimics-NC、inhibitor、inhibitor-NC、si-CTPS1、CTPS1-NC、pcDNA-NC、pcNDA-CTPS1转入乳腺癌细胞，将乳腺癌细胞分为sh-circ_0000437组（敲减circ_0000437表达）、sh-NC组（sh-circ_0000437组的对照）、mimics组（模拟活体miRNA活性）、mimics-NC组（mimics组的对照）、inhibitor组（抑制活体miRNA活性）、inhibitor-NC组（inhibitor组的对照）、si-CTPS1组（敲低CTPS1的表达）、CTPS1-NC组（si-CTPS1组的对照）、sh-NC+inhibitor-NC组（对照）、sh-circ_0000437+inhibitor-NC组（敲减circ_0000437表达）、sh-circ_0000437+inhibitor组（同时抑制circ_0000437和let-7b-5p表达）、sh-NC+pcDNA-NC组（对照）、sh-circ_0000437+pcDNA-NC组（敲减circ_0000437表达）、sh-circ_0000437+pcDNA-CTPS1（同时敲减circ_0000437表达并过表达CTPS1）。使用Trizol试剂从组织或细胞系中分离总RNA。使用circRNA、miRNA、mRNA逆转录和荧光定量PCR试剂盒检测目的基因的相对表达量，每个样品做3个重复孔，以GAPDH和U6为内参，用2-∆∆CT计算目的基因的相对表达量，circ_0000437的PCR引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］；CORO1C、CTPS1、Notch1、Hes1、Numb、GAPDH、let-7b-5p及U6的PCR引物（滁州通用生物科技有限公司）。引物序列（表1）。
表1.
引物序列
Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR
| Gene name | Primer sequence (s) |
|---|---|
| Circ_0000437 | F:5'-AATCCCCGTACGTCCACTAC-3' |
| R:5'-AGGGTCATAGAAAGGCAGCA-3' | |
| CORO1C | F:5'-ATGAGGCGGCACATATAC-3' |
| R:5'-ATCCCAGGTCACACGAGAAAC-3' | |
| CTPS1 | F:5'-CAGTGTGGGCACAATACTCAA-3' |
| R:5'-CGCTCATAGTTACCCAGGTCA-3' | |
| Notch1 | F:5'-CGAACCCGTGCCAGAA-3' |
| R:5'-CAGATGCCCAGTGAAGC-3' | |
| Hes1 | F:5'-CAGTGCCTTTGAGAAGCAGG-3' |
| R:5'-CAGATAACGGGCAACTTCGG-3' | |
| Numb | F:5'-CACAACTGCCACTGAGCAAG-3' |
| R:5'-GTTGCCAGGAGCCACTGAT-3' | |
| GAPDH | F:5'-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3' |
| R:5'-GTGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3' | |
| let-7b-5p | 5'-GCTGAGGTAGTAGGTTGTGTGGG-3' |
| U6 | 5'-CGCTTCGGCACATATAC-3' |
1.2.2. 核糖核酸外切酶（RNase R）检测
于37℃，将浓度为20 U/μL的10 U RNase R加入到2.5 μg 乳腺癌细胞的总RNA中孵育30 min。以处理前的总RNA中的circ_0000437和CORO1C（circRNA的同源线性转录本）作为对照，对circ_0000437和CORO1C进行qRT-PCR。
1.2.3. 亚细胞定位检测
使用PARIS Kit分离细胞质和细胞核RNA。用细胞质裂解液裂解细胞，以12 000g离心15 min，上清液作为细胞质部分收集。所得沉淀用核洗涤液洗涤2次，然后收集作为核部分。通过qRT-PCR检测细胞核和细胞质中circ_0000437、U6和GAPDH的表达。GAPDH或U6分别作为细胞质或细胞核中的对照。
1.2.4. CCK-8实验
将生长良好的MCF-7和MDA-MB-231细胞接种到24孔板中，3个重复孔/组，每重复孔5000个细胞。每组转染细胞在0、24、48、72 h用PBS溶液洗涤1次后，分别加入10 μL CCK-8溶液和40 μL完全培养基，于37 ℃孵育1 h后用酶标仪测定吸光度A 450 nm值。
1.2.5. Transwell侵袭实验
Matrigel基质凝胶在4 ℃下融化过夜，所有设备预冷。将细胞密度设为1×105/mL，并在上腔加入200 µL不含FBS的细胞悬液。在下腔加入500 µL含20% FBS的温热细胞培养液，放回上腔，在细胞培养箱中放置24 h。吸出上腔液体，用PBS缓冲液清洗3次，在下腔新孔中加入500 µL多聚甲醛（4%），然后放入上腔室温固定30 min，晾干；在下腔新孔中加入500 µL结晶紫，然后放入上腔染色20 min。用棉签小心擦去上腔的细胞，PBS冲洗3次，用显微镜观察、拍照和计数上腔底部的细胞。
1.2.6. 划痕实验
将生长良好的MCF-7和MDA-MB-231细胞接种到6孔板中，24 h后每组分别进行转染。在显微镜下观察6孔板中细胞的形态和密度，如细胞形态良好且密度达到100%，则可进行划痕实验。用2 mL PBS缓冲液冲洗每孔细胞表面2次。用100 µL吸头在每个孔的中间垂直划2条直线，然后用PBS缓冲液反复冲洗细胞表面，直到没有漂浮的细胞碎片为止。加入2 mL/孔含1% FBS的完全培养液，以排除血清对细胞迁移的影响。0 h时在显微镜下拍摄划痕照片，常规培养后将6孔板放入细胞培养箱中培养48 h后在相同位置拍照。划痕结果用Image J软件处理。
1.2.7. 双荧光素酶基因报告实验
转染前1 d晚上取细胞，将1×105个细胞接种到24孔板中，以确保转染时70%~80%的细胞密度。用lipofectamine 2000试剂将circ_0000437-野生型（WT）质粒（包含靶基因的3'UTR序列）和突变型（MUT）质粒（包含靶基因的3'UTR突变序列）分别与mimics-NC和mimics共转染，将CTPS1- WT质粒或MUT质粒分别与mimics-NC或mimics共转染，48 h后检测各组的荧光素酶活性强度。
1.2.8. RNA免疫共沉淀（RIP）实验
使用RIP™ RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒进行RIP检测。将乳腺癌细胞在冰上用RIP缓冲液裂解，将磁珠偶联抗体［IgG抗体：非特异性抗体，阴性对照；AgO2抗体：成熟的miRNA分子可与AgO蛋白家族形成RNA沉默复合体（RISC），针对这种AgO蛋白，利用抗体，经RISC免疫沉淀，即miRNA与靶mRNA共沉淀，由此可回收miRNA］加入EP管中，然后移除上清液并置于磁架上；向每个管中加入900 μL RIP 缓冲液，吸取100 μL细胞裂解液上清液加入磁珠抗体复合物中。混合物在4 ℃下孵育3 h。为使磁珠抗体复合物重新悬浮，向每个样本中加入150 μL蛋白酶K溶液。在55 ℃下孵育30 min后，移除上清液并提取RNA。提取的RNA用于qRT-PCR。
1.2.9. Western blotting
按99∶1的比例配制RIPA裂解缓冲液和苯磺酰氟，转染后在冰上提取6孔板中的细胞总蛋白，用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定各蛋白样本的浓度。取40 μg蛋白在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电压90 V持续90 min；凝胶在300 mA下电转70 min，得到的条带在5%脱脂奶中4 ℃摇床封闭孵育1 h。封闭后的条带分别与1∶1000 CTPS1、β-actin，1∶2000 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的兔抗人单克隆抗体4 ℃孵育过夜，第2天使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体在室温下避光孵育2 h；使用TBST溶液清洗3遍。在避光条件下，加入ECL化学发光液，在成像仪上观察结果。
1.2.10. 异种移植成瘤试验
本研究方案经皖南医学院动物伦理委员会审查批准（伦理批号：LLSC-2022-233）。无胸腺裸鼠（年龄4周，体质量20~25 g）购于河南斯贝克斯实验动物中心，根据相关的动物实验的伦理要求和饲养规范在皖南医学院SPF级实验动物中心进行饲养。将约1×106个稳定表达sh-NC+pcDNA-NC、sh-circ_0000437+pcDNA-CTPS1、sh-circ_0000437+pcDNA-NC的MCF-7细胞注射到小鼠乳房皮下（n=5），每隔5 d用直尺测量肿瘤尺寸，并按以下公式计算肿瘤大小：体积（mm3）=（长×宽2）/2。25 d后，颈椎脱臼法处死小鼠，收集肿瘤并拍照，比较sh-NC+pcDNA-NC组与sh-circ_0000437+pcDNA-NC组以及sh-circ_0000437+pcDNA-NC组与sh-circ_0000437+pcDNA-CTPS1组的肿瘤大小。
1.3. 统计学分析
采用SPSS17.0和GraphPad Prism8.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，两组独立样本间的比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. Circ_0000437在乳腺癌中的表达特征
qRT-PCR结果显示circ_0000437在两种癌细胞系中的表达量均高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A，其在MCF-7中的表达量是MCF-10A的2.3倍，在MDA-MB-231中的表达量是MCF-10A的3.5倍（P<0.001，图1A）。合并GEO数据库中的2个数据集GSE165884和GSE182471后发现circ_0000437在肿瘤组织中的表达高于匹配的正常组织（P<0.01，图1B），40对乳腺癌组织的qRT-PCR结果分析显示，与相应的正常组织相比，circ_0000437在肿瘤组织中的表达更高（P<0.01，图1C）。RNase R处理2种乳腺癌细胞系中的总RNA的qRT-PCR结果显示，2种乳腺癌细胞中CORO1C的表达均有降低（P<0.001，图1D），而circ_0000437的表达差异无统计学意义（P>0.05）。circ_0000437在乳腺癌细胞（MCF-7和MDA-MB-231）中的亚细胞定位分析表明，与细胞核相比，circ_0000437在细胞质中的表达更为丰富（图1E）。
图1.
乳腺癌组织和细胞中circ_0000437的表达特征
Fig.1 Expression levels of circ_0000437 in breast cancer cells and tissues. A: Expression of circ_0000437 in breast cancer cell line. B: Expression of circ_0000437 in datasets GSE165884 and 182471. C: Expression of circ_0000437 in breast cancer tissues. D: Expression of circ_0000437 and linear CORO1C in two breast cancer cell lines treated with RNase R. E: Subcellular localization of circ_0000437 in breast cancer cells. **P<0.01, ***P<0.001.
2.2. Circ_0000437对乳腺癌细胞恶性表型的影响
qRT-PCR结果显示，sh-circ_0000437组circ_0000437的表达量低于sh-NC对照组（P<0.001，图2A、B）。CCK-8试验显示，与sh-NC对照组相比，转染sh-circ_0000437的乳腺癌细胞的生长速度低于sh-NC组；Transwell实验表明，sh-circ_0000437组乳腺癌细胞向下层迁移和侵袭的数量少于sh-NC组；划痕实验表明，sh-circ_0000437组乳腺癌细胞的愈合率低于sh-NC组（P<0.05，图2C~E）。Western blotting实验结果显示，与sh-NC组相比，sh-circ_0000437组的E-cadherin含量增加，N-cadherin和Vimentin含量降低（P<0.05，图2F）。
图2.
敲减circ_0000437对乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移和EMT的影响
Fig.2 Effects of circ_0000437 knockdown on proliferation, invasion, migration and EMT of breast cancer cells. A, B: Gene knockout efficiency and fluorescence staining of the cells after lentivirus transfection (Original magnification: ×100). C: CCK-8 assay for assessing the effect of circ_0000437 on cell proliferation. D: Transwell assay for assessing the effect of circ_0000437 on cell invasion (×400). E: Scratch assay for assessing the effect of circ_0000437 on cell migration (×100). F: Western blotting for assessing the effect of circ_0000437 on EMT in breast cancer cells. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
2.3. let-7b-5p是circ_0000437的下游靶基因
TCGA数据库中乳腺癌的高通量基因测序数据（HTSeq-Count）表明，let-7b-5p在正常组织中的表达水平高于肿瘤组织（P<0.001，图3A），结合miRanda和RNAAhybrid的数据发现汇集位点位于chr12：109046133-109046153［-］（图3B）。双荧光素酶实验结果显示，在转染circ_0000437-WT质粒的实验中，与mimics-NC组相比，mimics组的荧光素酶活性降低（P<0.01），转染circ_0000437-MUT质粒的实验中，mimics-NC组与mimics组的荧光素酶活性差异无统计学意义（P>0.05，图3C）；RIP实验显示，相对于IgG对照组，circ_0000437和let-7b-5p在含AgO2的微核蛋白复合物中明显富集（P<0.01，图3D）。
图3.
Circ_0000437与let-7b-5p存在结合位点
Fig.3 Circ_0000437 has a binding site with let-7b-5p. A: Expression of let-7b-5p in breast cancer in TCGA database. B: The predicted binding diagram and binding sequence of let-7b-5p and circ_0000437. C: Luciferase activity in the cells co-transfected with mimics or mimics-NC and circ_0000437 WT plasmid or MUT plasmid. D: RIP analysis showing enrichment of circ_0000437 and let-7b-5p in the AGO2 part. **P<0.01, ***P<0.001.
2.4. 过表达let-7b-5p对乳腺癌细胞恶性表型的影响
qRT-PCR检测发现let-7b-5p在正常乳腺细胞MCF-10A中，let-7b-5p的表达量比MCF-7高2.9倍，比MDA-MB-231高1.93倍（P<0.001，图4A），在正常组织中的表达量高于癌组织（P<0.01，图4B）。与mimics-NC组相比，mimics组中的let-7b-5p表达上调（P<0.001，图4C），乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移和EMT明显被抑制（P<0.05，图4D~G）。
图4.
过表达let-7b-5p抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移和EMT
Fig.4 Overexpression of let-7b-5p inhibits proliferation, invasion, migration and EMT of breast cancer cells. A, B: Expression of let-7b-5p in breast cancer tissues and cell lines. C: Transfection efficiency of let-7b-5p mimics. D: CCK-8 analysis to evaluate the effects of mimics on cell proliferation. E: Transwell assay to verify the effect of mimics on cell invasion (×400). F: Effect of mimics on cell migration determined using scratch assay (×100). G: Effect of mimics on EMT in breast cancer cells. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
2.5. 抑制let-7b-5p对乳腺癌细胞恶性表型的影响
与inhibitor-NC组相比，inhibitor组中的let-7b-5p表达下调（P<0.001，图5A），促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移和EMT（P<0.05，图5B~E）。
图5.
抑制let-7b-5p抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移和EMT
Fig.5 Inhibition of let-7b-5p suppresses proliferation, invasion, migration and EMT of breast cancer cells. A: Transfection efficiency of let-7b-5p inhibitor. B: CCK-8 analysis to evaluate the effects of inhibitor on cell proliferation. C: Transwell assay to verify the effect of inhibitor on cell invasion ability (×400). D: Effect of the inhibitor on cell migration determined using scratch assay (×100). E: Effect of the inhibitor on EMT in breast cancer cells. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
2.6. CTPS1在乳腺癌中的表达
TCGA数据库显示，CTPS1在乳腺癌组织中的表达水平高于乳腺正常组织（P<0.001，图6A），qRT-PCR检测乳腺癌组织中CTPS1高于乳腺正常组织（P<0.01，图6B），MCF-7和MDA-MB-231的CTPS1表达量分别是MCF-10A的2.12倍和5.27倍（P<0.001，图6C）。通过生信手段预测到CTPS1与let-7b-5p之间存在结合位点（图6D），双荧光素酶基因报告结果显示，在转染CTPS1-WT实验中，mimics组的荧光素酶活性与mimics-NC组相比降低（P<0.01，图6E）；而在转染CTPS1-MUT实验中，mimics组的荧光素酶活性与mimics-NC组的差异无统计学意义（P>0.05，图6E）。
图6.
CTPS1在乳腺癌中表达上调
Fig.6 Expression of CTPS1 up-regulated in breast cancer. A: Expression of CTPS1 in breast cancer in TCGA database. B, C: Expression of CTPS1 in breast cancer tissues and cell lines. D: Predicted CTPS1 and let-7b-5p binding sites. E: Mimics or mimics-NC were co-transfected with CTPS1 WT plasmid or MUT plasmid, respectively, and luciferase activity was measured in each group. **P<0.01, ***P<0.001.
2.7. CTPS1促进乳腺癌EMT并调控Notch通路
与CTPS1-NC组相比，si-CTPS1组的乳腺癌细胞表现出较低的CTPS1 mRNA和蛋白表达，乳腺癌细胞EMT受到抑制（P<0.05，图7A~C），乳腺癌细胞中Notch1和Hes1表达下降，Numb表达上升（P<0.05，图7D）。
图7.
敲低CTPS1抑制乳腺癌细胞EMT并影响Notch信号通路
Fig.7 CTPS1 knockdown inhibits EMT and regulates the Notch signaling pathway in breast cancer cells. A: Knockdown efficiency after transfection with si-CTPS1. B: Western blotting for assessing the effect of si-CTPS1 on expression of CTPS1 protein in breast cancer cells. C: Western blotting for assessing the effect of CTPS1 on EMT of breast cancer cells. D: qRT-PCR for assessing the effect of si-CTPS1 on the expression of genes related to the Notch signaling pathway. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
2.8. CTPS1促进乳腺癌增殖，侵袭和迁移
CCK-8、transwell和划痕实验表明，相较于CTPS1-NC组，si-CTPS1组的乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力下降（P<0.05，图8A~C）。
图8.
敲低CTPS1抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移
Fig.8 CTPS1 knockdown inhibits proliferation, invasion and migration of breast cancer cells. A: CCK-8 assay for evaluating the effect of transfection with si-CTPS1 on cell proliferation. B: Transwell assay for assessing the effect of transfection with si-CTPS1 on cell invasion ability (×400). C: Effect of transfection with si-CTPS1 on cell migration determined using scratch assay (×100). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
2.9. Circ_0000437/let-7b-5p轴对CTPS1蛋白表达的影响
与sh-NC组相比，sh-circ_0000437组乳腺癌细胞的CTPS1表达下降（P<0.05，图9A）；与mimics-NC组相比，mimics组乳腺癌细胞的CTPS1表达下降（P<0.05，图9B）；与inhibitor-NC组相比，inhibitor组乳腺癌细胞的CTPS1表达上升（P<0.01，图9C）。
2.10. Circ_0000437通过let-7b-5p/CTPS1调节乳腺癌细胞EMT
与sh-NC+inhibitor-NC组相比，sh-circ_0000437+inhibitor-NC组乳腺癌细胞的let-7b-5p表达呈上升趋势，而与sh-circ_0000437+inhibitor-NC组相比，sh-circ_0000437+inhibitor组let-7b-5p表达下降（P<0.01，图10A）。与sh-NC+inhibitor-NC组相比，sh-circ_0000437+inhibitor-NC组乳腺癌细胞的CTPS1 mRNA和蛋白表达下降，EMT受到抑制（P<0.01），与sh-circ_0000437+inhibitor-NC组相比，sh-circ_0000437+inhibitor组CTPS1 mRNA和蛋白表达上调，EMT受到促进（P<0.05，图10B~D）。
图10.
Circ_0000437可以通过let-7b-5p/CTPS1轴促进乳腺癌细胞EMT
Fig.10 Circ_0000437 promotes EMT in breast cancer cells by regulating the let-7b-5p/CTPS1 axis. A: Expression of let-7b-5p in each group (sh-NC+inhibitor-NC, sh-circ_0000437+inhibitor-NC, and sh-circ_0000437+inhibitor) detected by qRT-PCR. B: qRT-PCR for detecting CTPS1 mRNA expression in breast cancer cells in each group. C: Western blotting for detecting the expression of CTPS1 protein in breast cancer cells in each group. D: Western blotting for detecting the expression of EMT-related proteins in breast cancer cells in each group. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
2.11. Circ_0000437作为let-7b-5p的“海绵”影响乳腺癌细胞增殖，侵袭和迁移
与sh-NC+inhibitor-NC组乳腺癌细胞相比，sh-circ_0000437+inhibitor-NC组的增殖，侵袭和迁移能力下降（P<0.01，图11A~C）；与sh-circ_0000437+inhibitor-NC组相比，sh-circ_0000437+inhibitor组的增殖，侵袭和迁移能力上升（P<0.05，图11A~C）。
图11.
Circ_0000437 作为 let-7b-5p 的分子海绵,促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移
Fig.11 Circ_0000437 promotes proliferation, invasion, and migration of breast cancer cells as a molecular sponge for let-7b-5p. A: CCK-8 assay of the breast cancer cells. B: Transwell assay of the breast cancer cells (×400). C: Scratch assay of the breast cancer cells (×100). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
2.12. 敲减circ_0000437可以抑制小鼠体内肿瘤生长
根据异种移植成瘤实验的结果，与sh-NC+pcDNA-NC组相比，sh-circ_0000437+pcDNA-NC组肿瘤的体积更小（图12A），生长速度明显下降，质量明显更小（P<0.001，图12B、C），与sh-circ_0000437+pcDNA-NC组相比，sh-circ_0000437+pcDNA-CTPS1组肿瘤的体积更大（图12A），生长速度上升，质量增加（P<0.01，图12B、C）。
图12.
小鼠体内肿瘤模型的构建
Fig.12 Construction of the tumor-bearing model in mice. A: Comparison of tumor volume 25 days after cell inoculation. B: Tumor growth curve in the mice. C: Comparison of tumor weight. **P<0.01, ***P<0.001.
3. 讨论
许多circRNA在多种癌症组织特别是乳腺癌中呈现显著差异表达特征，其异常表达与肿瘤发生发展密切相关。circRNA具有共价闭环结构，没有5'帽和3'poly（A）尾，因此非常稳定，对RNase R不敏感［23］。大多数circRNA位于细胞质中，只有极少数存在于细胞核中［24］。基于GEO数据集GSE165884和GSE182471的筛选分析发现，circ_0000437在乳腺正常组织与癌组织间存在显著表达差异。既往文献虽也有对circ_0000437在疾病中的发生发展进行研究［20-22］，但并未深入研究其调控机制，且目前还缺乏关于circ_0000437在乳腺癌中作用的报道。本研究细胞实验结果显示，大部分circ_0000437位于乳腺癌细胞细胞质中，circ_0000437很可能参与了ceRNA机制，从而调控乳腺癌的发生过程，而且circ_0000437在乳腺癌组织和细胞中的表达水平明显上调，还具有促进乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移和EMT的作用，因此circ_0000437具有一定的科研价值。
本研究生物信息学分析提示，circ_0000437与let-7b-5p存在特异性结合位点，且let-7b-5p在乳腺正常组织中的表达水平显著高于癌组织。既往研究已经证明，let-7b-5p是多种癌症的肿瘤抑制因子。有研究发现let-7b-5p可以通过靶向DDX19A抑制卵巢癌细胞的恶性行为［25］；有研究发现let-7b-5p通过靶向NKD1抑制APC泛素化降解和Wnt通路抑制结肠癌的进展［26］；也有研究发现let-7b-5p通过负调控KIAA1377来抑制食管鳞癌细胞的增殖和迁移［27］。根据既往研究结果推测let-7b-5p在乳腺癌中也可以抑制肿瘤生长，细胞实验结果显示let-7b-5p可以抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移和EMT。
本研究双荧光素酶报告基因实验和RIP实验验证了circ_0000437与let-7b-5p之间的结合位点。细胞实验结果表明，沉默circ_0000437会增加let-7b-5p在乳腺癌细胞中的表达水平，而共转染组中的inhibitor可以逆转sh-circ_0000437的抑癌作用，这表明circ_0000437可能通过充当let-7b-5p的“海绵”而发挥致癌作用。
三磷酸胞嘧啶（CTP）是细胞中的基本核苷酸，其合成的限速酶是CTP合成酶（CTPS）［28］。CTP是细胞中的一种限制性核苷酸，其合成遵循2条途径：一条是由核酸降解衍生的胞苷通过补救途径生成CTP，另一条是依赖CTPS活性的从头合成途径［29］。CTPS作为核酸和磷脂合成途径中的一种关键酶，在肾癌和肝癌中活性增加，是一种很有前景的治疗靶点［30］。在人体中，CTPS的活性依赖于两种结构特性高度保守的酶，即分别由CTPS1和CTPS2基因编码的CTP合成酶1和2（CTPS1和CTPS2）［31］。有研究发现，与正常结肠组织相比，CTPS1在结肠癌组织中明显上调，CTPS1通过p53通路促进结直肠癌细胞的进展［32］；也有研究发现CTPS1的升高不利于胰腺癌患者的预后［33］。TCGA数据库显示CTPS1在乳腺癌中的表达显著上调，且let-7b-5p与CTPS1有结合位点，双荧光素报告实验对于两者之间的结合位点进行了验证，Western blotting结果显示CPTS1蛋白的表达与circ_0000437表达成正相关，与let-7b-5p表达成负相关，细胞实验结果证实CTPS1在乳腺癌细胞和组织中显著增高，敲减CTPS1能抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移和EMT，qRT-PCR检测发现si-CTPS1组乳腺癌细胞Notch信号通路蛋白Notch1、Hes1基因表达显著降低，Notch信号通路负向调控因子Numb基因表达显著上调，这说明敲减CTPS1能抑制乳腺癌细胞中的Notch信号通路，CTPS1可以通过Notch信号通路对乳腺癌细胞的生长进行调控，异种移植成瘤实验显示过表达CTPS1可以逆转敲减circ_0000437对小鼠体内肿瘤生长的抑制作用，这表明circ_0000437可以通过结合let-7b-5p调控CTPS1的表达，从而促进乳腺癌细胞的生长发育。
综上，本研究证实了circ_0000437在乳腺癌细胞和组织中高表达，促进了乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移和EMT，并通过let-7b-5p/CTPS1轴促进了乳腺癌的发展。circ_0000437作为乳腺癌中一种显著表达上调的circRNA，其相较于mRNA具有更好的稳定性，不仅在乳腺癌的诊断上可以提供更精确的结果，而且与传统的mRNA疫苗相比，circRNA疫苗也具有更高的稳定性和更低的细胞毒性［34］，因此circ_0000437在日后也有望于为乳腺癌的诊断和免疫治疗提供新思路。但本研究仍有不足之处：本研究收集的病例数较少，可能需要进一步的收集标本来求证结果；circ_0000437不只有let-7b-5p这一个下游基因，circ_0000437/let-7b-5p/CTPS1轴仅是对乳腺癌发展影响作用显著的一条，对于circ_0000437在乳腺癌中的作用机制的研究可以向更多可能的下游靶基因进行拓展。
基金资助
国家级大学生创新创业项目（202210368025）；安徽省省级研究生创新创业实践项目（2022cxcysj184）
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