子午流注针法对失眠大鼠Glu/GABA-Gln代谢环路异常的调节作用

Abstract

Objective

To investigate the therapeutic effect of Ziwuliuzhu acupuncture in a rat model of insomnia and its regulatory effect on the glutamic acid (Glu)/γ-aminobutyric acid (GABA)-glutamine (Gln) metabolic loop.

Methods

Forty male SD rats were randomly assigned to control group, model group, Najia group and Nazi group (n=10). In the latter 3 groups, rat models of insomnia were established by intraperitoneal injections of p-chlorophenylalanine and verified using a sodium pentobarbital-induced sleep test. After modeling, the rats in Najia and Nazi groups received acupuncture for 7 days at specifically chosen sets of acupoints based on the Ziwuliuzhu rationale in traditional Chinese medicine. Pathological changes in the hypothalamic tissue of the rats were examined with HE staining, and the levels of Glu and GABA in the hypothalamus were determined with high-performance liquid chromatography (HPLC)-mass spectrometry (MS)/MS. Immunohistochemistry was used to detect the expressions of GABAA receptors (GABAARs) in the hypothalamus, and the expression levels of glutamate decarboxylase (GAD65/67) and glutamine synthetase (GS) were determined with Western blotting.

Results

Compared with the model group, the rats in Najia and Nazi groups exhibited decreased Glu levels and GABAA receptor expression and increased GABA levels with a decreased Glu/GABA ratio in the hypothalamus. Ziwuliuzhu acupuncture significantly increased the protein expressions of GAD65 and GAD67 and lowered the expression of GS in the hypothalamus in the rat models of insomnia.

Conclusion

Ziwuliuzhu acupuncture produces sedative and hypnotic effects in rat models of insomnia possibly by regulating Glu and GABA-Gln metabolism to restore the excitatory/inhibitory balance between Glu and GABA.

目前，失眠是世界上最严重的健康问题之一^［1］。临床医学通常使用镇静剂和安眠药来治疗失眠症，但这些药物很容易导致头晕、嗜睡，甚至药物依赖或成瘾^［2］。苯二氮卓类（BZ）药物和苯二氮卓类受体激动剂（BZRAs）是治疗失眠的两种最常用的临床药物，两者都是γ-氨基丁酸（GABA）受体激动剂，主要改变GABA和其他神经递质的作用^［3］。哺乳动物中枢神经系统中的主要抑制性神经递质是GABA，主要的兴奋性神经递质是谷氨酸（Glu）^［4］。星形胶质细胞在突触活动中摄取神经元释放的Glu，并通过谷氨酰胺合成酶（GS）将其转化为谷氨酰胺（Gln）^［5］。谷氨酸脱羧酶（GAD65或GAD67）直接从谷氨酸合成GABA^［6］。动物实验^{［7， 8］}表明，Glu和GABA之间的兴奋性/抑制性失衡与失眠的发生密切相关。大脑中的Glu和GABA代谢转换通过Glu/GABA-Gln代谢环路进行^［9］。

但失眠的主要治疗方法，如失眠的认知行为疗法（CBT-I）、BZ和BZRAs至少在30年前就被引入临床实践，但仍有大约40%的慢性失眠症患者通过这些治疗并不能达到持续的缓解，发病率和死亡率的增加与BZ和BZRAs摄入直接相关^［10］。中医药治疗失眠症方面疗效显著，针刺作为传统中医最常见的干预手段，可以增强局部血液循环，减少软组织的紧张和痉挛，加速组织修复，抑制炎症因子的产生^［11］。神经影像学和神经化学数据显示，针刺治疗慢性失眠患者的脑血流变化与 GABAA 和多巴胺-D1受体密切相关^［12］。此外，针刺还可以调节内脏功能，稳定心率，改善睡眠质量^［13］。

子午流注针法以中国时间医学为基础，纳甲法和纳子法是子午流注针法的主要选穴方法^{［14， 15］}。子午流注针法与现代生物钟基因相关联的时间节律性，在穴位选择、取穴时间、行针时间上的独特性，对神经与内分泌的相应调节表现出更加明显的积极效应，对失眠症有着特殊的治疗作用^［16］。大量临床研究证明，子午流注针法改善失眠症状的效果优于非子午流注针法^［17-19］，本研究团队在广州多家三甲医院开展了前瞻性多中心随机对照试验（RCT），并已完成了临床相关数据的分析。然而，子午流注治疗失眠症的具体作用机制尚不清楚，也没有动物实验研究对此进行探讨。本研究团队前期发现子午流注针法增加了失眠大鼠下丘脑Clock mRNA、Bmal1 mRNA和褪黑素（MT）含量的表达^［20］，但其具体机制及下游通路仍需进一步验证。

本研究旨在前期研究基础上观察子午流注针刺对失眠模型大鼠下丘脑Glu、GABA含量、GABAAR表达水平、GAD65、GAD67、GS表达水平的影响。此外，深入探讨Glu/GABA-Gln代谢环路与失眠的关系，为临床治疗失眠症提供理论依据。

1. 材料和方法

1.1. 实验动物与伦理声明

雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠40只，4~6周龄，SPF级，体质量220±20 g，购自北京华福康生物科技有限公司（京，动物证号：20210011）。所有大鼠在接受为期1周的随机隔离实验之前，都被提供了充足的食物和水。本研究方案在动物建模前即完成伦理审查与预注册，设定了明确的分组、干预方案及主要观察终点。暨南大学实验动物伦理委员会（伦理批号：SCXK（YUE）2017-0174）批准了实验规程（IACUC-20211229-05），并对所有实验人员进行了监督和指导。所有操作均按照《实验动物管理条例》进行。

1.2. 造模与分组

成年健康SPF级雄性SD大鼠40只，随机分为4组，10只/组：对照组、模型组、纳甲组和纳子组（后两组为不同方法的子午流注针刺组）。模型组、纳甲组和纳子组接受对氯苯丙氨酸（PCPA；DL-4-氯苯丙氨酸，Sigma，Burlington）的腹腔注射。PCPA混悬液（用0.9%氯化钠溶液配制成100 mg/mL，按450 mg/kg剂量给药）于上午9∶00 开始2 h内（广州当地当时巳时）腹腔注射，连续2 d。注射后36 h进行戊巴比妥钠睡眠协同实验，对失眠模型进行评价。

1.3. 戊巴比妥钠睡眠协同实验

末次治疗当晚20∶00，所有40 只大鼠均腹腔注射戊巴比妥钠溶液（默克，用0.9%氯化钠溶液配制成50 mg/mL，按35 mg/kg剂量给药），提前于手术台上将大鼠垂直仰卧铺开，大鼠于60 s内无翻动活动视为翻正反射现象消失。睡眠潜伏期记录时间为腹腔注射后致翻正反射消失的时间； 从睡眠潜伏期结束后继续计时，截止大鼠开始翻动身体的时间且大鼠30 s内不能维持仰卧体位的时间记录为睡眠持续时间。以睡眠潜伏时间、睡眠持续时间等参数判断模型复制情况及针刺治疗效果。

1.4. 动物治疗

在成功建立失眠模型后，对纳甲组和纳子组进行治疗。纳甲组按造模方法造模后，从实验第3天起，每天上午9∶00开始2 h内（广州当地当时巳时）按实验当时推算取穴（取穴方法见图1）进行针刺治疗， 1次/d，连续7 d。根据当地当时治疗时间以及《实验针灸学》中动物穴位图^［21］，连续7 d依次选取穴位［双侧阴谷穴（KI10）、双侧太冲穴（LR3）、双侧大陵穴（PC7）、双侧隐白穴（SP1）、双侧经渠穴（LU8）、双侧然谷穴（KI2）、双侧太冲穴（LR3）］进行针刺治疗（图1）。针刺方法：用0.22 mm×25 mm毫针（苏州华拓医疗器械有限公司），腧穴常规消毒后直刺0.3~0.5 mm，留针时间为30 min，只捻转不提插，执行平补平泻手法，每次行针时间为30 s，每次行针时间间隔10 min。纳子组按造模方法造模后，从实验第3天起，每天上午11∶00开始2 h内（广州当地当时午时）按实验当地当时选取心经原穴双侧神门穴（HT7）进行针刺治疗（图1），1次/d，连续7 d。针刺方法同纳甲法。造模前对照组给予等体积的0.9%氯化钠溶液腹腔注射，连续注射2 d。模型组、纳甲组、纳子组造模。造模后，对照组和模型组进行相同时间的立体定向固定（15 min/d），但不接受针刺治疗。在针灸过程中，所有的大鼠都用立体定向仪固定在适当的位置。

图1.

大鼠的俯卧位和仰卧位取穴图

Fig.1 Illustration of the locations of the chosen acupoints in rats in the prone and supine positions. Rats were stimulated using specific acupuncture points with anatomical correspondence to human acupoints. The SP1 (Yinbai) is located at the medial aspect of the big toe, approximately 0.1 cun posterior to the corner of the nail. LR3 (Taichong) is in the depression distal to the junction of the 1st and 2nd metatarsal bones. HT7 (Shenmen) is in the transverse crease of the wrist of the forepaw, radial to the flexor carpi ulnaris tendon. PC7 (Daling) is on the midpoint of the transverse crease of the wrist between the tendons of the palmaris longus and flexor carpi radialis. LU8 (Jingqu) is in the depression between the styloid process of the radius and the radial side, 1 cun above the transverse crease of the wrist. KI2 (Rangu) is located on the medial border of the foot, inferior to the tuberosity of the navicular bone, at the junction of the pink and pale skin. KI10 (Yingu) is located on the medial side of the popliteal fossa between the tendons of the semitendinosus and semimembranosus.

1.5. 组织学取材

在治疗结束后的12 h内，收集大鼠的样本，并将它们放置在立体定向仪中。所有大鼠在治疗后禁食休息，并予2%戊巴比妥钠（0.15 mL/100 g）腹腔注射。腹主动脉采血2 mL（肝素抗凝管，分离淋巴细胞备用）后，于冰台上断头取脑，从取出的脑组织中将下丘脑分离，镜下分别剥取SCN区脑组织，置入EP管，标记成组，保存在冰盒中。收集所有脑组织后，将标本组织从冰盒中转移到-80 ℃冰柜中保存。用多聚甲醛（4%，P1110-2）固定，石蜡包埋待用。

1.6. 苏木精伊红染色

下丘脑组织固定用以下参数脱水：二甲苯I（国药化学试剂有限公司）固定20 min。二甲苯II（国药化学试剂有限公司）固定20 min。100%乙醇I（国药化学试剂有限公司）浸泡5 min，100%乙醇II（国药化学试剂有限公司）浸泡5 min，75%乙醇浸泡5 min，然后用自来水冲洗。切片用苏木精染色3~5 min，然后用自来水冲洗。涂抹苏木精分化液后，用自来水冲洗，发蓝后再用自来水冲洗。切片在85%和95%乙醇中浸泡5 min后，用伊红染色（DIAPATH Giotto）5 min。切片脱水如下：二甲苯I号5 min，二甲苯II号5 min，100%乙醇I号5 min，100%乙醇II号5 min。最后，用中性树胶封住切片。切片在显微镜（Nikon eclipse E100）下检查，该显微镜也用于图像捕捉和分析。

1.7. 液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS/MS）

从大鼠下丘脑提取神经递质GABA和Glu。色谱柱为Waters Bradas Energy Holdings （BEH）色谱柱，以水（A相，含0.1%甲酸）和乙腈（B相，含0.1%甲酸）为洗脱溶剂。Waters Technology Co. 的洗脱梯度分别为1%B 0~2 min、2~90%B 2~4 min、90%B 4~4.5 min、90~1%B 4.5~5 min、1%B 5~6 min。流速0.2 mL/min，柱温40 ℃。样品经Waters Technology Co. 高效液相色谱 （UPLC）分离后，进入MS系统进行MS/MS分析检测。采用喷雾电离正离子模式检测，多反应模式扫描。定量离子对：M/Z 104→m/Z 45（γ-氨基丁酸）和m/Z 148→m/Z 84（谷氨酸）。

1.8. 免疫组织化学

固定、脱水、石蜡包埋、切片等步骤与上述1.6相同。下丘脑切片在水中脱蜡后用蒸馏水清洗。组织切片置于装满柠檬酸 （pH=6.0，G1202）抗原修复缓冲液的微波炉中进行抗原修复，放入磷酸盐缓冲盐水（pH=7.4，G0002）中，在脱色摇床上摇动3次， 5 min/次。将切片置于3%双氧水（安洁高科）中，室温黑暗中孵育25 min。加入3%牛血清白蛋白（ServiceBio）均匀覆盖组织，室温封存30 min。组织与一抗在4 ℃下孵育过夜，二抗在室温下孵育50 min。新配制的DAB显色液（G1211）在切片略干燥后加入平板。显色时间在显微镜下控制。棕黄色核反染色显示阳性细胞。将切片脱水，并用Swey Super Clean Biomount介质安装。使用显微镜（E100，尼康）观察染色组织并获取和分析图像。

1.9. 蛋白质印迹法

冰冻条件下，下丘脑组织样品在含有1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF） （Beyotime Biotechnology）和1×蛋白水解酶和磷酸酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（Beyotime Biotechnology）中裂解。使用比辛酸bicinchoninic acid （BCA）蛋白质分析试剂盒（上海贝约泰姆生物科技公司）对从大鼠下丘脑组织中提取的蛋白质进行定量。在SDS PAGE凝胶上（Beyotime Biotechnology），使用电泳仪（BIO-RAD）对等量的蛋白质（20 μg/lane）进行电泳。使用Trans-Blot Turbo转移系统（BIO- RAD，Hercules）将选择的目标凝胶带转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Merck KGaA，Darmstadt）。将膜在5%脱脂乳（Fdbio Science）中封闭1 h，然后在4 ℃下与下列初级抗体一起孵育过夜：兔抗谷氨酰胺合成酶单克隆抗体（1∶500，Servicebio）；兔抗GAD65单克隆抗体（1∶500，Service bio）；兔抗GAD67单克隆抗体（1∶500， service bio）和兔抗GAPDH单克隆抗体（1∶500， Abbkine）。接下来，用TRIS缓冲盐水（Tris）和含Tween的TBS（TBST）洗涤膜，然后用山羊抗兔IgG （H+L）二抗 （1∶10 000， Abbkine）孵育膜2 h。最后，使用电化学发光（ECL）系统（Bio-Rad Laboratories Inc.）分析蛋白质条带。共重复3次，使用ImageJ （NIH）进行定量分析。

1.10. 统计学分析

使用IBM SPSS Statistics 25.0软件进行统计分析。 计量资料以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析，方差齐性时采用最小显著差异法（LSD），方差不齐时采用Tamhane's T₂检验。P<0.05 被认为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 子午流注针法对失眠大鼠的体质量及睡眠实验的影响

实验期间无大鼠死亡。对照组大鼠昼夜节律正常，白天嗜睡且活动少，夜晚兴奋且活动频繁，反应灵敏，毛发光滑润泽。模型组大鼠昼夜节律紊乱，白天及夜间活动频繁，对外界光照、声音刺激敏感，兴奋性增强，易激惹，毛发干枯灰黄无光泽，食量减少，体质量增长缓慢。纳甲组、纳子组在治疗的第4天开始恢复昼夜节律，食量有所增加，毛发较前光滑润泽，末次治疗后整体状态明显优于模型组。

造模后，模型组大鼠睡眠潜伏期较对照组明显增加（P<0.01，图2A），睡眠持续时间较对照组明显减少（P< 0.01，图2B），表明失眠模型建立成功。与模型组相比，纳子组（P<0.01）和纳甲组（P<0.01）大鼠睡眠潜伏期明显减少（图2A）。纳子组的睡眠持续时间较模型组增加（P<0.05，图2B），但纳甲组的睡眠持续时间差异没有统计学意义（P>0.05，图2B）。纳甲组和纳子组之间的睡眠持续时间差异没有统计学意义（P>0.05，图2B）。

图2.

造模后大鼠戊巴比妥钠睡眠协同实验比较

Fig.2 Results of pentobarbital sodium-induced sleep test (sleep latency and sleep duration) in the 4 groups (Mean±SD, n=10). A: Sleep latency. B: Sleep duration. ****P<0.0001, ***P<0.001 vs the control group; ^※ P<0.05, ^※※ P<0.01, ^※※※※ P<0.0001 vs model group; ^€ P<0.05 vs Najia group.

2.2. 子午流注针法对失眠大鼠下丘脑的病理形态的影响

对照组（图3A）下丘脑神经元排列有序，胞浆均匀，核仁清晰，结构完整。而模型组（图3B）的下丘脑神经元排列松散和紊乱，形状不规则，层次模糊，胞体增大，核固缩，突起减少；下丘脑也表现出神经元损失。与模型组相比，纳甲组（图3C）和纳子组（图3D）神经元排列规则，层次清晰，核固缩减少，神经元的数量增加，子午流注针法对失眠大鼠下丘脑神经元的功能改善有一定调节作用。

图3.

各组大鼠下丘脑HE染色

Fig. 3 Pathological examination of rat hypothalamus in each group (HE staining, scale bar=50 μm). A: Control group. B: Model group. C: Najia group. D: Nazi group.

2.3. 子午流注针法对失眠大鼠下丘脑组织中谷氨酸和γ-氨基丁酸浓度的影响

谷氨酸（Glu）和γ-氨基丁酸（GABA）的浓度及比值（图4）。模型组大鼠下丘脑中的GABA水平低于对照组（P<0.01）。与模型组相比，纳子组和纳甲组GABA水平升高（P<0.05）。纳甲组和纳子组之间的GABA水平差异没有统计学意义（P>0.05，图4B）。模型组大鼠下丘脑Glu浓度高于对照组（P<0.01）。与模型组相比，纳甲组（P<0.01）和纳子组（P<0.01）的谷氨酸浓度降低。纳甲组和纳子组的谷氨酸浓度差异没有统计学意义（P>0.05，图4A）。与对照组相比，模型组大鼠脑内Glu/GABA比值增加，Glu表达增加而GABA表达减少。与模型组相比，纳甲组和纳子组的Glu/GABA比值较低。子午流注针刺能上调失眠大鼠GABA神经递质的表达，下调Glu神经递质的表达（图4）。

图4.

各组大鼠下丘脑Glu(A)、GABA(B)表达量

Fig.4 Effect of Ziwuliuzhu acupuncture on the expression of GABA and Glu in the hypothalamus. The expression levels of Glu (A) and GABA (B) in the hypothalamus were assessed via HPLC-MS/MS. The values are the Means±SD (n=6). Post hoc LSD test: ***P<0.001 vs the control group; ^※※※※ P<0.0001, ^※※※ P<0.001, ^※ P<0.05 vs the model group.

2.4. 子午流注针法对失眠大鼠下丘脑GABAAR表达的影响

免疫组织化学（IHC）染色后，GABAAR阳性细胞呈黄色或棕黄色（图5A），主要分布于细胞核、细胞质和细胞间基质中。光镜下可见各组大鼠下丘脑均有GABAAR表达，模型组中GABAAR表达更广泛、强度更强（图5A）。与对照组相比，模型组显示GABAARs的阳性表达增加（P<0.01），平均光密度（OD）值增加（P<0.01，图5B）。与模型组相比，纳甲组和纳子组大鼠下丘脑中GABAAR的表达水平较低，平均OD值降低。纳甲组与对照组间的GABAAR表达差异没有统计学意义（P>0.05）；然而，与模型组相比，纳子组的GABAAR表达降低（P<0.01，图5B）。子午流注针刺能下调失眠大鼠下丘脑GABAAR的表达。

图5.

四组大鼠下丘脑内GABAA受体阳性表达

Fig.5 Expressions of GABAARs in the hypo-thalamus of the rats in the 4 groups. A: Immunohistochemistry for GABAAR in the hypothalamus in each group (Original magnification: ×100 or ×400). B: Comparison of mean OD values among the groups (Mean±SD, n=6). Post hoc LSD test: **P<0.01 vs control group; ^※※ P<0.01 vs model group.

2.5. 子午流注针法对失眠大鼠下丘脑GAD65、GAD67和GS蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组大鼠下丘脑中GAD65和GAD67水平降低（P<0.01），而GS水平升高（P<0.01）。与模型组相比，纳甲组和纳子组的GAD65 （P<0.01）和GAD67（P<0.05）水平增加。纳甲组下丘脑中GS水平明显低于模型组和纳子组（P<0.01）。纳子组GS水平和GAD67水平高于纳甲组（P<0.01），但GAD65纳子组和纳甲组差异没有统计学意义（P>0.05，图6）。

图6.

各组大鼠下丘脑GAD65、GAD67和GS蛋白表达结果 (A) 及相对表达量(B)

Fig.6 Effect of Ziwuliuzhu acupuncture on expressions of protein expressions in the hypothalamus of the rats. A: Western blotting for GAD65, GAD67, and GS in the hypothalamic tissues. B: Quantitative analysis of the protein expression levels (Mean±SD). Post hoc LSD test: ****P<0.0001, ***P<0.001 vs the control group; ^※※※※ P<0.0001, ^※※※ P<0.001, ^※※ P<0.01, ^※ P<0.05 vs model group; ^€€ P<0.01 vs Najia group.

2.6. 子午流注针法调节Glu/GABA-Gln代谢环路的失衡

子午流注针刺可提高失眠大鼠下丘脑中GABA的水平，降低GABAAR的表达，降低Glu水平和Glu/GABA比值。在相关蛋白的表达方面，子午流注针刺治疗后，失眠大鼠下丘脑GS减少，GAD65、GAD67蛋白表达增加。子午流注针刺通过调节Glu/GABA-Gln代谢环中GAD65、GAD67和GS的蛋白表达，影响Glu和GABA的表达以及Glu/GABA的比值（图7）。

图7.

子午流注针刺调节Glu/GABA-Gln代谢环路的失衡

Fig.7 Ziwuliuzhu acupuncture corrects imbalance in the Glu/GABA-Gln metabolic loop.

3. 讨论

本研究揭示了睡眠剥夺大鼠下丘脑中Glu与GABA代谢失衡的关键特征及其对失眠症的潜在影响。研究发现，睡眠剥夺导致下丘脑GABA水平显著下降，伴随GABAA受体（GABAAR）表达上调，Glu水平及Glu/GABA比值升高；谷氨酸脱羧酶（GAD65和GAD67）蛋白表达减少，阻碍Glu向GABA转化，导致GABA合成受限；星形胶质细胞中谷氨酰胺合成酶（GS）表达增加，促进Glu向谷氨酰胺（Gln）转化，维持Glu水平相对稳定；粉防己碱通过阻断GABAAR介导的Cl-通道开放，减少抑制性神经传递，加剧Glu/GABA失衡。这些发现首次系统性阐明了失眠症中下丘脑Glu/GABA-Gln代谢环路的动态变化及其与神经兴奋毒性的关联。

Glu和GABA分别作为中枢神经系统的主要兴奋性和抑制性神经递质，通过Glu/GABA-Gln代谢环路维持动态平衡^{［22， 23］}。本研究发现，睡眠剥夺显著干扰该环路，导致GABA合成减少和Glu积累。GAD65和GAD67是Glu转化为GABA的关键酶，其表达下调直接限制了GABA生成，打破了抑制性神经传递的平衡。GABAAR表达上调可能作为代偿机制，增强残余GABA的抑制作用，但同时加剧了Cl^-通道的敏感性，导致神经元过度抑制，间接抑制生物钟基因表达，扰乱睡眠-觉醒周期。星形胶质细胞在Glu清除和代谢中发挥核心作用。GS表达增加促进Glu向Gln转化，减少突触外Glu积累，从而缓解兴奋毒性。然而，这种代偿机制未能完全抵消GAD表达下降导致的GABA缺乏，Glu/GABA比值升高进一步加剧神经元兴奋性。粉防己碱通过阻断GABAAR的Cl^-通道，降低抑制性输入，放大Glu主导的兴奋性信号，可能诱发记忆力下降和神经功能障碍^［24-27］。Glu/GABA代谢与三羧酸（TCA）循环密切相关。Glu由TCA循环中间代谢物α-酮戊二酸生成，而GABA通过GAD催化Glu脱羧形成。睡眠剥夺可能通过影响TCA循环代谢流，优先支持Glu生成，限制GABA合成。此外，星形胶质细胞中的GABA转氨酶（GABA-T）和琥珀酸半醛脱氢酶（SSADH）将GABA降解为琥珀酸，重返TCA循环，进一步减少GABA可用性^［28-30］。这种代谢偏向可能是失眠症中Glu/GABA失衡的深层机制。

GABA能神经元主要分布在下丘脑，睡眠时突触放电增强。已有研究表明，非快速眼动（NREM）睡眠期间GABA浓度增加，快速眼动（REM）睡眠期间减少。发作性失眠患者GABA水平显著升高，而原发性失眠患者GABA水平低于健康人^{［31， 32］}。GABA通过与GABAARs结合发挥抑制作用，增强神经抑制^［33］。谷氨酸（Glu）是主要兴奋性神经递质，通过刺激食欲素和胆碱能神经元促进觉醒^［34］。Glu由葡萄糖和谷氨酰胺通过“Glu-Gln”循环合成，突触释放后需及时清除以避免兴奋毒性。GABA由Glu脱羧生成，二者代谢平衡维持睡眠-觉醒周期稳定^{［35， 36］}。本研究结果显示，睡眠不足后下丘脑Glu和GABA水平先升后降，或GABA下降、Glu及Glu/GABA比值升高，表明失眠与二者浓度及比值相关。Glu和GABA代谢与三羧酸（TCA）循环紧密相连^［37-39］。Glu由α-酮戊二酸生成，GAD催化Glu生成GABA。星形胶质细胞摄取GABA，经GABA转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶降解为琥珀酸^［40-42］，进入TCA循环生成Glu（图8）。星形胶质细胞通过GS将Glu转为Gln，再返回神经末梢生成Glu和GABA^［43］。GAD和GS是维持Glu/GABA-Gln代谢环路的关键酶，确保神经元突触传递功能^［44］。

图8.

三羧酸(TCA)循环示意图

Fig.8 Schematic diagram of the tricarboxylic acid (TCA) cycle.

与TCA循环类似，子午流注针法以其独特的节律性理论调节神经元。子午流注指出，时间规律支配着十二经脉的昼夜节律和基因表达。子午流注针法是中国时间医学的组成部分，是中医的一个分支，已被证明可以有效治疗中国患者的失眠症^［45］。十二经脉调节着人体节律性潮起潮落，经络中的血液在一天中的特定时间表现出最旺盛的流动^［46］。在纳甲法中，选择血液最旺盛的穴位进行治疗，而在纳子法中，治疗失眠所选择的穴位是心经（在中医中，失眠症患者患有精神疾病，此类疾病植根于心脏）。本研究结论表明，两种子午流注针法都能缩短失眠大鼠的睡眠潜伏期，延长睡眠时间，减轻对下丘脑神经元的损害^［47］。

但本研究也存在一定的局限性。没有进一步分析纳甲法和纳子法在失眠治疗机制上是否有差异。本研究的目的是探讨子午流注针刺调节失眠的机制，子午流注针法作为一种具有特殊节律的时间医学治疗方式，其特殊节律作用应该继续探讨。本研究未设常规针刺组进行比较，此外，其他神经递质及其各自的受体或转运体也可能导致大鼠失眠，未来的研究应该利用更大的样本量，设立接受常规针灸治疗的对照组，并比较纳子法和纳甲法的治疗效果。为了考察和比较其他神经信号通路对相应指标的影响，应使用损毁或抑制剂来阻断视交叉上核（SCN）调节的通路对下游神经递质的影响，并将由此产生的变化应与健康大鼠进行比较，以进一步探讨子午流注针法的机制。

综上所述，本研究探讨了子午流注针刺对失眠模型大鼠谷氨酸/氨基丁酸-谷氨酰胺代谢环路的影响及其机制。子午流注可提高下丘脑GABA含量和GAD65、GAD67蛋白表达，降低Glu浓度、GS蛋白表达和GABAAR表达，从而缓解Glu/GABA-Gln代谢环的失衡。本研究结果为失眠症的治疗提供了一定依据，有利于子午流注针法在临床上的推广和应用。

基金资助

国家自然科学基金（81973942）；深圳市医疗卫生三名工程（SZSM202211044）

Supported by National Natural Science Foundation of China (81973942).

利益冲突声明

The authors declare no competinginterests.。