Abstract
目的
探讨不同浓度的钙磷纳米花（以下简称“纳米花”）在体外抗氧化及成骨诱导能力。
方法
采用明胶、三磷酸盐和氯化钙制备纳米花，以扫描电镜、透射电镜、傅里叶变换红外光谱仪及能量色散光谱仪对其形貌、微观结构、元素组成和分布、直径及分子构成进行材料表征。取12只4周龄SD大鼠股骨及胫骨骨髓，采用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs并传代，取第3代细胞经流式细胞仪鉴定为干细胞后，与0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6 mg/mL纳米花共培养，行细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）检测，筛选细胞活性最佳浓度进行后续实验。将BMSCs与筛选的3种浓度纳米花共培养后，通过活/死细胞染色、划痕实验、骨架染色验证纳米花细胞相容性，活性氧（reactive oxygen species，ROS）荧光染色评估其抗氧化能力，ALP、茜素红染色、骨钙素（osteocalcin，OCN）及Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）免疫荧光染色评估其体外骨诱导能力；上述指标均以未添加纳米花的正常培养BMSCs作为对照组。
结果
扫描电镜示制备的纳米花呈花状结构；透射电镜扫描示纳米花具有多层结构，高倍图像示原子排列连续，纳米花直径为（2.00±0.25）μm；能量色散光谱仪显示纳米花含有C、N、O、P、Ca等元素且各元素均匀分布于花区；傅里叶变换红外光谱仪分析各组分吸收峰，表明纳米花制备成功。经CCK-8检测筛选0.8、1.2、1.6 mg/mL纳米花进行后续细胞实验。活/死细胞染色示，不同浓度纳米花均表现出良好细胞相容性，其中1.2 mg/mL组最佳（P<0.05）；划痕实验结果示，1.2 mg/mL组细胞迁移能力优于其他组（P<0.05）；细胞骨架染色示各浓度组细胞形态伸展良好，与对照组细胞无明显差异；ROS荧光染色示脂多糖诱导后各浓度组ROS荧光与对照组相比均下降（P<0.05），其中1.2 mg/mL组荧光最弱；ALP染色示各组细胞周围均出现蓝紫色结节状沉积现象，其中1.2 mg/mL组较其他组显著；茜素红染色示各组细胞周围呈现橙红色矿化结节，其中1.2 mg/mL组结节更多且更致密；免疫荧光染色示，各浓度组RUNX2、OCN蛋白表达与对照组相比均有所上升，其中1.2 mg/mL组蛋白表达最强（P<0.05）。
结论
研究成功制备纳米花，其中浓度为1.2 mg/mL时表现出良好的细胞相容性、抗氧化性能和成骨诱导能力，是一种具有潜力的人工骨替代材料。
Keywords: 骨组织工程, 钙磷纳米花, 活性氧, 成骨诱导, 细胞相容性
Abstract
Objective
To investigate the antioxidant and osteogenic induction capabilities of calcium phosphate nanoflowers (hereinafter referred to as nanoflowers) in vitro at different concentrations.
Methods
Nanoflowers were prepared using gelatin, tripolyphosphate, and calcium chloride. Their morphology, microstructure, elemental composition and distribution, diameter, and molecular constitution were characterized using scanning electron microscopy, transmission electron microscopy, Fourier transform infrared spectroscopy, and energy-dispersive spectroscopy. Femurs and tibias were harvested from twelve 4-week-old Sprague Dawley rats, and bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) were isolated and cultured using the whole bone marrow adherent method, followed by passaging. The third passage cells were identified as stem cells by flow cytometry and then co-cultured with nanoflowers at concentrations of 0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0, 2.4, 2.8, 3.2, and 3.6 mg/mL. Cell counting kit 8 (CCK-8) assay was performed to screen for the optimal concentration that demonstrated the best cell viability, which was subsequently used as the experimental concentration for further studies. After co-culturing BMSCs with the screened concentration of nanoflowers, the biocompatibility of the nanoflowers was verified through live/dead cell staining, scratch assay, and cytoskeleton staining. The antioxidant capacity was assessed by using reactive oxygen species (ROS) fluorescence staining. The in vitro osteoinductive ability was evaluated via alkaline phosphatase (ALP) staining, alizarin red staining, and immunofluorescence staining of osteocalcin (OCN) and Runt-related transcription factor 2 (RUNX2). All the above indicators were compared with the control group of normally cultured BMSCs without the addition of nanoflowers.
Results
Scanning electron microscopy revealed that the prepared nanoflowers exhibited a flower-like structure; transmission electron microscopy scans discovered that the nanoflowers possessed a multi-layered structure, and high-magnification images displayed continuous atomic arrangements, with the nanoflower diameter measuring (2.00±0.25) μm; energy-dispersive spectroscopy indicated that the nanoflowers contained elements such as C, N, O, P, and Ca, which were uniformly distributed across the flower region; Fourier transform infrared spectroscopy analyzed the absorption peaks of each component, demonstrating the successful preparation of the nanoflowers. Through CCK-8 screening, the concentrations of 0.8, 1.2, and 1.6 mg/mL were selected for subsequent experiments. The live/dead cell staining showed that nanoflowers at different concentrations exhibited good cell compatibility, with the 1.2 mg/mL concentration being the best (P<0.05). The scratch assay results indicated that the cell migration ability in the 1.2 mg/mL group was superior to the other groups (P<0.05). The cytoskeleton staining revealed that the cell morphology was well-extended in all concentration groups, with no significant difference compared to the control group. The ROS fluorescence staining demonstrated that the ROS fluorescence in all concentration groups decreased compared to the control group after lipopolysaccharide induction (P<0.05), with the 1.2 mg/mL group showing the weakest fluorescence. The ALP staining showed blue-purple nodular deposits around the cells in all groups, with the 1.2 mg/mL group being significantly more prominent. The alizarin red staining displayed orange-red mineralized nodules around the cells in all groups, with the 1.2 mg/mL group having more and denser nodules. The immunofluorescence staining revealed that the expressions of RUNX2 and OCN proteins in all concentration groups increased compared to the control group, with the 1.2 mg/mL group showing the strongest protein expression (P<0.05).
Conclusion
The study successfully prepares nanoflowers, among which the 1.2 mg/mL nanoflowers exhibits excellent cell compatibility, antioxidant properties, and osteogenic induction capability, demonstrating their potential as an artificial bone substitute material.
Keywords: Bone tissue engineering, calcium phosphate nanoflowers, reactive oxygen species, osteogenic induction, cell compatibility
骨骼是高度矿化的结缔组织，是能够动态代谢的活性结构[1]。先天性骨病、严重肢体创伤、骨肿瘤、感染性疾病等因素导致的骨缺损临床常见[2]，目前主要采用自体骨移植[3]、同种异体骨移植、人工骨替代材料移植等[4]修复。自体骨移植因供区骨量有限、存在供区感染风险等而应用受限，同种异体骨移植也存在免疫排斥反应、骨量不足、传播疾病等问题[5]。近年来，多种生物材料用于骨组织工程研究取得显著进展，其中羟基磷灰石、β-磷酸三钙及其复合材料的成分与天然骨骼相似，具有广泛临床应用潜力[6]。 Elrayah等[7]通过铜离子辅助水热法构建了花状微纳结构羟基磷灰石支架，结果显示花状结构通过物理拓扑增大了内皮细胞接触面积，显著促进内皮细胞增殖和铺展。纳米花的花状结构为分层形态，比表面积大且具有多孔结构和吸附能力，已在化学和催化领域得到广泛研究[8-10]，而在生物医学应用方面报道较少[11]。
松质骨主要由骨小梁和骨髓组成，骨小梁主要由胶原蛋白和羟基磷灰石构成[12-13]，胶原蛋白赋予骨质一定韧性，羟基磷灰石则赋予骨质硬度和强度[14]。钙磷材料是骨骼无机成分，直接参与矿化，具有天然优势。基于这种组分，我们前期研究制备了一种钙磷纳米花（以下简称“纳米花”），其成分包括钙、三磷酸盐和明胶，类似于骨小梁主要组分[15]。研究表明这种花状结构可以释放生物活性离子，包括Ca2+ 和PO43−，用于骨重塑过程[16-17]。释放的Ca2+ 也可形成原位生物矿化层，从而为BMSCs的成骨诱导提供“成骨微环境”。本次研究旨在评估该纳米花的生物相容性，并探讨不同浓度纳米花体外抗氧化和成骨诱导能力，为其作为人工骨替代材料修复骨缺损提供实验依据。报告如下。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物及主要试剂、仪器
4周龄SD雄性大鼠12只，体质量70～100 g，购自江苏青龙山生物科技有限公司。
明胶、L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠（Sigma公司，美国）；三磷酸盐、氯化钙溶液（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；DMEM/F-12培养基、FBS（GIBCO公司，美国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、青-链霉素溶液、4%多聚甲醛（合肥白鲨生物科技有限公司）；Runt 相关转录因子（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨钙素（osteocalcin，OCN）（Affinity Bioscience公司，美国）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒、ALP染色试剂盒、钙黄绿素-乙酰氧基甲酯（Calcein-acetoxymethyl ester，Calcein-AM）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）双荧光染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；DAPI（武汉赛维尔生物科技有限公司）；茜素红染色液（北京索莱宝科技有限公司）。
扫描电镜、倒置荧光显微镜、能量色散光谱仪（Zeiss公司，德国）；透射电镜（JEOL公司，日本）；傅里叶变换红外光谱仪（Thermo Fisher公司，美国）。
1.2. 纳米花制备及表征
1.2.1. 材料制备
① 于圆底玻璃瓶中配置2%明胶，置入磁子，于30℃水浴中溶解搅拌20 min。② 于50 mL离心管中配置10%磷酸钠溶液20 mL，超声混匀溶解；取出10 mL磷酸钠溶液加入步骤 ① 圆底玻璃瓶中，继续搅拌15 min。③ 配置1 mol/L氯化钙溶液，加入步骤 ① 圆底玻璃瓶中，继续搅拌15 min。搅拌结束后转移至15 mL离心管中，以离心半径10.7 cm、1 200 r/min离心15 min后，弃上清，底部沉淀置于冷冻干燥机内干燥12 h，即获得纳米花。
1.2.2. 材料表征
通过扫描电镜观察纳米花形貌；透射电镜及其高角环形暗场像（high-angle annular dark-field scanning transmission electron microscope，HAADF-STEM）模式观察纳米花直径、晶体结构和微观结构；利用能量色散光谱仪分析元素分布；利用傅里叶变换红外光谱仪分析明胶、三磷酸盐、纳米花的分子结构，在400～4000 cm−1波数范围内记录吸收峰。
1.3. 体外细胞实验
1.3.1. BMSCs分离培养及鉴定
用颈椎脱臼法处死12只大鼠，分离股骨和胫骨，以含1%青-链霉素的DMEM/F-12培养基冲洗骨髓腔；冲洗液以70 μm白色细胞过滤网过滤后，以离心半径10.7 cm、1 000 r/min离心5 min后弃上清，取细胞沉淀；加入3 mL完全培养基（含10%FBS、1%青-链霉素的DMEM/F-12培养基）重悬细胞，移入培养瓶中，每瓶加入5 mL完全培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后半定量换液，48 h后进行全换液。此后每隔1 d更换1次培养基，待细胞融合生长至80%以上后传代。取第3代细胞行流式细胞仪鉴定，结果示表面抗原CD29、CD90呈阳性（阳性表达率98.9%、96.0%），CD34、CD45呈阴性（阳性表达率0.22%、0.86%），提示其为干细胞并用于后续实验。
1.3.2. 纳米花最佳浓度筛选
称取不同质量纳米花，经灭菌处理后加入完全培养基，制备含不同浓度（0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6 mg/mL）纳米花培养基。将BMSCs以5×103个/孔接种于96孔板，每孔加入100 μL完全培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。然后更换为含不同浓度纳米花培养基继续培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37℃避光孵育3 h，酶标仪测量450 nm处吸光度（A）值。取A值相对较高的3种浓度纳米花培养基进行后续实验。
1.3.3. 细胞活性检测
将BMSCs以1×105个/孔接种于6孔板，分别加入筛选浓度纳米花培养基培养，每隔1 d更换1次培养基。分别于1、3、5 d取出孔板，PBS清洗3遍，使用Calcein-AM/PI双荧光染色试剂盒染色后倒置荧光显微镜下观察，绿色荧光染色为活细胞，红色荧光染色为死细胞，计数活、死细胞，按照以下公式计算细胞存活率：细胞存活率=活细胞数/细胞总数。以正常培养BMSCs作为对照组。以各组各时间点细胞存活率与对照组1 d的比值作为细胞活力并进行组间比较。
1.3.4. 细胞迁移能力观测
将BMSCs以8×104个/孔接种于12孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养至细胞铺满孔底。使用200 μL无菌枪头沿直尺匀速划一条直线（重复3次）。使用Calcein-AM进行染色，倒置荧光显微镜下摄划痕区域（记作0 h）。然后，将筛选浓度纳米花培养基与细胞共培养，各孔分别加入等体积无血清培养基培养24 h后使用Calcein-AM进行染色，拍摄划痕区域。以0 h作为对照，使用Image J软件测量划痕区域面积，按照以下公式计算细胞迁移率：迁移率（%）=（1− 24 h划痕面积/ 0 h划痕面积）×100%。以正常培养BMSCs作为对照组。
1.3.5. 细胞骨架染色
将BMSCs以1×105个/孔接种于6孔板，分别与筛选浓度纳米花培养基共培养7 d。取出孔板，使用PBS清洗3遍，各孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定15 min，用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽孵育30 min，DAPI避光孵育5 min，对细胞骨架（F-肌动蛋白）进行染色后，倒置荧光显微镜下观察。以正常培养BMSCs作为对照组。
1.3.6. ROS荧光染色
将BMSCs以1×105个/孔接种于6孔板，使用5 μg/mL 脂多糖处理6 h，建立氧化应激环境。随后将筛选浓度纳米花培养基与细胞共培养1 d后，加入1 mL 经PBS稀释至浓度为10 μmol/L的2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯，置于37℃培养箱内孵育20 min；PBS洗涤细胞3遍后，倒置荧光显微镜下观察荧光强度。以正常培养BMSCs作为对照组。
1.3.7. ALP及茜素红染色
将BMSCs以1×105个/孔接种于6孔板，待细胞融合达70%后更换为成骨诱导培养基（含10%FBS、1%青-链霉素、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μg/mL L-抗坏血酸，10 nmol/L地塞米松的DMEM/F-12培养基），并与筛选浓度纳米花培养基共培养。7 d时行ALP染色，镜下观察有无蓝紫色结节沉积；21 d 时行茜素红染色，镜下观察有无橙红色矿化结节形成。以正常培养的BMSCs作为对照组。
1.3.8. 免疫荧光染色
将BMSCs以4×104个/孔接种于24孔板，待细胞融合达70%以上后更换为成骨诱导培养基，并与筛选浓度纳米花培养基共培养。分别于7、21 d行RUNX-2、OCN荧光染色。取出孔板，PBS清洗3遍，4% 多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3遍，用0.2%Triton X-100渗透15 min，清洗3遍，并用10%山羊血清封闭2 h。随后，加入RUNX-2（1∶100）、OCN（1∶100）一抗4℃孵育过夜，清洗3遍后加入荧光标记二抗并避光室温孵育2 h，DAPI孵育10 min，倒置荧光显微镜观察细胞核（蓝色）及蛋白（红色）表达，RUNX2为核表达蛋白，与细胞核重叠即为阳性表达；OCN为分泌型蛋白，蛋白表达围绕于核周围。使用Image J软件进行相对荧光强度的半定量分析。以正常培养BMSCs作为对照组。
1.4. 统计学方法
采用GraphPad Prism 9.5.1统计软件进行分析并绘图，所有观测指标均重复3次并收集所有实验数据。计量资料经Shapiro-Wilk正态性检验均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。检验水准取双侧α=0.05。
2. 结果
2.1. 材料表征
扫描电镜示制备的纳米花具备花状结构。透射电镜示纳米花呈团聚状，内部具有多层结构；HAADF-STEM低倍图像示纳米花呈花状，高倍图像可见原子排列连续，元素排列均匀。纳米花直径为（2.00±0.25）μm。能量色散光谱仪分析示纳米花含有C、N、O、P、Ca元素，占比分别为23.98%、0.14%、36.19%、20.89%、18.80%，各元素均匀分布于花区。红外光谱分析，明胶1 636 cm−1处吸收峰为（酰胺Ⅰ带）C=O的伸缩振动；三磷酸盐1 093、894 cm−1处分别为P-O-P不对称和对称伸缩振动吸收峰；纳米花1 637 cm−1处吸收峰为明胶（酰胺Ⅰ带）C=O的伸缩振动，1 178 cm−1处吸收峰为P=O的伸缩振动，1 105 cm−1处吸收峰为P-O-P不对称伸缩振动，表明纳米花制备成功。见图1。
图 1.
Characterization of the nanoflowers
纳米花材料表征
a. 扫描电镜观察 方框部位依次为逐级放大图，从左至右放大倍数分别为4 000、8 000、20 k； b. 透射电镜观察 左、右放大倍数分别为20 k、80 k；c. HAADF-STEM 左、右放大倍数分别为20 k、80 k；d. 能量色散光谱分析元素分布图 从左至右分别为C、N、O、P、Ca； e. 元素占比图；f. 纳米花直径统计图；g. 傅里叶变换红外光谱图
a. Scanning electron microscopy observation The boxed areas showed progressively magnified views from left to right, with magnification of 4 000, 8 000, and 20 k, respectively; b. Transmission electron microscopy observation The left and right images for the magnifications of 20 k and 80 k, respectively; c. HAADF-STEM observation The left and right images for magnifications of 20 k and 80 k, respectively; d. Elemental distribution maps by using energy-dispersive spectroscopy From left to right for the C, N, O, P, and Ca, respectively; e. Elemental composition chart; f. Statistical chart of nanoflower diameters; g. Fourier transform infrared spectroscopy
2.2. 体外细胞实验观察
2.2.1. 纳米花最佳浓度筛选
CCK-8检测示随着纳米花浓度升高，细胞活性增强，1.2 mg/mL浓度培养达最高；之后随浓度增加细胞活性呈下降趋势，3.6 mg/mL浓度培养时下降显著。其中，0.8、1.2、1.6 mg/mL组A值与0 mg/mL组间差异均有统计学意义（P<0.05）。见图2。故本研究选择0.8、1.2、1.6 mg/mL浓度纳米花培养基进行后续实验。
图 2.
CCK-8 assay for optimal concentration of nanoflowers
CCK-8检测纳米花最佳浓度
*P<0.05
*P<0.05
2.2.2. 细胞活性检测
镜下观察示，1 d时各浓度组细胞均存活，仅少数细胞死亡；各组间细胞活力差异无统计学意义（P>0.05）。3 d时，细胞形态有所伸展，其中1.2 mg/mL组细胞伸展状态最佳，其细胞活力与对照组差异有统计学意义（P<0.05），其余组间差异无统计学意义（P>0.05）。5 d 时，各浓度组纳米花中活细胞比例均超过90%，未见大量死细胞。其中1.2 mg/mL组细胞活力最高，与其他组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图3、4。
图 3.
Observation of live/dead cell staining (Inverted fluorescence microscope×100)
活/死细胞染色观察（倒置荧光显微镜×100）
从上至下分别为共培养1、3、5 d 从左至右分别为对照组及0.8、1.2、1.6 mg/mL组
From top to bottom showed the co-culture for 1, 3, and 5 days, respectively From left to right showed control group and 0.8, 1.2, 1.6 mg/mL groups, respectively
图 4.
Comparison of cell viability
细胞活力比较
2.2.3. 细胞迁移能力
划痕后24 h 1.2 mg/mL组细胞黏附和迁移能力优于其他组（图5）。对照组及0.8、1.2、1.6 mg/mL组细胞迁移率分别为23.27%±2.74%、45.52%±3.05%、60.05%±2.00%、37.51%±4.38%，其中1.2 mg/mL组与其他组比较、0.8 mg/mL组与对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间差异均无统计学意义（P>0.05）。
图 5.
Observation of the cell scratch assay (Inverted fluorescence microscope×100)
细胞划痕实验观察（倒置荧光显微镜×100）
从上至下分别为0、24 h 从左至右分别为对照组及0.8、1.2、1.6 mg/mL组
From top to bottom showed the 0 and 24 hours, respectively From left to right showed the control group and 0.8, 1.2, 1.6 mg/mL groups, respectively
2.2.4. 细胞骨架染色
共培养7 d，各浓度组细胞形态伸展良好，与对照组细胞无明显差异。见图6。
图 6.
Observation of cytoskeleton staining (Inverted fluorescence microscope×200)
细胞骨架染色观察（倒置荧光显微镜×200）
从上至下分别为F-肌动蛋白、DAPI及重叠图 从左至右分别为对照组及0.8、1.2、1.6 mg/mL组
From top to bottom showed F-actin, DAPI, and overlay images, respectively From left to right showed control group and 0.8, 1.2, 1.6 mg/mL groups, respectively
2.2.5. ROS荧光染色
对照组及0.8、1.2、1.6 mg/mL组ROS荧光强度分别为5.11±0.32、2.56±0.08、1.17±0.23、2.25±0.55。各浓度组ROS荧光与对照组相比均有所下降，其中1.2 mg/mL组荧光最弱，组间差异有统计学意义（P<0.05）。见图7。
图 7.
Observation of ROS fluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×200)
ROS荧光染色观察（倒置荧光显微镜×200）
从左至右分别为对照组及0.8、1.2、1.6 mg/mL组
From left to right showed control group and 0.8, 1.2, 1.6 mg/mL groups, respectively
2.2.6. ALP及茜素红染色
共培养7 d，ALP染色可见各组细胞周围均出现蓝紫色结节状沉积现象，且1.2 mg/mL组最显著；21 d时，茜素红染色可见各组细胞周围出现橙红色矿化结节，1.2 mg/mL组矿化结节最多且最致密。见图8。
图 8.
Observation of ALP and alizarin red staining (×200)
ALP和茜素红染色观察（×200）
从左至右分别为对照组及0.8、1.2、1.6 mg/mL组 a. ALP染色；b. 茜素红染色
From left to right showed control group and 0.8, 1.2, 1.6 mg/mL groups, respectively a. ALP staining; b. Alizarin red staining
2.2.7. 免疫荧光染色
共培养后，各组均有不同程度RUNX2、OCN蛋白表达；与对照组相比，各浓度组蛋白表达均有所上升，其中1.2 mg/mL组表达最强。定量分析示，对照组及0.8、1.2、1.6 mg/mL组RUNX2相对荧光强度分别为2.02±0.27、4.06±0.35、9.10±0.34、3.48±0.06，OCN相对荧光强度分别为2.90±0.14、5.83±0.24、12.25±0.80、7.45±0.36；其中1.2 mg/mL组均高于其余3组，0.8、1.6 mg/mL组高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图9。
图 9.
Observation of immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×200)
免疫荧光染色观察（倒置荧光显微镜×200）
从左至右分别为对照组及0.8、1.2、1.6 mg/mL组 a. RUNX2；b. OCN
From left to right showed control group and 0.8, 1.2, 1.6 mg/mL groups, respectively a. RUNX2; b. OCN
3. 讨论
人工骨替代材料有良好的生物安全性以及骨诱导能力，成为骨缺损修复有效办法。我们制备了一种组分类似骨小梁的钙磷纳米花，该花状结构可释放Ca2+ 和PO43−，作为骨矿化的关键成分结合形成羟基磷灰石[18]，此为骨组织的主要无机部分。另外，生物矿化环境是影响骨再生进程的关键因素，Ca2+ 和PO43− 的释放构建起成骨微环境，Ca2+ 可依靠激活Wnt/β-catenin通路[19]，提高成骨基因表达，推动BMSCs向成骨细胞分化[20]。PO43− 参与胶原纤维的矿化，促使骨基质更快成熟[21]。
本次研究我们成功制备纳米花并进行表征，结果提示纳米花呈花状结构，其中包含C、N、O、P、Ca等元素，并且这些元素均匀分布于纳米花中。随后，应用全骨髓贴壁法提取了大鼠BMSCs，借助流式细胞仪对其表面标志物CD29、CD90、CD34、CD45进行鉴定，结果示所提取细胞为BMSCs。通过与第3代BMSCs共培养初步评估了纳米花的细胞相容性，首先采用CCK-8对纳米花浓度进行初步筛选，依据结果选取0.8、1.2、1.6 mg/mL作为后续实验浓度；然后，通过活/死细胞染色等实验验证制备的纳米花有良好细胞相容性。进一步以正常培养BMSCs作为对照，评估不同浓度纳米花体外抗氧化以及成骨诱导能力。将纳米花与细胞共培养后进行观测，ROS荧光染色结果显示1.2 mg/mL组ROS荧光最微弱，提示该浓度抗氧化能力最强大；而ALP、茜素红、RUNX2、OCN等早晚期成骨指标观测结果示，1.2 mg/mL组纳米花共培养后ALP、茜素红表达状况最佳，RUNX2、OCN等荧光蛋白表达明显上调，提示该浓度纳米花成骨诱导能力最优。
综上述，本研究成功制备了一种钙磷纳米花，其具有良好细胞相容性，浓度为1.2 mg/mL时不论是抗氧化还是体外成骨诱导能力均表现最佳，为其作为人工骨替代材料应用于生物医学领域提供了实验依据。后续将进行体内实验进一步验证其生物安全性和体内成骨能力，以及探讨利用其比表面积大的特点通过负载药物来实现更好协同作用。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突
伦理声明 研究方案经蚌埠医科大学伦理审查委员会批准（2020243）；实验动物使用许可证号：SYXK（皖）2023-009；实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2024-0001
作者贡献声明 贾明宇：资料收集、撰写文章；陈志宏：文章修改；周华健、张雨康：数据整理、统计学分析；吴敏：内容构思、观点形成、研究指导
References
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