单细胞RNA测序技术在乳腺发育及相关疾病中的应用进展

Abstract

The spatio-temporal heterogeneity of breast cell subsets forms the fundamental biological basis for physiological development and pathological progression, including tumorigenesis; however, its complex regulatory mechanisms are not yet fully elucidated. With its high-resolution capabilities, single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) technology offers a powerful tool for dissecting this cellular heterogeneity. This technology enables the construction of high-precision breast cell atlases, the accurate identification of distinct cell subsets, and the reconstruction of differentiation trajectories from stem/progenitor cells to functional epithelial cells. By resolving the transcriptional regulatory networks that govern cell fate determination, intercellular communication patterns, and dynamic microenvironmental interactions, scRNA-seq has unveiled the molecular foundations of breast development and provided new perspectives on the pathogenesis of related diseases such as breast cancer and macromastia. Furthermore, scRNA-seq demonstrates significant potential for discovering early molecular markers of disease, deciphering tumor heterogeneity, and elucidating mechanisms of therapeutic resistance. The continued application of scRNA-seq for dissecting breast cell heterogeneity, combined with its integration with multi-modal data such as spatial omics, promises to provide critical evidence and new insights for revealing the molecular mechanisms of breast development-related diseases and for formulating precision therapeutic strategies.

乳腺作为哺乳动物特有的外分泌器官，其独特的发育模式和泌乳功能构成了哺乳动物重要的生物学特征^[1]。该器官的发育过程具有显著的阶段性特征：胚胎期完成初步形态构建后，需在出生后经历终末发育阶段，最终形成结构和功能完备的腺体^[2-3]。这一时序性发育的特点使乳腺成为研究器官发育与细胞分化的理想模型。从组织结构而言，乳腺由实质和间质两部分组成，共同构成一个动态的功能单元^[4]。实质部主要包括腺泡和导管系统，负责乳汁的合成与分泌，间质部则包含脂肪垫、纤维结缔组织及脉管系统，共同构成支撑与代谢微环境，对腺体起到了重要的保护和支持作用^[5-6]。乳腺癌是目前乳房相关疾病中最受关注的一类疾病^[7-8]。乳腺发育异常引发的疾病同样具有重要研究价值。自胚胎阶段起，乳腺的发育便受到各种因素(如激素、药物、环境、疾病等)的影响，可能导致异常发育的疾病，如巨乳症、先天性乳房发育不良、男性乳腺发育等^[9-10]。此类疾病对患者心理健康的影响通常远大于对生理健康的损害。通过基因表达层面的深入研究，特别是对正常与异常发育通路的分子机制解析，有望为乳腺发育相关疾病的精准干预提供新的思路。

近年来，传统群体测序技术快速发展，包括蛋白质、转录组、基因组或表观基因组水平，乳腺发育研究积累了丰富的组学数据，有助于更好地了解细胞亚群和分化潜力^[11]。但其本质是将组织样本视为均质细胞群进行检测，无法解析乳腺上皮细胞、间质细胞及免疫细胞等异质性群体的独立分子特征。尤其在研究胚胎期乳腺多能祖细胞(embryonic multipotent progenitors，EMPs)分化、青春期导管分支形态发生等动态过程时，群体测序难以捕捉稀少的过渡态细胞亚群及其时序性调控网络^[12]。单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing，scRNA-seq)技术从根本上突破了这一技术瓶颈，为了解细胞的异质性以及细胞之间交互作用提供了新的切入点。ScRNA-seq技术通过独立分析从健康或疾病组织分离出来的单个细胞的全转录组，可精确描绘乳腺组织中基底细胞、管腔祖细胞、成熟腺泡细胞等15种以上功能亚群的分子特征，并重建其发育轨迹^[13-14]。该技术有助于深入理解乳腺的发育过程、疾病发病机制，并为相关诊断和治疗策略的制订提供依据。2017年Bach等^[4]首次绘制了小鼠乳腺发育全周期单细胞图谱，揭示了妊娠期特异性细胞亚群的存在及其分化规律，标志着乳腺发育研究进入单细胞分辨率时代。随后的研究^[15]进一步证实该技术不仅能解析乳腺干细胞多能性维持机制，还能动态追踪激素刺激下乳腺上皮细胞的谱系分化过程，为阐明发育异常疾病的分子机制提供了全新的研究范式。

本文从胚胎期乳腺发育、出生后乳腺生理变化及乳腺发育相关疾病3个维度，总结scRNA-seq技术在乳腺研究中的应用进展，重点探讨其在解析细胞异质性、揭示发育调控网络方面的技术优势，以期为乳腺发育异常疾病的机制研究提供潜在的思路。

1. 乳腺生理发育

1.1. 胚胎期乳腺生理发育

乳腺发育在胚胎期的第10~18天之间进行。在此期间，外胚层细胞从前向后扩展，在两侧形成乳腺线^[16]。外胚层的细胞按照乳腺线定向迁移和空间重排，逐步形成5对多层结构的基板。当基板与邻近组织建立接触后，其基底膜发生降解并脱离原位，继而嵌入下方的间充质层，形成具有分支潜能的乳腺上皮芽结构。该形态发生过程不仅促进了乳腺间充质的特异性分化，还为间充质小管的形成奠定了基础。至胚胎发育15.5 d时，上皮芽开始向脂肪垫前体区域延伸生长，启动导管分支的形态构建，最终形成由单一主导管和10~15个次级分支组成的初级导管树系统。这种基础结构在出生时已完全建立，并在青春期前维持相对静息的发育状态^[17]。

1.2. 出生后乳腺生理发育

出生后乳腺发育呈现显著的阶段性特征，其形态结构变化与内分泌调控网络密切关联^[18]。青春期阶段，在雌激素、生长激素和胰岛素样生长因子协同作用下，导管系统通过末端芽(terminal end buds，TEBs)的定向增殖完成空间拓张，形成具有分支结构的导管树^[19-20]。当导管延伸至脂肪垫边缘时，TEBs逐渐消失并分化为成熟的管腔上皮细胞，最终形成具有功能分区的乳管-肌层复合体^[21-22]。

在乳腺发育周期中，成熟的腺体组织通常处于静息状态，直至妊娠期在孕激素和催乳素的协同作用下重新激活^{[13, 23]}。这2种关键激素通过直接调控腺体生长和间接调节雌激素受体活性，驱动乳腺发生显著的形态学重构^[24-26]。在妊娠早期，孕激素主导的导管树分支化进程促使次级和三级导管大量增生；在妊娠中期，孕-催乳素复合调控使腺泡细胞逐渐转化为泌乳表型；在妊娠晚期，腺泡结构已占据乳腺脂肪垫的主要空间^[27]。进入泌乳期后，管腔上皮细胞通过黏液腺和神经内分泌腺体的形成启动乳汁合成，伴随乳房体积的显著增大。断奶后，随着泌乳刺激因子撤除，腺上皮细胞启动程序性凋亡，导管-腺泡系统逐步被脂肪及结缔组织替代，伴随分泌功能衰退、表皮角质化及色素沉积等退行性改变，最终完成从泌乳状态向基础生理状态的转化^[28]。

2. ScRNA-seq技术在乳腺发育及相关疾病 中的研究进展

2.1. ScRNA-seq技术在胚胎阶段乳腺发育中的应用

乳腺发育的细胞起源研究始终是发育生物学领域的核心命题，现有研究普遍认为乳腺组织起源于胚胎多能祖细胞，其核心争议点在于多能祖细胞的谱系限制时间窗口与形态发生的表观遗传调控耦合机制。近年来，scRNA-seq技术的迭代突破为解析这一动态过程提供了全新视角，揭示了胚胎期乳腺祖细胞多能性向谱系限制性转变的动态调控网络。

Wuidart等^[29]通过整合多色谱系追踪与scRNA-seq技术，发现胚胎第14天存在共表达基底/管腔双谱系标记的多能祖细胞，证实p63可驱动管腔细胞向基底表型转化，但受限于早期胚胎样本稀缺性(仅捕获193个细胞)，未能揭示跨发育阶段的动态转录调控网络。Giraddi等^[30]通过构建跨胚胎至成年的单细胞图谱，揭示了在胚胎第16~18天富集的EMPs，其混合谱系特征在出生后逐渐消退，并最终分化为独立的基底与管腔2大谱系，但该研究未完全阐明谱系限制性转换的关键调控因子。Dravis等^[31]通过基于高通量测序的转座酶可及性染色质分析(assay for transposase accessible chromatin with high throughput sequencing，ATAC-seq)发现，SRY-box转录因子10(SRY-box transcription factor 10，SOX10)结合位点特异性富集于胚胎EMPs的编码区，其激活显著增强祖细胞分化能力，首次确立多能向单能转换的核心调控枢纽。Chung等^[32]进一步整合单核ATAC-seq(single nucleus ATAC-seq，snATAC)/scRNA-seq揭示发育时序：胚胎第13天前体细胞高表达Krt18/Krt14/p63并保持多能性，至出生前完成谱系分化，这些胚胎源祖细胞定位于乳头区初级导管，出生后进入静息状态，但可被卵巢激素重新激活参与腺体重建。上述研究系统描绘了单细胞分辨率下胚胎乳腺发育的表观遗传调控框架，但跨物种保守性验证(例如人类胎儿乳腺单细胞图谱的缺失以及微环境细胞与上皮祖细胞的时空对话机制)仍亟待填补。

2.2. ScRNA-seq技术在出生后乳腺发育中的应用

在出生后乳腺发育研究中，scRNA-seq技术的应用为解析乳腺祖细胞异质性及其分化潜能提供了全新的时空分辨率。尽管传统遗传谱系示踪、流式表面标志物分选及DNA条形码技术已证实基底/管腔谱系祖细胞的存在，但关于出生后乳腺祖细胞分化潜能的问题，依然存在不少争议。

当前学界对乳腺祖细胞的分化潜能存在不同见解。多项研究^[33-34]表明：出生后乳腺组织内存在具有体外重建能力的双能祖细胞，这类细胞可同时向管腔细胞群和基底细胞群2个谱系分化。然而亦有研究^[35-36]提出异议，指出成年哺乳动物乳腺中仅存在单能祖细胞亚群，这些特定祖细胞通过谱系限制性分化机制，分别专一性地生成管腔或基底细胞系，从而驱动乳腺发育进程，并最终形成具有功能异质性的上皮细胞群体。值得注意的是，这些祖细胞群体广泛参与乳腺发育的不同阶段，其与微环境基质成分建立的动态互作网络，协同维持组织稳态，这种精密调控体系保障了生物体在生命周期不同阶段均能产生结构完整且功能特异化的成熟细胞^[37-38]。

针对乳腺发育过程中祖细胞分化潜能的学术争议，Bach等^[4]通过跨发育周期的单细胞转录组测序分析取得突破性进展。该研究系统采集了未孕期、妊娠期、哺乳期及退化期4个关键发育阶段的乳腺标本，对23 184个上皮细胞进行深度解析，成功构建了包含15个特征性亚群的细胞图谱，其中部分亚群呈现严格的阶段特异性分布特征。基于拟时序分析的技术路径，该研究证实管腔细胞与基底细胞在发育过程中缺乏共同祖细胞来源。Pal等^[15]的研究揭示了不同的分化路径，通过对青春期前、青春期、成年期及妊娠期乳腺细胞的系统分析，发现青春期前阶段的上皮细胞主要呈现基础表型，同时鉴定出一群稀有的CD55⁺管腔特征性上皮细胞。这类早期祖细胞亚群在青春期呈数量级增长，并特异性定植于管腔细胞区室；至青春期后阶段，CD55⁺细胞则展现出跨区室迁移能力，同时存在于基底与管腔细胞区室。虽然对祖细胞分化机制仍存争议，但现有证据链更倾向于支持出生后乳腺组织中存在双能祖细胞的理论框架^[39-40]。

目前研究者关注焦点已从细胞谱系分化延伸至微环境动态平衡、泌乳功能调控及激素信号网络等维度。有学者^[41]通过建立绝经前后乳腺组织分离模型研究乳腺组织的免疫与基质微环境，发现在绝经前后组织微环境中常驻细胞存在差异，在绝经后，成纤维细胞和血管内皮细胞的比例显著下降。通过京都基因与基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析发现绝经前富含免疫调节信号通路，其中基质金属蛋白酶和趋化因子作为关键分子标志物呈现高表达特征。英国剑桥干细胞研究所团队^[42]从9个母乳样本和7个非哺乳期乳腺组织中分离了110 774个细胞，通过scRNA-seq分析泌乳乳腺上皮细胞簇、哺乳期基质细胞和免疫细胞以及乳源性管腔细胞簇和非泌乳管腔祖细胞之间的差异，发现存在2种功能特化的泌乳细胞亚型，并证实转录因子信号转导与转录激活因子5A(signal transducer and activator of transcription 5A，STAT5A)是分泌型管腔细胞分化和泌乳功能建立的必要条件，同时揭示SOX10调控基因在管腔细胞亚群中呈现空间异质性表达模式。值得注意的是，尽管管腔细胞具有共同的高表达基因，但可能由于受到具有不同下游效应的转录因子的调节，导致泌乳细胞之间存在差异，具体的机制还需进一步研究。

相较于雌激素与孕激素在乳腺生物学中的明确作用，雄激素的分子调控网络尚不明晰。Raths等^[43]对变性男性接受雄激素治疗后的乳腺组织进行了单细胞分辨率转录组、染色质和空间图谱分析，发现典型的雄激素受体基因靶点在表达雄激素受体的细胞中上调，激素反应型腔细胞在雄激素治疗期间激活雄性基因程序，导致乳腺上皮肌细胞覆盖减少，其中泌乳相关基因ACTA2、OXTR以及TP63呈现剂量依赖性表达抑制。同时，雄激素对乳腺微环境的调控除直接抑制泌乳相关分子模块外，还引发免疫景观重塑，具体表现在雄激素治疗后巨噬细胞减少，特别是在上皮附近，通路分析显示这些细胞的内吞作用与抗原呈递通路的富集度显著降低；受体互作网络建模进一步证实巨噬细胞中蛋白S1(protein S1，PROS1)受体、MER原癌基因酪氨酸激酶(MER proto-oncogene tyrosine kinase，MERTK)以及其他清除相关受体呈现同步表达衰减。

2.3. ScRNA-seq技术在乳腺发育相关疾病中的应用

目前，scRNA-seq技术在乳腺疾病研究中的应用多针对乳腺癌，包括乳腺癌异质性解析、肿瘤免疫微环境解构、转移机制探索及治疗耐药性的研究等^[44]，而乳腺发育相关疾病的研究较少。Nguyen等^[45]选取乳房缩小整形术患者的纯化乳腺上皮细胞进行scRNA-seq，鉴定了3个特征性细胞亚群，揭示乳腺上皮主要由基底细胞与2种管腔细胞L1及L2组成，并通过标记ZEB1和TCF4发现在基底细胞簇中包含1组乳腺干细胞，这与既往针对小鼠乳腺细胞的scRNA-seq结果^[15]一致。结合Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件进行通路富集解析，发现L1管腔细胞显示出诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)信号转导的独特特征，表明该细胞可能与组织损伤和炎症前哨功能相关。同时L1中PI3K/Akt和糖皮质激素信号转导水平升高，表明可能与该细胞群与类固醇激素信号转导有关。在L2管腔细胞中，雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin，mTOR)信号通路与醛固酮信号模块特异性富集，表明其为激素响应性细胞群。该研究^[45]重建了乳腺上皮内的谱系层次结构，并建立特定乳腺癌亚型与生理性上皮亚群的分子对应关系，不仅为乳腺癌研究提供新型分子靶标，更为巨乳症等发育相关疾病的机制解析与治疗策略开发奠定了基础。

Bhupinder等^[41]使用scRNA-seq技术对人乳腺正常状态、癌前状态和肿瘤状态的乳腺细胞进行了分析，提供了正常乳腺组织和乳腺癌组织的细胞及微环境异质性的全局视图。该研究整合乳房缩小成形术样本，采用荧光激活细胞分选技术对标本进行CD49f/EpCAM双标记分选，系统构建了乳房缩小成形术来源细胞的整合性单细胞图谱。通过聚类证实了样本中存在基底细胞、管腔祖细胞和成熟管腔细胞3个主要的上皮细胞群和1个基质细胞簇，这与Nguyen等^[45]的研究结论一致。进一步通过差异基因表达加权分析发现正常乳腺导管微环境的转录景观至少包含7个主要簇：成纤维细胞、周细胞/血管周细胞、内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、T和B淋巴细胞。该研究进一步丰富了人类乳腺的单细胞图谱，为巨乳症研究提供了新思路和靶点。

3. ScRNA-seq技术的优点与不足

在基因组学研究领域，用于基因测序的方法有很多，且各具特色，如全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)、RNA测序技术、高通量测序(high-throughput sequencing，HTS)技术以及宏基因组测序技术等。WGS技术通过解析生物体全部DNA序列，可检测编码区/非编码区变异及结构变异，在肿瘤基因组学和遗传病研究中应用广泛^{[40, 44]}。RNA测序技术聚焦转录组层面，揭示基因表达动态^[46]。HTS凭借大规模并行测序优势，显著提升了检测通量^[47]。宏基因组测序突破传统培养限制，实现微生物群落全景分析^[48]。这些技术为群体水平研究奠定基础，却难以解析细胞异质性。

ScRNA-seq是一种在单个细胞水平上解析基因组、转录组或表观组的技术，与其他基因测序方法相比，具有独特的优势和局限性^[49]。相较于传统测序技术，scRNA-seq基于分辨率、异质性分析及动态追踪能力3个维度展现出核心优势。具体而言，scRNA-seq具有单细胞精度的分辨率；可突破传统测序的“细胞平均化”局限，可识别占比<1%的稀有细胞亚群；通过拟时序分析揭示细胞分化路径，实现细胞发育轨迹的重构。另外，还可通过scRNA-seq技术整合基质细胞、免疫细胞数据，构建细胞通讯网络，开展微环境互作研究^[50]。

ScRNA-seq技术通过解析单个细胞的转录组特征，突破了传统测序技术的群体平均效应限制，在乳腺发育及相关疾病研究中展现出显著优势^[51-52]。相较于传统测序技术，仅能提供细胞群体的平均表达数据，scRNA-seq可揭示乳腺上皮细胞、基底细胞及间质细胞等亚群的高度异质性。例如，在胚胎期乳腺发育中，单细胞技术成功识别出Comma-1D细胞系的异质性，并发现Comma-1D细胞系是乳腺发育的独特体外模型^[53]。细胞亚群的基因表达特征在传统批量测序中会被忽略，而单细胞分辨率确定了以前在大量RNA测序衍生的特征中未报道的干扰素(interferon，IFN)基因表达，并提出IFN/信号转导与转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)信号转导可作为乳腺相关疾病的候选治疗靶点^[54]，而传统方法因分辨率不足难以捕捉这类罕见细胞亚群的基因表达特征。

在疾病研究中，scRNA-seq技术不仅解析了乳腺癌肿瘤微环境的免疫细胞组成和乳腺癌细胞与T细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞之间的复杂关系^[55-56]，还通过分析鼠乳腺组织的样本揭示了衰老对乳腺生理的影响，并强调了乳腺上皮细胞和基质的复杂异质性，为乳腺相关疾病提供了新的分子标志^[57]。此外，scRNA-seq技术具有构建时间分辨率的动态图谱的可及性。例如通过scRNA-seq解析了人乳来源的乳腺上皮细胞特征，发现泌乳期乳腺中存在异质性分泌型管腔细胞簇，以及代谢功能与静息期管腔细胞存在显著差异^[42]。这种单细胞层面的精准解析能力，使其在揭示激素响应机制、追踪细胞分化轨迹及发现治疗靶点方面具有不可替代性，突破了传统技术因群体平均效应导致的生物学信息丢失瓶颈。

ScRNA-seq技术在乳腺研究领域展现出独特优势，但其技术瓶颈仍需突破。例如，细胞捕获过程中易损伤细胞活性，需进一步提升通量与精度；高维测序数据存在显著噪声干扰，亟待优化降噪算法；动态发育过程的时空解析能力有限，难以精准捕捉细胞类型转化细节。此外，较高昂的分析成本也制约其常规化应用。为突破现有局限，与多组学方法深度融合将带来益处。空间转录组技术可锚定细胞原位分子特征，蛋白质组学实现单细胞蛋白定量分析，代谢组学精准定位功能代谢物，质谱流式技术则支持大规模细胞表型鉴定。这种多维度技术整合不仅能深入解析细胞异质性与调控网络，更为揭示乳腺发育相关疾病机制、推动靶向治疗和药物研发提供系统性研究框架。

4. 结 语

ScRNA-seq技术为解析乳腺疾病发生机制提供了新视角，通过构建细胞图谱可精准识别特殊功能亚群，揭示特征性基因表达模式及异常信号转导网络，为靶向治疗策略的开发奠定分子基础。该技术不仅能用于筛选潜在治疗靶点，还可用于动态监测治疗响应细胞的转录组特征，为个体化治疗提供指导。

然而，scRNA-seq技术的临床应用仍面临诸多挑战。在细胞异质性解析方面，现有算法在细胞类型判定及聚类数量确定方面仍存在分辨率不足的问题，导致细胞亚群注释存在不确定性；在数据解析层面，传统基因评分方法因忽视单细胞数据特有的稀疏性特征，易造成关键调控通路的误判。这些问题亟待通过方法学优化及跨学科合作加以解决，例如开发整合空间转录组的多模态分析框架，建立基于人工智能的动态建模系统等。

总之，作为医学研究的重要工具，scRNA-seq技术在医学领域具有巨大的应用潜力。它可以加深对疾病的认识，推动药物开发和靶向治疗策略的进展，提高肿瘤治疗的效果，推动组织和器官再生的研究，并为医学的发展做出重要贡献。

基金资助

湖南省科技创新计划项目(2021RC4058)。

This work was supported by the Science and Technology Innovation Program of Hunan Province, China (2021RC4058).

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

文诗仪 论文撰写与修改；胡杨、陈翔宇 论文修改；周建大 论文指导与修改；李萍 论文指导。所有作者阅读并同意最终的文本。