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. 2025 Sep 20;45(9):1980–1988. [Article in Chinese] doi: 10.12122/j.issn.1673-4254.2025.09.17

脑络欣通通过激活HIF-1α/VEGF信号通路促进氧糖剥夺/复氧复糖损伤后大鼠的脑微血管内皮细胞增殖

Naoluo Xintong Decoction promotes proliferation of rat brain microvascular endothelial cells after oxygen-glucose deprivation by activating the HIF-1α/VEGF signaling pathway

ZHANG Yu 1,2,2,4, HU Yinqi 1,3,4, LI Peipei 1,2, SHI Xiao 1, XU Wei 1, HU Jianpeng 1,2,✉
Editor: 余 诗诗
PMCID: PMC12479260  PMID: 41022607

Abstract

Objective

To investigate the effects of Naoluo Xintong Decoction (NLXTD) on proliferation of rat brain microvascular endothelial cells (BMECs) after oxygen-glucose deprivation/reoxygenation (OGD/R) injury and role of the HIF-1α/VEGF pathway in mediating its effect.

Methods

Using a BMEC model of OGD/R, we tested the effects of 10% NLXTD-medicated rat serum, alone or in combination with 2ME2 or 10% NAKL, on cell proliferation, migration, tube-forming ability and permeability using CCK-8 assay, Transwell chamber assay, tube formation assay and permeability assay. Cellular expressions of VEGF and Notch were detected using ELISA and laser confocal immunofluorescence analysis, and the expressions of HIF-1α, VEGFR2, Notch1, ERK and P-ERK1/2 proteins were detected with Western blotting.

Results

OGD/R injury significantly decreased viability of BMECs. NLXTD treatment of the cells with OGD/R could significantly promoted cell proliferation, migration and tube formation ability, but these effects were strongly attenuated by application of 2ME2. NLXTD treatment also significantly increased the percentages of VEGF- and Notch-positive cells in the cell models and obviously enhanced the expression levels of HIF-1α, VEGFR2, Notch1 and P-ERK1/2.

Conclusion

NLXTD promotes proliferation, migration, and tube formation of rat BMECs after OGD/R injury possibly by activating the HIF-1α/VEGF signaling pathway.

Keywords: ischemic stroke, Naoluo Xintong Decoction, HIF-1α/VEGF signaling pathway, oxygen-glucose deprivation/reoxygenation injury, cerebral microvascular endothelial cells

缺血性脑卒中是由于缺血、缺氧等因素导致脑部血液循环障碍，进而引发脑组织缺血性坏死或软化的一类疾病。缺血性脑卒中约占卒中类型的80%，是近年来威胁人类生命健康最严重的疾病之一［1］。近年来，多项研究证实，缺血半暗带区新生成的血管可以形成新的侧支循环，促进缺血半暗带区血流恢复，挽救受损脑神经［2］。脑微血管内皮细胞（BMECs）是一种高度分化的细胞，是构成新生血管的重要成份，促进BMECs的激活、增殖、迁移是影响缺血半暗带区血管新生的重要因素［3］，亦是进一步促进“神经-血管单元”修复的关键治疗策略和重要靶点。然而目前中医药干预缺血性脑卒中血管新生的研究多局限于动物模型及临床观察，缺乏基于体外细胞模型的靶向机制探索［4， 5］。这种研究体系的局限性导致药物对目标细胞的直接作用难以阐明，且现有在体实验存在给药剂量与时间窗控制困难、体外研究多聚焦单一蛋白而忽视信号通路动态调控网络等问题［6］，制约了血管新生机制的深入研究。

脑络欣通（NLXTD）是新安医家王乐匋先生的临床验方，NLXTD主要由黄芪、川芎、三七、天麻、当归、红花、蜈蚣组成。在课题组前期NLXTD防治脑缺血的机制研究中发现［7-9］，NLXTD可以增加缺血再灌注大鼠局部脑组织的血流量，降低神经功能缺损评分而发挥抗损伤作用，同时通过前期体内动物实验发现局灶性脑缺血再灌注第7天，NLXTD给药组新生血管数量相较模型组显著增加，进一步的机制探讨表明局灶性脑缺血再灌注后血管新生可能与HIF-1α（HIF-1α）/VEGF（VEGF）信号通路激活有关。基于此，本研究将在前期体内动物实验的基础上，建立体外氧糖剥夺/复氧复糖（OGD/R）损伤模型，系统探讨以下科学问题：在OGD/R应激下，VEGF上游缺氧诱导因子HIF-1α的调控模式及其对VEGF表达的影响；VEGF信号变化对其下游效应分子的级联调控作用；NLXTD通过干预HIF-1α/VEGF通路对BMECs增殖及功能保护的具体机制。通过多维度解析该信号通路在血管新生中的动态调控网络，弥补单一分子研究的不足，为未来研发保护血管内皮细胞并减轻脑卒中后脑缺血再灌注损伤的药物提供新参考。

1. 材料和方法

1.1. 材料

1.1.1. 细胞株与实验动物

大鼠BMECs（RAT-iCell-n001，赛百慷生物技术股份有限公司）。SPF级雄性SD大鼠30只，体质量220~280 g（辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK（辽）2020-0001），饲养于安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室，实验动物操作均按照国家科学技术委员会发布的《实验动物管理条例》执行，动物伦理批号：AHUCM-rats-2024020。

1.1.2. 实验药物

脑络欣通方组成：黄芪30 g、川芎10 g、三七6 g、当归10 g、红花10 g、天麻10 g、蜈蚣2条；脑安颗粒（NAKL：河南百泉药业股份有限公司，批号：1182212145，国药准字：Z19991044，规格：1.2×10袋）。以上药材均购自安徽中医药大学第一附属医院。

1.1.3. 实验试剂

内皮细胞完全培养基（ScienCell）、DMEM无糖培养液、胎牛血清（Gibco）、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）、青霉素-链霉素混合液、CCK-8检测试剂盒（白鲨生物技术有限公司）、Transwell 小室（Corning）、Matrigel基质胶（Corning）、FITC-dextran（MW 40000）、VEGF ELISA试剂盒（武汉基因美科技有限公司）、BCA蛋白定量检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）、Notch抗体（Bioss）、VEGF抗体（Santa）、HIF-1α抗体（Proteintech）、VEGFR2抗体（Bioss）、ERK1/2；P-ERK1/2抗体（CST）、Notch1（Abcam）、山羊抗兔IgG（FITC）、山羊抗小鼠IgG（CY3）。

1.1.4. 实验仪器

普通细胞培养箱、三气培养箱、高速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）、纯水机（上海和泰仪器有限公司）、倒置显微镜（OLYMPUS）、多功能酶标仪（雷杜）、超净工作台（苏州佳宝净化工程设备有限公司）、电泳仪；电泳槽；转膜仪（上海天能科技有限公司（Tanon）；VE-180）、FV1000型激光共聚焦显微镜（Olympus）。

1.2. 方法

1.2.1. BMECs的培养

BMECs接种于含有7 mL内皮细胞完全培养基（10% FBS和1% 青霉素-链霉素）的T25瓶内，放置在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱，待融合度达到75%~85%进行传代，选取对数生长期、生长状态良好的细胞进行后续实验研究。

1.2.2. OGD/R模型的建立

参照李佩佩［10］构建的大鼠BMECs的OGD/R细胞模型方法，制备BMECs细胞OGD/R损伤模型。取对数期BMECs，PBS洗涤3次后，加入无糖DMEM培养基，将细胞置于三气培养箱（37 ℃，95%N2、5%CO2、1%O2）中培养6 h，随后更换完全培养基于普通培养箱中复氧24 h进行模型诱导。

1.2.3. 脑络欣通含药血清制备

SD大鼠按随机数表法分为空白血清组、脑络欣通含药血清组和脑安颗粒含药血清组，10只/组。空白血清组按大鼠体质量予以等体积生理盐水灌胃，2次/d。脑络欣通含药血清组参照前期课题组灌胃剂量，按每日8.4 g/kg的剂量灌胃［10］，脑安颗粒含药血清组参照《药理实验方法学》［11］，按每日7.2 g/kg的剂量灌胃，2次/d，持续灌胃7 d。于末次灌胃2 h后以1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射进行深度麻醉，无菌条件下暴露腹主动脉，使用负压采血管取血，室温静置2 h后，4 ℃，3000 r/min离心15 min，收集上清液，于56 ℃水浴灭活30 min，0.22 μm滤膜过滤除菌，分装于2 mLEP管中，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.4. 细胞分组及给药

细胞分为正常细胞组（Normal组）、模型组（OGD/R组）、脑络欣通含药血清组（OGD/R+10%NLXTD）、脑络欣通含药血清+抑制剂组（OGD/R+10%NLXTD+2ME2组）、脑安颗粒含药血清组（OGD/R+10%NAKL）、参照前期课题组给药剂量及方法［10］，于复糖复氧的同时，正常组、模型组加入10%空白血清，脑络欣通组和抑制剂组各加入10%脑络欣通含药血清，脑安颗粒组加入10%脑安颗粒含药血清，各组均干预24 h。

1.2.5. 细胞活力检测

采用CCK-8法检测脑络欣通方对OGD/R后BMECs细胞活力的影响。取对数生长阶段的BMECs细胞以1×105/孔的密度接种于96孔板中，按“1.2.4”项进行分组及给药，待细胞贴壁。正常细胞组于正常条件下培养；模型组及给药组将培养基更换为DMEM无糖培养基并加入含有相应体积的空白血清/含药血清的培养基干预24 h。按照CCK-8试剂盒说明书进行操作，并计算A 450 nm处各孔的吸光度值。

1.2.6. Transwell细胞迁移愈合实验

采用Transwell迁移实验检测脑络欣通方对OGD/R后BMECs迁移的影响。取传代培养的细胞接种于24孔板中，按“1.2.4”项下要求进行分组及处理。于24 h后收集各组细胞。加入无血清培养基重悬后计数，将细胞浓度调整为2×105/mL，取200 μL细胞悬液加入Transwell小室，继续培养24 h。后取出Transwell小室，用4%多聚甲醛室温固定30 min，0.1%结晶紫中室温染色20 min，PBS洗涤2遍后用湿润的棉签轻柔拭去上室底部未迁移的细胞，在倒置显微镜下观察迁移细胞的数量并拍照。

1.2.7. 细胞成管实验

采用细胞成管实验检测NLXTD对OGD/R后BMECs成管的影响。提前将10 mg/mL的Matrigel基质胶、96孔板和200 μL无菌枪头放置4℃冰箱过夜预冷。次日取出Matrigel基质胶，于冰上向96孔板中均匀铺满Matrigel基质胶（60 μL/孔），在37 ℃培养箱中凝固1 h。取对数生长期大鼠BMECs消化，按“1.2.4”项下方法进行分组及给药，制备细胞悬液，按1×105/孔的细胞密度均匀接种至预先铺胶的96孔板中，37 ℃孵育4~6 h后，观察，随机拍3个视野，使用ImageJ软件测量分析。

1.2.8. 内皮细胞通透性检测

采用血管内皮细胞通透性实验检测NLXTD对OGD/R后BMECs通透性的影响。在Transwell下室中加入2 mL内皮细胞培养基，Transwell上室中加入1 mL细胞悬液（含1×106细胞），37 ℃培养细胞贴壁。按“1.2.4”项下方法进行分组及给药，继续培养。吸弃Transwell上、下室培养基，在各组细胞Transwell下室中加入1.5 mL内皮细胞培养基，Transwell上室中加入0.5 mL FITC-dextran（1mg/mL），室温避光培养1 h；取各组细胞Transwell下室液体，用荧光酶标仪测液体的荧光强度，分析细胞通透性系数。

1.2.9. ELISA法检测VEGF水平

采用Elisa法检测NLXTD对OGD/R后各组细胞VEGF含量表达的影响。按照Elisa试剂盒说明书提供的稀释方式和“1.2.4”项下分组进行稀释和加样，加入酶标试剂50 μL（正常细胞组孔不加样品及酶标试剂），封板后37 ℃孵育30 min，洗涤液洗涤30 s，各组先后加入显色剂A和B各50 μL，37 ℃避光显色30 min，加终止液50 μL终止反应，15 min后测量各孔吸光度A 450 nm。

1.2.10. 免疫荧光双染检测VEGF、Notch蛋白表达

采用激光共聚焦免疫荧光法检测NLXTD对OGD/R后VEGF、Notch蛋白表达的影响。细胞培养结束后，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS清洗3次，滴加0.5%TritonX-100加盖置于37 ℃培养箱孵育30 min，PBS缓慢清洗3次除去0.5%TritonX-100。滴加山羊血清封闭液，37 ℃培养箱孵育30 min。封闭结束后，直接吸出山羊血清封闭液，无需清洗，将双标的抗体（VEGF+Notch）按照相应的稀释比例混匀，滴加混匀的一抗，加盖置于37 ℃培养箱孵育60 min。除去一抗，PBS-T缓慢清洗3次。滴加混匀的免疫荧光二抗（山羊抗兔IgG（FITC）、山羊抗小鼠IgG（CY3）/1∶400），加盖置于37 ℃培养箱避光孵育30 min。除去二抗，PBS-T缓慢清洗3次。将爬片取出，用抗荧光淬灭封片剂（含DAPI）封片，摄片，ImageJ分析荧光蛋白强度。

1.2.11. Western blotting检测HIF-1α/VEGF通路相关蛋白的水平

采用Western blotting法检测BMECs细胞中HIF-1α、VEGFR2及ERK、P-ERK1/2以及Notch1蛋白表达水平。按“1.2.4”项进行分组给药，细胞复氧复糖24 h后，PBS洗涤、离心去除上清液后加入600 µL（内含0.6 mmol/L PMSF）裂解液进行裂解提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。收集的蛋白样品中按照1∶4加入5X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。沸水浴加热15 min，以充分变性蛋白。待样品冷却到室温后，经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h后一抗HIF-1α（1∶2 000）、VEGFR2（1∶1000）、ERK1/2（1∶1000）、P-ERK1/2（1∶2000）、Notch1（1∶1000）和GAPDH（1∶2000）4 ℃孵育过夜，洗膜3次加入对应的二抗（1∶20 000）室温孵育1.2 h，洗膜3次后显色成像，10 min/次，使用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值。

1.3. 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，采用方差分析进行组间差异性分析，符合正态分布、方差齐时，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；方差不齐使用 Tamhane's T2分析；不符合正态分布，采用Kruskal-Wallis秩和检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. 脑络欣通含药血清对OGD/R后BMECs活力的影响

CCK-8实验结果显示，Normal组的细胞增殖率最高，OGD/R组经过OGD/R处理后，细胞增殖率显著降低（P<0.01）；与OGD/R组相比，OGD/R+10%NLXTD组、OGD/R+10%NLXTD+2ME2组、OGD/R+10% NAKL组的细胞增殖率明显增加（P<0.01， 图1）

图1.

图1

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NLXTD含药血清对OGD/R大鼠BMECs活力的影响

Fig.1 Effect of NLXTD-medicated serum on viability of BMECs with OGD/R injury (n=6). ## P<0.01 vs normal group; && P<0.01 vs OGD/R group.

2.2. 脑络欣通含药血清对OGD/R后BMECs细胞迁移的影响

Transwell实验显示，与Normal组比较，OGD/R组细胞迁移数目减少（P<0.01）；与OGD/R组比较，OGD/R+10%NLXTD、OGD/R+10%NAKL组细胞迁移数目明显升高（P<0.01）；与OGD/R+10%NLXTD比较，OGD/R+10%NLXTD+2ME2组细胞迁移数目明显减少（P<0.01，图2）。

图2.

图2

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NLXTD含药血清对OGD/R大鼠BMECs迁移能力的影响

Fig.2 Effect of NLXTD-medicated serum on migration capacity of BMECs with OGD/R injury (Original magnification: ×100, n=6). ## P<0.01 vs normal group; && P<0.01 vs OGD/R group; *P<0.01 vs OGD/R+10%NLXTD group.

2.3. 脑络欣通含药血清对OGD/R后BMECs成管的影响

细胞成管实验结果显示，与Normal组比较，OGD/R组细胞成管数目减少（P<0.01）；与OGD/R组比较，OGD/R+10%NLXTD、OGD/R+10%NAKL组细胞成管数目增加（P<0.01）；而与OGD/R+10%NLXTD比较，OGD/R+10%NLXTD+2ME2的细胞成管数目明显减少（P<0.05，图3）。

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2.4. 脑络欣通含药血清对OGD/R后BMECs细胞通透性的影响

内皮细胞通透性实验结果显示，与Normal组比较，OGD/R组细胞渗透率提升（P<0.01）；与OGD/R组比较，OGD/R+10%NLXTD、OGD/R+10%NAKL组细胞渗透率降低（P<0.01）；而与OGD/R+10%NLXTD+2ME2组比较，OGD/R+10%NLXTD组细胞渗透率明显减少（P<0.05， 图4）。

图4.

图4

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NLXTD含药血清对OGD/R大鼠BMECs渗透率的影响

Fig.4 Effect of NLXTD-medicated serum on permeability of BMECs after OGD/R injury (n=6). ## P<0.01 vs normal group; && P<0.01 vs OGD/R group;*P<0.05 vs OGD/R+10%NLXTD+2ME2 group.

2.5. 各组大鼠血清VEGF水平的表达

Elisa实验显示，与Normal组比较，OGD/R组VEGF表达水平升高（P<0.01）；与OGD/R组比较，OGD/R+10%NLXTD、OGD/R+10%NLXTD+2ME2、OGD/R+10%NAKL组VEGF表达水平提升（P<0.01）；与OGD/R+10%NLXTD组比较，OGD/R+10%NLXTD+2ME2组VEGF表达水平明显减少（P<0.05， 图5）。

图5.

图5

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NLXTD含药血清对OGD/R大鼠BMECs上清VEGF的影响

Fig.5 Effect of NLXTD-medicated serum on supernatant VEGF level in BMECs after OGD/R injury. ## P<0.01 vs normal group; && P<0.01 vs OGD/R group;*P<0.05 vs OGD/R+10%NLXTD group.

2.6. 脑络欣通含药血清荧光双染含量的检测

激光共聚焦免疫荧光双染实验结果显示，与Normal组比较，OGD/R组VEGF、Notch的阳性细胞数占比升高（P<0.01）；与OGD/R组比较，OGD/R+10%NLXTD、OGD/R+10%NLXTD+2ME2、OGD/R+10%NAKL组VEGF、Notch阳性细胞数占比提升（P<0.01）；与OGD/R+10%NLXTD组比较，OGD/R+10%NLXTD+2ME2组阳性细胞数占比减少（P<0.05， 图6）。

图6.

图6

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NLXTD含药血清对OGD/R损伤大鼠BMECs VEGF、Notch荧光蛋白表达的影响

Fig.6 Effect of NLXTD-medicated serum on expressions of VEGF and Notch fluorescent protein in BMECs after OGD/R injury ( n=6). ## P<0.01 vs normal group; && P<0.01 vs OGD/R group;*P<0.01 vs OGD/R+10%NLXTD group.

2.7. 脑络欣通含药血清对OGD/R后BMECs相关蛋白的表达

Western blotting实验结果显示，与Normal组比较，OGD/R组HIF-1a、VEGFR2、Notch1蛋白相对表达量增加（P<0.05）；与OGD/R组比较，OGD/R+10%NLXTD、OGD/R+10%NAKL组HIF-1α、VEGFR2、Notch1、P-ERK1/2蛋白相对表达量增加（P<0.01）；与OGD/R+10%NLXTD+2ME2组比较，OGD/R+10%NLXTD组HIF-1α、VEGFR2、Notch1蛋白相对表达量增加（P<0.01， 图7）。

图7.

图7

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NLXTD含药血清对OGD/R损伤大鼠BMECs HIF-1a、VEGFR2、Notch1、ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表达的影响

Fig.7 Effect of NLXTD-medicated serum on expressions of HIF-1a, VEGFR2, Notch1, ERK1/2, and P-ERK1/2 proteins in BMECs after OGD/R injury (n=4). ## P<0.05 vs normal group; && P<0.01 vs OGD/R group; *P<0.01 vs OGD/R+10%NLXTD+2ME2 group.

3. 讨论

缺血性脑卒中是一个复杂动态的生理、病理过程，而影响脑缺血发生、发展和预后的初始因素是脑内血管功能的障碍［12］。脑缺血发生以后，局部组织缺血缺氧导致胶质细胞肿胀，红细胞和纤维蛋白沉积堵塞微血管，从而诱发局部脑组织缺氧性病变和坏死障碍，进而导致相应神经血管功能丧失［13， 14］。研究表明脑缺血损伤部位血管新生可以增加脑血流量，减少缺血损伤，促进脑缺血后血管网络系统的重建［15］。BMECs是脑血管的基本结构和关键细胞，促进BMECs增殖是影响脑血管新生的直接靶点［3］。本研究通过制备BMECs氧糖剥夺/复氧复糖损伤模型，在体外成功模拟在体动物的缺血缺氧状态和再灌注损伤。结果显示，OGD/R刺激导致BMECs损伤，细胞活力、迁移数量和成管数量明显减少，而应用脑络欣通含药血清干预后能够显著减少BMECs损伤，改善BMECs活力，促进细胞迁移和增加细胞成管数目。进一步的机制研究表明，NLXTD治疗后促进BMECs增殖可能受HIF-1a/VEGF信号通路调控。

HIF-1a是缺氧条件下调控细胞代谢最重要的转录因子，响应与缺氧相关的多种病理生理条件［16］。VEGF是迄今为止发现最强的促血管新生活性因子，在促进血管内皮细胞的增殖、分化、迁移以及增强血管通透性等方面具有重要作用［17， 18］。研究显示［19］，低氧环境下，HIF-1与细胞核中的低氧反应元件结合，作用于VEGF编码基因和VEGFR编码基因的结合位点，上调VEGF及配体 mRNA的表达，为血管生成做准备。2-甲氧基雌二醇（2ME2）作为HIF-1α的抑制剂，在缺血性脑卒中以后可降低HIF-1α的表达水平，降低神经元存活［20］。本研究同样在Western blotting实验中证实，与正常对照组相比，OGD/R组HIF-1α、VEGFR2蛋白的表达量显著增加。加入脑络欣通含药血清以后，HIF-1a与VEGFR2的蛋白表达再次显著上调，而加入抑制剂后HIF-1a、VEGFR2蛋白表达量相较脑络欣通组显著降低，提示缺血性脑卒中以后血管新生与HIF-1a蛋白表达量呈正相关，NLXTD可通过上调HIF-1a表达促进OGD/R损伤后血管新生。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是免疫炎症反应的一条重要信号转导通路［21］。ERK是MAPK信号酶的一种，有ERK1和ERK2两种类型，ERK1/2磷酸化参与细胞增殖分化、细胞死亡等多种生物学反应［22］。研究表明［23， 24］，MAPK/ERK信号转导途径是VEGF最重要的下游信号通路，VEGF可通过激活p38MAPK途径发挥氧化损伤保护作用，同时缺血性脑卒中后VEGFR2的激活可以启动MAPK途径信号传导使ERK磷酸化，刺激内皮细胞增殖和分化。张彩凤［25］等人研究发现大蒜素可通过激活VEGF介导MAPK/ERK信号通路促进缺血性脑卒中后血管新生，发挥神经保护作用。在本研究中，我们同样发现模型组P-ERK1/2蛋白表达量相较正常组显著下降，而脑络欣通含药血清组和脑安颗粒含药血清组P-ERK1/2蛋白表达量相较模型组显著上升，这可能为脑络欣通激活VEGF下游蛋白因子进而促进血管新生提供新的证明。

近年来，越来越多的研究表明［26， 27］，Notch信号通路在促进血管生成和维持血管内稳态具有重要作用，这可能与VEGF的调节有关。Notch信号通路主要由Notch受体、Notch配体以及一系列效应物组成，其中大量研究表明［28， 29］，Notch1受体是参与血管新生的主要形式。相关研究报道［30］，缺血性脑卒中后，Notch1及其配体Jagged1在梗塞周围区域表达明显增加，当敲除Notch1基因后，内皮细胞增殖数量明显减少。前期课题组通过脑缺血再灌注损伤体内实验模型发现脑缺血再灌注组Notch1的蛋白表达水平在第7天显著降低［8］。NLXTD再灌注7 d后可进一步上调Notch1的表达。与上述结果一致，Notch1蛋白在OGD/R模型组中蛋白表达量与正常对照组相比显著下调，而给予脑络欣通含药血清培养后，其蛋白表达显著上升。同时激光共聚焦免疫荧光双染结果同样显示给予脑络欣通含药血清以后，VEGF与Notch阳性细胞表达数量相较OGD/R模型组显著上调。

综上所述，本次研究通过体外实验再次验证NLXTD可以激活HIF-1a/VEGF信号通路并诱导BMECs成活、增殖和成管。同时本次实验论证了脑络欣通可能同时激活VEGF下游MAPK、Notch信号通路，从而可能共同发挥脑缺血损伤的修复保护作用，本次研究结果为中药复方NLXTD防治缺血性脑卒中提供了新的实验依据，然而本次实验仍缺少对神经血管交互作用层面的拓展，未来的工作将在此基础上开展缺血性脑卒中神经-血管层面的交互作用及其调控机制。

基金资助

安徽省自然基金（2208085MH265）；安徽省中医药传承创新科研计划项目（2024CCCX014）；国家中医药管理局中医基础理论高水平重点学科建设项目（国中医药人教函[2023]85号）

参考文献

  • 1. 王陇德, 彭 斌, 张鸿祺, 等. 《中国脑卒中防治报告2020》概要[J]. 中国脑血管病杂志, 2022, 19(2): 136-144. [Google Scholar]
  • 2. Kanazawa M, Takahashi T, Ishikawa M, et al. Angiogenesis in the ischemic core: a potential treatment target[J]? J Cereb Blood Flow Metab, 2019, 39(5): 753-69. doi： 10.1177/0271678x19834158 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 3. 张宏兵, 孙小祥, 罗秀琴, 等. 丁苯酚对缺氧缺糖条件下大鼠微血管内皮细胞保护作用的分子机制研究[J]. 解放军医药杂志, 2019, 31(1): 1-5. [Google Scholar]
  • 4. GBD 2019 Stroke Collaborators . Global, regional, and national burden of stroke and its risk factors, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019[J]. Lancet Neurol, 2021, 20(10): 795-820. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 5. 周德生, 谭惠中, 陈 瑶, 等. 活血荣络方对脑缺血再灌注损伤大鼠SIRT1/PGC-1α信号通路的影响[J]. 中国中医药信息杂志, 2023, 30(2): 87-92. [Google Scholar]
  • 6. 龙海红, 唐 军, 闫俊峰. 刺血醒脑法对急性脑梗死患者脑血流动力学及血清VEGF、bFGF的影响[J]. 中国中医急症, 2024, 33(5): 831-4. [Google Scholar]
  • 7. 谭 辉, 尹婷婷, 邓 勇, 等. 益气活血中药脑络欣通促进脑缺血气虚血瘀证大鼠脑血管再生及机制[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2020, 36(8): 712-8. [PubMed] [Google Scholar]
  • 8. Li PP, He L, Zhang LM, et al. Naoluo Xintong decoction ameliorates cerebral ischemia-reperfusion injury by promoting angiogenesis through activating the HIF-1α/VEGF signaling pathway in rats[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2022, 2022: 9341466. doi： 10.1155/2022/9341466 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 9. 谭 辉, 王 键, 尹婷婷, 等. 益气活血方基于miR-124调控Wnt通路促进神经再生[J]. 南方医科大学学报, 2017, 37(8): 1047-53. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 10. 李佩佩, 胡音琦, 刘 佳, 等. 脑络欣通促进氧糖剥夺/再灌注损伤大鼠的脑微血管内皮细胞血管新生: 基于激活caspase-1/Gasdermin D通路[J]. 南方医科大学学报, 2023, 43(7): 1093-101. [Google Scholar]
  • 11. 徐叔云. 药理实验方法学[M]. 3版. 北京: 人民卫生出版社, 2002. [Google Scholar]
  • 12. 刘立雄, 张姗姗, 马 培, 等. 缺血性脑卒中早期复发的相关因素研究[J]. 中国卫生标准管理, 2022, 13(22): 109-13. [Google Scholar]
  • 13. Zhang WF, Jin YC, Li XM, et al. Protective effects of leptin against cerebral ischemia/reperfusion injury[J]. Exp Ther Med, 2019, 17(5): 3282-90. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 14. Hsu YC, Chang YC, Lin YC, et al. Cerebral microvascular damage occurs early after hypoxia-ischemia via nNOS activation in the neonatal brain[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2014, 34(4): 668-76. doi： 10.1038/jcbfm.2013.244 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 15. Chen SC, Huang M, He QW, et al. Administration of sonic hedgehog protein induces angiogenesis and has therapeutic effects after stroke in rats[J]. Neuroscience, 2017, 352: 285-95. doi： 10.1016/j.neuroscience.2017.03.054 [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 16. Chan SY, Loscalzo J. microRNA-210: a unique and pleiotropic hypoxamir[J]. Cell Cycle, 2010, 9(6): 1072-83. doi： 10.4161/cc.9.6.11006 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 17. Bhuvaneswari R, Gan YY, Soo KC, et al. Targeting EGFR with photodynamic therapy in combination with Erbitux enhances in vivo bladder tumor response[J]. Mol Cancer, 2009, 8: 94. doi： 10.1186/1476-4598-8-94 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 18. Detmar M, Brown LF, Claffey KP, et al. Overexpression of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor and its receptors in psoriasis[J]. J Exp Med, 1994, 180(3): 1141-6. doi： 10.1084/jem.180.3.1141 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 19. Zhang S, Kim B, Zhu X, et al. Glial type specific regulation of CNS angiogenesis by HIFα-activated different signaling pathways[J]. Nat Commun, 2020, 11(1): 2027. doi： 10.1038/s41467-020-15656-4 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 20. Zhou D, Matchett GA, Jadhav V, et al. The effect of 2-methoxyestradiol, a HIF-1 alpha inhibitor, in global cerebral ischemia in rats[J]. Neurol Res, 2008, 30(3): 268-71. doi： 10.1179/016164107x229920 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 21. 刘素珍, 杨浩东, 张花治, 等. 信号通路与糖尿病视网膜病变的关系及中医药干预研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志, 2023, 29(22): 265-75. [Google Scholar]
  • 22. Xu Y, Ma Y, Liu XL, et al. miR-133b affects cell proliferation, invasion and chemosensitivity in renal cell carcinoma by inhibiting the ERK signaling pathway[J]. Mol Med Rep, 2020, 22(1): 67-76. doi： 10.3892/mmr.2020.11125 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 23. Song M, Finley SD. ERK and Akt exhibit distinct signaling responses following stimulation by pro-angiogenic factors[J]. Cell Commun Signal, 2020, 18(1): 114. doi： 10.1186/s12964-020-00595-w [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 24. 白皓天, 杨 婧, 李娅兰, 等. 基于VEGF/p38MAPK研究羟基红花黄色素A对过氧化氢诱导人肝细胞氧化损伤的保护作用[J]. 时珍国医国药, 2023, 34(4): 843-8. [Google Scholar]
  • 25. 张彩凤, 张 栋, 李旭成, 等. 大蒜素调控VEGF/MAPK/ERK通路对缺血性脑卒中大鼠血管新生和神经保护的机制研究[J]. 中西医结合心脑血管病杂志, 2024, 22(6): 1040-5. [Google Scholar]
  • 26. 丛 薇, 李 梁, 白雪梅, 等. Notch通路在缺血脑损伤后神经细胞再生及血管生成中的作用[J]. 神经解剖学杂志, 2023, 39(01): 106-10. [Google Scholar]
  • 27. Leslie JD, Ariza-McNaughton L, Bermange AL, et al. Endothelial signalling by the Notch ligand Delta-like 4 restricts angiogenesis[J]. Development, 2007, 134(5): 839-44. doi： 10.1242/dev.003244 [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 28. 陈 悦, 王珍珍, 王文生, 等. 柚皮苷联合头穴针刺对脑缺血大鼠血管新生及Notch1/Akt/eNOS通路的影响[J]. 现代中西医结合杂志, 2022, 31(16): 2218-24. [Google Scholar]
  • 29. 常哲瀚, 张晓璐, 谢雅彬, 等. Notch1在神经再生过程中作用的研究进展[J]. 神经解剖学杂志, 2021, 37(3): 371-4. [Google Scholar]
  • 30. Ran QS, Yu YH, Fu XH, et al. Activation of the Notch signaling pathway promotes neurovascular repair after traumatic brain injury[J]. Neural Regen Res, 2015, 10(8): 1258-64. doi： 10.4103/1673-5374.162758 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

Articles from Journal of Southern Medical University are provided here courtesy of Editorial Department of Journal of Southern Medical University

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