铁死亡相关基因对溃疡性结肠炎具有诊断预测价值

Abstract

Objective

To explore the value of ferroptose-related genes in the diagnosis and prediction of ulcerative colitis (UC).

Methods

We used UC dataset from the GEO database to screen for differentially expressed genes (DEGs) in UC. The DEGs related to ferroptositis were screened from the FerrDb database and their functions were analyzed. The hub genes were identified by constructing the protein-protein interaction network (PPI), the differences in immune infiltration levels between UC and the control group were evaluated using CIBERSORT, and the diagnostic values of the hub genes for UC were verified by using the training set. In a mouse model of UC, we examined the expression levels of the hub genes in the colon tissues of the mice using real-time fluorescence quantitative PCR (qPCR).

Results

We identified a total of 76 DEGs related to ferroptosis. Functional enrichment analysis showed that these genes were significantly enriched in ferroptosis and hypoxia pathways. The PPI network identified 10 hub genes, and 9 of them were highly expressed in UC. Analysis of immune cell infiltration showed that 27 cell types were significantly increased in UC (P<0.05), and the immune checkpoints-related genes had the strongest correlation with the hub gene PPARG (P<0.05). Verification analysis using the training set showed that P4HB, PPARG and STAT3 had the best predictive value for UC (P<0.05). In the UC mouse model, the expression of PPARG was significantly decreased and the expressions of P4HB and STAT3 were significantly increased in the colon tissues of the mice as compared with the normal mice.

Conclusion

Ferroptose-related genes have significant value for diagnosis and prediction of UC.

溃疡性结肠炎（UC）是一种复杂的慢性炎症性肠道疾病，具有反复发作和缓解的特征。全球UC的患病率呈上升趋势，亚洲地区每10万人中30~50人罹患此病^［1］，目前治疗方法包括药物及针对特定炎症通路免疫治疗控制炎症、缓解症状，必要时进行手术治疗^［2］。近年来，铁死亡是一种由于细胞内铁离子积累导致特定类型的细胞死亡方式，通常与氧化应激和脂质过氧化过程密切相关^［3-5］。近年来，许多研究揭示了铁死亡与溃疡性结肠炎之间的关联。有研究发现在UC患者和结肠炎小鼠分离的IECs表现出PTGS2升高和GPX4降低^［6-10］。Xu等^{［11，12］}研究发现铁死亡通过内质网（ER）应激介导的IEC细胞死亡导致UC，可通过NF-κBp65磷酸化抑制。此外，铁死亡通过Nrf2/HO-1信号通路抑制NF-κB介导的促炎细胞因子的分泌，从而缓解UC症状^{［13， 14］}，铁死亡相关基因的表达水平可能与UC的严重程度相关，这些基因的检测可用于疾病的早期诊断和病情监测。近年来，研究显示了铁死亡相关基因在溃疡性结肠炎中可能的诊断或预测价值，铁死亡相关基因SLC7A5和BNIP3被发现在手术治疗的UC患儿诊断时获取的病变直肠组织中表达水平升高，是UC患儿手术治疗的风险因素和预测因子^［15］。但是目前尚缺乏探索铁死亡在UC中作用的临床研究。

本研究将铁死亡相关基因与 UC的诊断和预测相结合，通过生物信息学方法，创新地将UC基因表达数据与铁死亡分析结合，系统性筛选枢纽基因和关键信号通路，并通过动物实验验证这些基因的表达水平与UC诊断及病情评估的相关性。本研究不仅填补了铁死亡相关基因在UC诊断领域的研究空白，还为开发基于铁死亡基因的早期诊断工具提供了理论依据。此外，本研究还探讨了铁死亡相关基因对患者个体化治疗反应的预测价值，为优化UC治疗方案提供了新思路。

1. 材料和方法

1.1. 微阵列数据集收集和数据处理

为了获取UC的基因表达数据集，本研究从NCBI-GEO数据库中筛选微阵列数据集，搜索“溃疡性结肠炎”关键词，得到GSE48958、GSE75214、GSE87466 作为训练集和GSE179285作为验证集。GSE48958包含8例对照组样本和7例UC结肠组织样本，GSE75214包含11例对照组样本和74例UC结肠组织样本，GSE87466包含21例对照组样本和87例UC结肠组织样本，和GSE179285 包含23名对照组和23名UC患者结肠组织标本。

1.2. 铁死亡相关差异表达基因的筛选

通过R软件中的“limma package”分析UC与对照组的差异表达基因（DEGs），以P值<0.05， |logFC|>1.5的基因为差异表达基因，其中logFC>1.5为上调，logFC<-1.5为下调。为了分析与铁死亡相关差异表达基因对UC的影响，本研究从“FerrDb”数据库中收集和整理铁死亡相关基因，通过韦恩图显示DEGs与铁死亡相关基因的交集。

1.3. 铁死亡相关DEGs的功能富集分析及蛋白-蛋白相互作用网络分析

利用R包“clusterProfiler”进行GO和KEGG富集分析铁死相关的DEGs，分析基因的功能和通路。利用GO分析包括生物过程、细胞成分和分子功能3大类，KEGG分析用于探索潜在的通路。进一步利用STRING在线网站（https：//string-db.org/）对与铁死亡相关的DEGs构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析蛋白之间的相互作用，节点代表一个蛋白，边代表蛋白质之间的相互作用。利用Cytoscape（版本3.8.2）软件及cytoHubba插件获取核心差异表达基因，选取子网络中得分最高的基因（最大相关准则、MCC算法）作为枢纽基因。

1.4. UC和对照组的免疫浸润和免疫检查点基因（ICGs）

CIBERSORT可以分析成分差异，定量分析基因集中相关免疫细胞和功能。本研究采用CIBERSORT评估UC与对照组的免疫浸润水平差异。此外，分析UC与对照组之间免疫检查点基因表达的差异。

1.5. 动物实验验证

1.5.1. 实验动物

于药康生物科技有限公司购置SPF级C57BL/6J 雄性小鼠20只（6周龄，体质量20 g左右，合格证号：44824700027572），所有动物实验均经广州医科大学动物伦理委员会批准（伦理批号：ES-2024-K061-01）。

1.5.2. 实验试剂和仪器

本实验所需要试剂及仪器如下：葡聚糖硫酸钠（DSS，相对分子质量36 000~50 000，MP），戊巴比妥钠（上海上药新业药业有限公司），TRIZOL 试剂、DS2000 marker、SYBR Green qRCR Mix（广州东盛生物科技有限公司），罗氏荧光定量PCR仪（ABI）。

1.5.3. 小鼠分组及造模

小鼠在SPF级实验动物房中进行常规饲养，将20只小鼠随机分为2组：对照组（NC），疾病组（DSS），10只/组。根据文献正常组每天饮用纯净水连续11 d，DSS组连续7 d自由饮用3% DSS水溶液，第8天更换饮用纯净水连续3 d，第11天两组小鼠经1%戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后获取结肠样本，液氮速冻，-80 ℃冰箱保存。造模期间密切观察小鼠精神状态、毛发顺滑程度、活动度、体质量变化、便血程度及结肠长度和肠道病理变化，符合临床UC症状及临床病理改变。

1.5.4. 苏木素-伊红（HE）染色

将小鼠结肠组织依次进行固定、脱水透明、浸蜡包埋、切片、脱蜡、HE染色、脱水、透明、封片，显微镜观察拍照进行结肠组织HE病理学分析。

1.5.5. 实时荧光定量PCR 检测结肠组织中相关基因的表达目的基因

使用TRIzol从结肠样品中提取总RNA，根据说明书要求使用RNAiso试剂将RNA反转录为cDNA。引物序列由北京擎科生物科技股份有限公司构建（表1）。以GAPDH的相对比值作为其表达量，采用2^-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。

表1.

引物序列

Tab.1 Primers sequences for qPCR

Primer	Sequence
GPX4-F	GATGGAGCCCATTCCTGAACC
GPX4-R	CCCTGTACTTATCCAGGCAGA
NOX1-F	GGTTGGGGCTGAACATTTTTC
NOX1-R	TCGACACACAGGAATCAGGAT
CYBB-F	TGTGGTTGGGGCTGAATGTC
CYBB-R	CTGAGAAAGGAGAGCAGATTTCG
PTGS2-F	TTCAACACACTCTATCACTGGC
PTGS2-R	AGAAGCGTTTGCGGTACTCAT
HIF-1A-F	ACCTTCATCGGAAACTCCAAAG
HIF-1A-R	CTGTTAGGCTGGGAAAAGTTAGG
ACSL1-F	TGCCAGAGCTGATTGACATTC
ACSL1-R	GGCATACCAGAAGGTGGTGAG
SMAD7-F	GGCCGGATCTCAGGCATTC
SMAD7-R	TTGGGTATCTGGAGTAAGGAGG
CD44-F	TCGATTTGAATGTAACCTGCCG
CD44-R	CAGTCCGGGAGATACTGTAGC
PPARG-F	GGAAGACCACTCGCATTCCTT
PPARG-R	GTAATCAGCAACCATTGGGTCA

F: Forward primer; R: Revise primer.

1.6. 统计学分析

组间比较采用单因素方差分析或t检验；采用 ROC曲线分析枢纽基因， 计算ROC曲线下面积的诊断准确率。采用Spearman秩检验或Pearson相关系数分析枢纽基因与免疫细胞和免疫检查点基因的相关性。所有统计分析均使用R软件（4.1.0版本）和SPSS 20.0版本软件进行。P<0.05（双侧）被认为差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. UC与对照组之间铁死亡相关基因鉴定

使用“limma包”分析UC与对照组的结肠组织来源RNA样本中的DEGs，通过筛选共鉴定800个基因下调（图1A，蓝点），1185个基因上调（图1A，红点）。从“FerrDb“数据库中提取铁死亡相关基因，如图1B所示左边1909个基因是UC与对照组独有的DEGs，右边408个基因数为铁死亡基因，中间的76个为铁死亡相关的DEGs。图1C热图显示铁死亡相关的DEGs标准化表达。图1D列出与铁死亡相关的76个DEGs分类，其中41个驱动基因，38个抑制基因，2个标记基因，其中HIF-1A、FADS2、SLC7A11、IL6可能同时是驱动基因和抑制基因，CHAC1同时为标记基因和驱动基因，。

图1.

UC患者与对照组铁死亡相关差异基因分析

Fig.1 Differentially expressed genes (DEGs) associated with iron death in UC patients and control subjects. A: Volcano maps of differential gene expressions in UC and control groups. B: Intersection of the DEGs and the genes associated with ferroptosis in UC and control groups. C: Heat maps of the DEGs associated with ferroptosis in UC and control groups. D: Classification of the 76 DEGs associated with ferroptosis, including 41 driver genes, 38 suppressor genes, and 2 marker genes.

2.2. UC中与铁死亡相关DEGs富集分析及PPI网络分析

利用R包中的 clusterProfiler 包对差异表达基因进行功能分析，在KEGG分析中富集前3位的通路主要是HIF-1信号通路、铁死亡以及IL-17信号通路。在生物过程分析中主要途径是氧化应激、活性氧以及脂质代谢调节（图2B）。在细胞成分分析中富集到内质网（图2C）。分子功能富集分析主要是氧化应激相关通路的激活（图2D）。KEGG及GO富集分析结果提示氧化应激激活起重要作用。

图2.

UC患者和对照组中铁死亡相关DEGs富集分析

Fig.2 Analysis of DEGs enrichment in relation to ferroptosis in UC and control groups. A: KEGG path in UC and control groups. B: Main biological processes of the DEGs in UC patients and control group. C: Main cell components of the DEGs in UC patients and control group. D: Main molecular functions of the DEGs in UC patients and control group.

与铁死亡相关的差异表达基因列表上传至STRING，设定信度 0.4 作为判断标准构建PPI 网络。图3A中PPI网络分析中共有258条线，67个节点，其中9个分子没有形成分子网络（图3A）。枢纽基因在相关通路中比其他非枢纽基因的的调控发挥更重要的作用，因此枢纽基因也可能成为UC发生发展的生物标志物及治疗靶标。使用Cytoscape 中CytoHubba插件对枢纽基因进行鉴定，通过MCC算法得到分数最高的前10个基因（SCD、CYBB、STAT3、HIF-1A、PPARG、IL6、P4HB、PARP14、ACSL1、ZFP36）作为枢纽基因（图3B）。

图3.

UC患者和对照组与铁死亡相关DEGs PPI分析

Fig.3 PPI analysis of the DEGs associated with ferroptosis in UC and controls. A: PPI network of the DEGs associated with ferroptosis in UC and controls. B: MCC algorithm for screening the main hub gene network.

2.3. UC和对照组之间的免疫浸润和免疫检查点差异分析

使用CIBERSORT算法，进一步分析UC组和对照组之间结肠组织之间的免疫成分的差异，构建了细胞免疫浸润的对比图。通过微阵列数据分析UC和对照组之间免疫检查点基因表达的差异。8个免疫检查点基因中有7个存在显著差异（图4A），其中UC患者与对照组相比，CTLA4、TIGIT、CD274、LAG3、PDCD1LG2、HAVCR2明显升高，SIGLEC15则明显降低。图4B显示28种免疫细胞标记物有显著差异，其中除CD56dimNK细胞在UC中表达降低，包括B细胞，T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞等在UC患者中表达均远高于对照组（P<0.05）。

图4.

UC与对照组之间的免疫检查点和免疫浸润差异分析

Fig.4 Analysis of the differences in immune checkpoint and immune infiltration between UC and control groups in the dataset. A: Differential expression of 8 immune checkpoint genes between UC and control group. **P<0.01,***P<0.001, ****P<0.0001 (Control group vs UC group). B: Differences in 28 different types of immune cells between UC patients and controls.

2.4. 枢纽基因与免疫细胞和免疫检查点基因的相关性

图5显示了10个枢纽基因与8个免疫检查点的相关性。其中枢纽基因PPARG除与免疫检查点SIGLEC15呈正相关外，与其余枢纽基因均呈负相关；其他9个枢纽基因则与免疫检查点呈正相关，其中CYBB与7种免疫检查点显著相关，其中与CTLA4正相关性最强（r=0.823，P<0.001）。图5B显示10个枢纽基因与免疫细胞之间均有强相关性，包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、吞噬细胞和单核细胞等。其中PPARG除与CD56自然杀伤细胞外均呈负相关，而其余枢纽基因则呈正相关。

图5.

枢纽基因与免疫检查点基因及免疫细胞的关系

Fig.5 Relationship between pivot genes, immune checkpoint genes and immune cells. A: Pearson correlation analysis of the correlations of the hub gene with immune checkpoint gene in UC and control groups. B: CIBERSORT algorithm for assessing the correlation between the key genes and 28 immune cell types in UC and control group. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

2.5. 枢纽基因在训练集中诊断UC的性能

图6显示了训练集中10个与铁死亡相关的枢纽基因在UC诊断中的价值。除PPARG外，其余9个枢纽基因在UC中较对照组水平均升高（图6A），其中P4HB、PPARG、STAT3 ROC曲线下面积均为1，HIF-1A、IL6、ZFP36、ROC曲线下面积均为0.999，筛选得到的枢纽基因具有较好的稳健性（图6B）。

图6.

UC训练集中10个枢纽基因诊断价值

Fig.6 Analysis of the diagnostic values of the hub genes for UC using the training set. A: Expression differences of 10 hub genes between UC group and control group. ****P<0.0001, Control group vs UC group. B: ROC curves of the 10 hub genes for UC diagnosis.

2.6. 枢纽基因在验证集中诊断UC的性能

除PPARG外，其余9个枢纽基因在UC中较对照组表达水平均升高，PPARG、P4H8、HIF-1A、IL6、STAT3、ZFP36、CYBB和ACSL1有显著差异，P4HB、HIF-1A、IL6 P值均小于0.0001（图7A）。PPARG、P4HB、HIF-1A在UC诊断中ROC曲线下面积分别为0.994、0.943、0.904，可信度较好（图7B）。

图7.

验证集中10个枢纽基因预测UC价值

Fig.7 Verification of the value of the 10 hub genes for predicting UC. A: Differences in the expression of 10 hub genes between UC group and control group. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001 (Control group vs UC group). B: ROC curve of the 10 hub genes for predicting UC.

2.7. 小鼠UC模型中枢纽基因表达情况

与对照组相比UC模型组疾病活动指数（DAI）显著升高（P<0.01），在第7天差异最大（图8A）。HE染色显示对照组肠道结构完整，隐窝排列有序，上皮细胞和杯状细胞排列清晰，无明显充血、水肿和炎性细胞浸润；模型组则表现为隐窝缺失，结肠上皮细胞和杯状细胞减少，大量炎性细胞浸润（图8B）。RT-PCR结果显示与正常对照组相比，UC模型组PPARG表达减少，P4HB、HIF-1A、IL6、STAT3、ACSL1表达升高（P<0.001），ZFP36在两组中表达的差异无统计学意义（图8C）。

图8.

对照组UC模型小鼠模型结肠枢纽基因表达情况

Fig.8 Hub gene expressions in the colon tissues of the UC mouse model. A: Comparison of disease activity index (DAI) between control and UC mice. B: HE staining of the colon tissue in control and UC mice (Scale bar=50 μm). C: Comparison of the expression levels of the 10 hub genes in the colon tissues between control and UC mice. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs NC group.

对小鼠体内铁死亡相关基因表达和小鼠组织炎症评分的相关性分析，并绘制相关性分析图如下，可见PPARG表达和组织炎症评分呈负相关，P4HB、HIF-1A、IL6、STAT3、ACSL1、ZFP36、CYBB、SCD、PARP14表达和组织炎症评分均呈负相关，其中P4HB、HIF-1A、IL6、STAT3、ACSL1、SCD相关系数R²均大于0.7（图9）。

图9.

小鼠结肠铁死亡相关基因表达和组织炎症评分的相关性分析

Fig.9 Correlation analysis of colonic ferroptosis-related gene expression andtissue inflammation score in mice.

3. 讨论

UC是一种难以治愈的的慢性疾病，近年来，越来越多的研究表明铁死亡在UC中具有重要作用。本研究利用基于铁死亡的生物信息学方法，将基因表达数据与铁死亡分析相结合，筛选UC中的枢纽基因和关键通路。最终发现P4HB、PPARG、STAT3在UC中预测价值最佳。

UC的发生受多种因素的影响，包括肠道炎症反应、肠道屏障功能、肠道菌群及遗传易感性。PPARG是过氧化物酶体增殖物激活受体， 属于类固醇受体超家族核PPAR受体的亚型之一，同时也是治疗UC的一个新兴实验靶点。PPARG在胃肠道中包括肠系膜脂肪细胞、巨噬细胞和上皮细胞等个部位分布，尤其是在上皮细胞的较分化层中PPARG的mRNA水平明显高于其他组织^［16-19］。研究发现，PPARG能抑制多条促炎信号通路如NF-κB和MAPK，下调IL-6、IL-8和趋化因子表达，上调 IL-2、IL-4等抗炎因子的产生，抑制中性粒细胞向炎症部位的浸润，减轻肠道损伤负向调控UC炎症反应，通过COX-2的产物发挥抗炎作用^［20-26］。在我们的研究中同样得到了验证，UC小鼠模型肠道RT-PCR中PPARG表达显著减少，提示UC中疾病活动度与PPARG的转录活性降低相关，并且PPARG在UC诊断中ROC曲线下面积分别为0.994，可信度较好，或可作为预测的靶点脯氨酰4-羟化酶β亚基（P4HB）是一种与内质网应激密切相关的蛋白，当内质网出现未折叠蛋白应答反应时，P4HB的表达量会上调并且聚集在内质网中^{［27， 28］}。P4HB被认为是铁死亡的抑制因子。目前，关于P4HB与UC之间的关系仍待进一步研究。在UC小鼠模型肠道RT-PCR中，UC组P4HB表达增加，提示DSS诱导的小鼠结肠炎炎症反应与P4HB的转录活性增高相关。

STAT3是一种关键的转录因子，参与调控细胞增殖、存活、免疫反应及炎症过程^［29］。STAT3被细胞因子或生长因子激活形成二聚体转入细胞核，调控靶基因表达^［30］。最新研究表明，STAT3通过调控铁死亡的核心因子，影响细胞铁死亡发生^{［31， 32］}。研究发现UC中，STAT3介导的炎症通路降低GPX4活性，诱发肠上皮细胞铁死亡^［33］。在我们的动物实验中，利用RT-PCR同样发现UC模型肠道STAT3表达增加，与既往研究结果相符。

在临床实践中，UC的诊断和治疗通常基于患者的临床表现和内镜检查结果。然而，由于UC个体差异性，传统方法在预测疾病发展和治疗反应性方面存在一定局限性。通过分析铁死亡相关基因的表达模式，可以识别与特定疾病亚型或治疗反应相关的基因标志物。我们的研究结果表明在这些基因标志物如PPARG、P4HB、STAT3仅能够帮助早期诊断，还可以用于预测疾病复发风险和治疗效果。针对铁死亡相关基因表达异常的患者，可以考虑采用针对性的抗氧化治疗或铁调节剂，从而实现精准的治疗。

本研究虽提供了一定理论基础，但也存在局限性。利用公共数据库的回顾性数据对进行分析验证，仍需更多前瞻性临床数据验证其实际应用价值。尽管铁死亡相关基因在UC中的研究取得了初步进展，但要将这些研究成果转化为实际的临床应用，仍面临挑战。首先，需要标准化铁死亡相关基因的检测方法，以确保在不同实验室和临床环境中的一致性和准确性。其次，需要进一步研究这些基因在不同种族和人群中的表达差异，确保基因标志物的普适性。此外，如何整合多种生物标志物，包括基因表达、蛋白质水平和代谢物分析，形成全面的诊断和预测模型，也是一个亟待解决的问题。尽管如此，随着生物信息学技术的发展和基因组学研究的深入，铁死亡相关基因在UC患者中的诊断和预测价值有望得到更广泛的认可和应用。

通过对铁死亡相关基因在UC中的作用机制、个体化医疗应用、临床应用挑战与前景以及跨学科合作的深入讨论，我们可以进一步认识到这些基因在UC中的潜在价值。未来的研究有望在进一步推动这一领域的同时为UC患者带来更精准的诊断和个性化治疗方案。

基金资助

国家自然科学青年基金（82500630，82300032）；广东省基础与应用基础研究基金省市联合基金（2023A1515110161）；广州市科学技术局基础研究计划基础与应用基础研究专题项目（2024A04J3537）；广州市科技局基础研究计划市校（院）联合资助“登峰医院”项目（2024A03J1145）；广州医科大学科研能力提升提升计划

Supported by Youth Program of National Natural Science Foundation of China (82500630, 82300032).