新型BRD4/HDAC双靶点小分子抑制剂的设计、合成及其在前列腺癌中的药效评价

Abstract

Objective

To design a novel bromodomain-containing protein 4 (BRD4) and histone deacetylase (HDAC) dual-target inhibitor (11b), and to elucidate its therapeutic efficacy and mechanisms in suppressing prostate cancer through epigenetic regulation.

Methods

BRD4 and HDAC expression levels were assessed via immunohistochemistry (IHC) using prostate cancer tissue microarrays. The inhibitory activity of 11b was screened across three prostate cancer cell lines, with the half-maximal inhibitory concentration (IC₅₀) determined by CCK-8 assay. Western blot was employed to analyze changes in the expression of target proteins, including BRD4, c-Myc proto-oncogene protein (c-Myc), and Ac-H3K27, with parallel comparisons to single-target agents, including suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA), a HDAC inhibitor, and JQ-1, a BRD4 inhibitor. Cell invasion and proliferation were evaluated using Transwell and colony formation assays, and the autophagy mechanism was validated using 3-methyladenine (3-MA), an autophagy inhibitor. A PC-3 xenograft model was established in nude mice. Then, 11b (7.5 mg/kg or 15 mg/kg), normal saline, SAHA, and JQ-1 were administered via intraperitoneal injection, and their tumor growth inhibition effects were observed. The percentage of target protein-positive cells and the expression levels of target genes were quantified via IHC and RT-PCR, respectively.

Results

BRD4 and HDAC expression levels were both higher in tumor tissues than those in normal tissues (P < 0.01). 11b exhibited the strongest inhibitory activity against PC-3 cells (IC₅₀ = 8.28 μmol/L), outperforming SAHA (22.61 μmol/L) and JQ-1 (22.09 μmol/L). Treatment with 11b reduced BRD4 and c-Myc expression by (41.58 ± 3.28)% and (63.21 ± 6.91)%, respectively (P < 0.01), and increased the Ac-H3K27 level to 6.52-fold that of the negative control (NC) group (P < 0.01), demonstrating greater modulation than either SAHA or JQ-1 did. The in vitro experiment showed that 8 μmol/L 11b treatment reduced PC-3 colony formation and migration by 97.5% and 96.3%, respectively (P < 0.001), and co-treatment with 3-MA reversed its cytotoxic effects. The in vivo experiment showed that 11b at both 7.5 mg/kg and 15 mg/kg significantly reduced tumor volume and weight compared with the control, SAHA, and JQ-1 groups (all P < 0.01), with the proportion of percentage of target protein-positive cells and the expression of target genes showing trends consistent with in vitro findings.

Conclusion

The dual-target inhibitor 11b exerts potent antitumor effects in prostate cancer by synergistically modulating the BRD4/HDAC pathways. 11b demonstrates therapeutic efficacy superior to that of the single-target agents SAHA and JQ-1 in suppressing prostate cancer progression, highlighting its potential for clinical translation.

前列腺癌在男性恶性肿瘤中具有显著的疾病负担，2024年美国预测新发病例数位居男性恶性肿瘤首位，预测死亡率位列第二位^[1]。我国前列腺癌发病率近十年以年均10%的增速上升，2022年已位列男性恶性肿瘤第六位，且呈现与城市化进程、人口老龄化及筛查普及显著相关的区域分布特征^[2-3]。尽管手术、放疗及激素治疗等传统手段可改善早期患者预后，但晚期患者普遍面临耐药与复发难题，尤其是去势抵抗性前列腺癌（CRPC）的治疗仍缺乏有效策略^[4-5]。

表观遗传调控机制为前列腺癌治疗提供了新方向^[6]。BRD4和HDAC溴结构域蛋白4（bromodomain-containing protein 4, BRD4）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase, HDAC）作为关键表观遗传调控因子，通过协同作用驱动肿瘤进展：BRD4通过识别乙酰化组蛋白促进Myc原癌基因蛋白（Myc proto-oncogene protein, c-Myc）在转录水平活跃，其在前列腺癌中的异常高表达与侵袭性和不良预后显著相关；HDAC则通过去乙酰化作用抑制抑癌基因表达，其抑制剂SAHA虽具有抗肿瘤活性，但单药疗效有限且易引发耐药^[7]。研究表明，BRD4与HDAC通路存在交叉调控，双重抑制可协同阻断染色质开放与转录激活，打破表观遗传代偿网络。临床前研究亦发现，BRD4/HDAC双靶点协同抑制不仅能有效克服单药耐药，还可通过诱导自噬程序性死亡增强肿瘤细胞清除效应^[8-9]。

本研究基于上述协同调控策略，设计并合成了一种针对BRD4和HDAC双靶点的小分子抑制剂11b。该化合物的化学结构基于两者活性位点特征，通过计算机辅助药物设计（CADD）方法，包括分子对接（molecular docking）和分子动力学模拟（molecular dynamics simulation），优化靶点结合能力并确保成药性。我们通过体外细胞实验及体内移植瘤模型系统评价了其抗前列腺癌活性。

1. 材料和方法

1.1. 主要材料和仪器

本研究所用双靶点抑制剂11b由课题组独立设计合成，HDAC的单靶点抑制剂Vorinostat（SAHA）购自Sigma-Aldrich公司，BRD4的单靶点抑制剂JQ-1购自MedChemExpress公司^[10-11]。人前列腺癌细胞株LNCaP、22Rv1、PC-3及正常前列腺上皮细胞BPH-1均购自中国科学院细胞库。主要试剂包括RPMI-1640培养基、胎牛血清（Gibco）、CCK-8检测试剂盒（森贝伽）、3-MA（MCE）、Matrigel基质胶（BD Biosciences）、TRIzol试剂（Thermo Fisher）和 PrimeScript^TM RT试剂盒（Thermo Fisher）；抗体包括 BRD4、c-Myc、Ac-H3K27及GAPDH（Affinity Biosciences）。主要实验仪器包括倒置显微镜（Olympus）、酶标仪（Bio-Rad）、荧光定量PCR 仪（Bio-Rad）、凝胶成像系统（Bio-Rad）和石蜡切片机（Leica RM2235）。

1.2. 体外实验

1.2.1. 前列腺癌组织芯片分析

采用56例人前列腺癌商用组织芯片（HProA180PG03，芯超生物公司）进行IHC染色，每例含肿瘤及配对正常组织，检测BRD4和HDAC的表达水平。使用ImageJ软件对染色切片进行定量分析，计算染色阳性细胞百分比，并比较肿瘤组织与正常组织的表达差异。此商用微组织芯片，信息在购买时已被盲法处理，亦无需伦理审批。

1.2.2. 细胞培养与半抑制浓度（IC₅₀）测定

LNCaP、22Rv1和PC-3人前列腺癌细胞株以及BPH-1正常前列腺上皮细胞均在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基中培养，置于体积分数为5%CO₂、37°C恒温培养箱中维持细胞生长。采用CCK-8（细胞计数试剂盒）法测定11b对三种细胞的细胞毒性，计算IC₅₀值，并筛选对11b最敏感的细胞株。同时，以BPH-1细胞作为正常对照，评估11b对正常细胞的毒性作用，初步验证其肿瘤选择性。进一步进行单靶点抑制剂（HDAC抑制剂SAHA和BRD4抑制剂JQ-1）与双靶点抑制剂（11b）的优效性比较，评估其抗肿瘤活性优势。

1.2.3. Western blot分析

选取对11b最敏感的细胞株（PC-3细胞），并给予4 μmol/L、8 μmol/L浓度的11b或8 μmol/L的SAHA、JQ-1的完全培养基处理24 h，对照组（NC）采用完全培养基同步处理24 h。提取总蛋白，采用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，并通过Western blot免疫印迹法检测BRD4、c-Myc和Ac-H3K27的表达水平。使用GAPDH作为内参，图像分析采用ImageJ软件进行灰度值定量。以目的条带灰度值与内参条带灰度值的比值为目的蛋白的相对表达量。

1.2.4. 自噬途径测定

采用500 μmol/L 3-MA（3-甲基腺嘌呤）预处理PC-3细胞，对照组采用PBS处理，采用8 μmol/L浓度的11b抑制剂处理实验组和对照组PC-3细胞，通过CCK-8法进行细胞活力检测，对比实验组与对照组的细胞活力，评估3-MA对11b的抗前列腺癌药效影响。

1.2.5. 克隆形成实验

将PC-3细胞接种至6孔板（每孔500细胞），在含5%FBS生长培养基中培养14 d，其间每3 d更换培养基。最后一次更换培养基时，随机给予4孔以4 μmol/L、8 μmol/L浓度的11b处理后，用结晶紫染色细胞克隆，拍摄图像并对比克隆数，以评估细胞长期增殖能力。

1.2.6. Transwell实验

PC-3细胞无血清饥饿处理6 h后，重悬细胞于4 μmol/L、8 μmol/L浓度的11b无血清培养基中加入Transwell上室，下室加入含10%FBS完全培养基进行迁移实验，24 h后，固定并染色穿过聚碳酸酯膜的细胞（结晶紫染色）。在光学显微镜下拍摄至少5个随机视野，计算迁移细胞数。

1.3. 体内实验

1.3.1. 动物模型建立

选取SPF级雄性BALB/c-nu裸鼠（5～6周龄，体质量18～22 g），购自江苏集萃药康生物公司，许可证号：SYXK（川）2021-248，饲养于SPF级环境中，自由摄食饮水，适应环境1周后用于实验。适应期内监测健康状态，符合纳入标准（健康、无皮肤病变、无可见外伤），排除标准包括体质量减轻>10%、出现感染或肿瘤未形成等情况。取指数生长期PC-3细胞，用无血清培养基重悬后，在裸鼠右侧腋窝皮下接种4×10⁶细胞（Matrigel 1∶1包被），建立前列腺癌异种移植模型。本动物实验获得四川大学华西医院动物实验伦理委员会IACUC批准（编号20220609001）。

1.3.2. 分组与给药

接种肿瘤细胞后第3天起每日监测瘤体生长情况，当肿瘤体积增长至约50 mm³时（约为接种后第7～9天），采用计算机生成的随机数字表法进行随机分组（每组5只），进行每3 d一次的腹腔注射，并确保分组时操作者不参与后续数据测量以减少偏倚：（1）生理盐水对照组，（2）JQ-1组（15 mg/kg），（3）SAHA组（15 mg/kg），（4）0.5 IC₅₀ 11b组（7.5 mg/kg），（5）1 IC₅₀ 11b组（15 mg/kg）。在27 d给药期间，监测动物体质量、饮食行为和毛发状态等一般情况。

1.3.3. 肿瘤体积与质量测定

由未参与给药的实验人员在盲法条件下，自肿瘤种植后第一天起，每3 d使用游标卡尺测量肿瘤体积（mm³），计算公式：肿瘤体积=0.5×(长度×宽度²)。28 d后，过量麻醉（苯巴比妥那）安乐死小鼠，剥离肿瘤组织并称重。

1.3.4. 免疫组织化学分析

取小鼠肿瘤组织固定于质量分数4%的多聚甲醛，石蜡包埋并切片。采用对应抗体进行IHC染色，检测肿瘤组织中BRD4、Ac-H3、c-Myc的表达，其中一抗工作浓度分别为1∶50（BRD4）、1∶100（Ac-H3）和1∶100（c-Myc）。以DAB显色，苏木精复染。阳性细胞的判定标准为胞核或胞质出现棕黄色颗粒即视为阳性。选取5个随机视野，使用ImageJ软件计算阳性细胞比例。

1.3.5. qRT-PCR分析

取肿瘤组织经TRIzol法提取总RNA，经Nanodrop及Agilent 2100进行质量验证后，使用PrimeScript^TM RT试剂盒进行逆转录合成cDNA。实时定量PCR采用SYBR® Premix Ex Taq^TM Ⅱ体系，PCR程序设置95 ℃预变性及40个扩增循环，最终通过2^－ΔΔCt法计算BRD4、c-Myc和Ac-H3K27的mRNA相对表达量，以GAPDH作为内参基因进行标准化，相关引物序列见附表1。所有附图和附表见网络资源附件。

1.4. 统计学方法

使用GraphPad Prism 9.0进行数据分析，统计数据以表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）或t检验统计方法，并在涉及多重比较时采用Bonferroni校正，P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. BRD4/HDAC双靶点小分子抑制剂11b的结构表征

见图1。化合物11b是一种针对BRD4和HDAC双靶点设计的小分子抑制剂（化学式：C₂₀H₂₄N₈O₃，相对分子质量：424.1971 g/mol，表征数据见附表2），其化学结构基于BRD4和HDAC的活性位点特征，主要由以下3个部分构成：（1）BRD4抑制剂的药效团（Cap部分）：用于BRD4蛋白结合口袋的占位结合；（2）连接碳链（Linker部分）：用于连接两靶点药效团；（3）HDAC抑制剂的药效团（ZBG部分）：锌结合基团，用于HDAC蛋白家族结合口袋的占位结合。

图 1.

The chemical structures of Compound 11b (A), SAHA (B), and JQ-1 (C)

化合物11b （A）、SAHA（B）和JQ-1（C）的化学结构

2.2. 体外实验

2.2.1. 前列腺癌组织芯片分析

见图2。IHC染色结果显示，BRD4和HDAC在前列腺癌组织中的表达水平高于邻近正常组织。定量分析结果表明（图2B），肿瘤组织中BRD4阳性细胞比例为（63.1± 25.1）%，而正常组织中仅为（26.9±14.7）%（P<0.01）；HDAC阳性细胞比例在肿瘤组织中为（44.0±22.6）%，而在正常组织中为（25.4±17.9）%（P<0.001）。进一步分析发现，BRD4和HDAC的强阳性染色例数在高分级（Gleason score≥8）患者中升高（P<0.01）（图2C），提示其表达水平与前列腺癌病理分级密切相关，可能参与肿瘤进展过程。

图 2.

Expression of HDAC and BRD4 are significantly upregulated in 56 PCa clinical samples (tumor tissues and matching adjacent normal tissues)

56例前列腺癌临床样本（每例含肿瘤及配对正常组织）中HDAC和BRD4蛋白的表达

A, Representative IHC staining of HDAC and BRD4 in PCa and adjacent normal tissues（IHC staining × 200). B, HDAC and BRD4 expression are significantly upregulated in PCa tissues. C, Elevated HDAC and BRD4 expression correlate with higher Gleason scores.

2.2.2. 细胞培养与IC₅₀测定

见附图1。CCK-8法测定结果显示，11b对LNCaP、22Rv1和PC-3细胞体外预筛选，LNCaP因在11b处理后存在活力基线偏低，无法获得可信的IC₅₀值，22Rv1和PC-3细胞的IC₅₀值分别为17.34 μmol/L〔95%置信区间（CI）：15.92～18.78 μmol/L〕和8.28 μmol/L（95%CI：7.58～8.80 μmol/L），表明PC-3细胞对11b最为敏感，且11b对其具有明显的剂量和时间依赖性生长抑制效应。进一步测定发现，11b在正常前列腺上皮细胞BPH-1中未观察到明显的增殖抑制效果，各浓度处理下BPH-1细胞活力均无下降，提示11b对正常细胞具有良好的耐受性。进一步比较显示，11b在PC-3细胞中的IC₅₀值低于SAHA（22.61 μmol/L，95%CI：21.58～23.83 μmol/L）和JQ-1（22.09 μmol/L，95%CI：20.46～23.74 μmol/L）（P<0.05，t检验）。

2.2.3. Western blot分析

见图3A～3C。Western blot结果显示，与NC组相比，11b处理后，PC-3细胞中BRD4和c-Myc的表达水平分别降低（41.58±3.28）%和（63.21±6.91）%（P均<0.001），而Ac-H3K27的表达水平升高至（652.38±73.61）%（P<0.01）。此外，高浓度11b处理组（8 μmol/L）对Ac-H3K27蛋白的上调作用更为显著（P < 0.05）。与SAHA和JQ-1相比，11b在相同浓度（8 μmol/L）下对c-Myc的抑制效果更为显著（P<0.05），而对Ac-H3K27的上调作用也更为明显（P<0.05），但对BRD4的抑制作用差异无统计学意义。

图 3.

The expression of BRD4, c-Myc, and Ac-H3K27 and autophagy assay

BRD4, c-Myc, Ac-H3K27蛋白表达水平及自噬测定

A, Expression levels of H3 and Ac-H3K27 proteins relative to GAPDH. B, Expression levels of BRD4 and c-Myc proteins relative to GAPDH. C, Quantitative analysis of Werstern blot for H3, Ac-H3K27, BRD4, and c-Myc (from left to right). D, 3-MA reversed the killing effect of 11b on PC-3 cells. n = 3 per group. ^* P < 0.05, ^** P < 0.01, ^*** P < 0.001, ^**** P < 0.0001.

2.2.4. 自噬测定

见图3D。CCK-8法测定结果显示，500 μmol/L 3-MA单独处理未显著改变PC-3细胞活力，而8 μmol/L 11b单药处理较对照组抑制细胞活力（P<0.0001）；当两者联合干预时，3-MA逆转了11b的细胞毒性效应，联合组细胞活力较11b单药处理组上升（P<0.0001）。

2.2.5. 增殖抑制测定

见附图2A、2B。结晶紫染色结果显示，对照组PC-3细胞具有完整的克隆形成能力，11b处理后PC-3细胞的克隆形成能力降低，未见明显剂量依赖效应。与对照组相比，8 μmol/L 11b组的克隆数减少了（97.45±2.18）%（P<0.0001）；相较于相同浓度的SAHA组〔降幅（64.16±9.12），P<0.01〕和JQ-1组〔降幅（17.04±4.58）%，P<0.0001〕，8 μmol/L 11b组对细胞克隆的抑制作用更为显著。

2.2.6. 迁移抑制测定

见附图2C、2D。Transwell迁移实验结果显示，对照组PC-3细胞具有完整的跨膜迁移能力，11b抑制了PC-3细胞的迁移能力。与对照组相比，8 μmol/L 11b组的迁移细胞百分比减少了（96.32±2.62）%（P<0.001），迁移细胞百分比低于SAHA组〔降幅（50.39±14.62）%，P<0.05〕和JQ-1处理组〔降幅（22.69±10.75）%，P<0.001〕。

2.3. 体内实验

2.3.1. 肿瘤体积与质量测定

见图4A～4C。第27天，PC-3人前列腺癌异种种植裸鼠模型的肿瘤体积测定结果显示，7.5 mg/kg 11b干预组和15 mg/kg 11b干预组小鼠的肿瘤体积与质量低于对照组、SAHA组及JQ-1组（P均<0.01）。7.5 mg/kg和15 mg/kg 11b干预组在肿瘤体积与肿瘤质量两方面的差异均无统计学意义。

图 4.

The in vivo antitumor effect of 11b on PC-3 xenograft tumor model

11b对PC-3异种移植瘤模型的体内抗瘤作用

A, Tumors in nude mouse model; B, curves of tumor volume; C, quantitative analysis of tumor mass; D, curves of nude mouse body mass. n = 5 per group. ^** P < 0.01, vs. control, 15 mg/kg SAHA, and 15 mg/kg JQ-1 groups.

2.3.2. 初步耐受性评估

见图4D。7.5 mg/kg和15 mg/kg 11b干预组干预期间裸鼠体质量变化稳定，与生理盐水组相比无明显差异（P>0.05），提示化合物11b在实验剂量范围内具有较好的初步耐受性。

2.3.3. IHC及qRT-PCR分析

见附图3。动物模型肿瘤组织IHC染色结果显示，与对照组相比，15 mg/kg 11b干预组肿瘤组织中BRD4和c-Myc的阳性细胞百分比相较对照组分别降低（51.46±7.19）%和（47.07±10.04）%（P<0.0001），而Ac-H3K27的阳性细胞百分比升高至（307±51.17）%（P<0.0001）。15 mg/kg 11b干预组中BRD4和c-Myc的阳性细胞百分比与同剂量JQ-1组间的差异无统计学意义，且Ac-H3K27的阳性细胞百分比与同剂量SAHA组间的差异亦无统计学意义。肿瘤组织mRNA的qRT-PCR测定结果与IHC染色结果一致，与对照组相比，15 mg/kg 11b干预组肿瘤组织中BRD4和c-Myc的mRNA相对表达水平降低（P<0.0001），而Ac-H3K27的mRNA相对表达水平升高（P<0.0001），且BRD4与Ac-H3K27的mRNA相对表达水平与对应单药组间的差异无统计学意义。

3. 讨论

前列腺癌作为男性高发恶性肿瘤，其治疗仍面临去势抵抗性转化及多线治疗耐药等核心挑战。欧洲泌尿外科学会（EAU）指南推荐雄激素剥夺疗法联合新型内分泌治疗作为转移性去势敏感性前列腺癌的一线方案，但约30%患者在18～24个月内进展为去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer, CRPC）。对于CRPC患者，紫杉烷类化疗药物虽可延长生存期，但其骨髓抑制及神经毒性显著限制临床应用。近年针对DNA修复缺陷的PARP抑制剂鲁卡帕尼（Rucaparib）虽取得突破，但适用人群受限于特定基因突变，且易导致系统性耐药发生^[12-13]。开发具有广谱抗肿瘤活性且耐受性良好的新型治疗策略是前列腺癌治疗领域亟需解决的问题。

表观遗传异常是驱动前列腺癌进展的关键机制，其中BRD4和HDAC已成为最具潜力的干预靶点之一^[6-7]。BET蛋白家族的BRD4通过识别乙酰化组蛋白调控c-Myc等致癌转录因子表达，而HDAC通过介导组蛋白去乙酰化抑制抑癌基因激活，两者在染色质重塑中形成协同调控网络^{[8, 14]}。临床前研究表明，BRD4抑制剂JQ-1可通过竞争性结合将BET溴结构域蛋白（包括BRD4）从染色质中置换出来，介导BRD4的合成致死途径，并有效下调下游致癌基因c-Myc的表达^[15]；HDAC抑制剂SAHA能够有效结合抑制组蛋白去乙酰化酶，进而在实体瘤中发挥抑癌疗效^[16]。本研究中11b通过同时靶向BRD4和HDAC，在PC-3体内外模型中展现出较传统单靶点药物更强的c-Myc抑制效应（P<0.05）及Ac-H3K27累积（P<0.05），验证了双靶点协同阻断在表观遗传调控中的优势。

单靶点表观遗传药物耐药常源于代偿性信号激活或表型可塑性。研究表明，BRD4抑制可诱导HDAC6表达上调，通过α-微管蛋白去乙酰化促进细胞迁移^[17]；而HDAC抑制会反馈性增强BET蛋白与染色质结合力，诱导治疗耐药发生^[18]。此外，不少研究表明，单靶点药物的联用能通过双重或多重打击致癌途径，有效减少耐药发生的可能性^[19-20]。本研究中，11b通过联合抑制BRD4和HDAC，不仅降低克隆形成率（97.45% vs. 单药64.16%/17.04%），更几乎完全抑制肿瘤细胞迁移（降幅96.32%），提示双靶点阻断可通过双重表观遗传调控机制，同时增强抑制增殖与转移的药效活性。进一步机制研究发现，3-MA（自噬抑制剂）可部分逆转11b的细胞毒性（P<0.0001），表明其抗肿瘤效应涉及自噬通路调控，这为理解双靶点药物的多机制协同提供了新视角^[21]。

目前表观遗传治疗领域已相继涌现出多种靶向BET蛋白与HDAC的双靶点抑制策略。例如，MT-1是一种结构明确的BRD4/HDAC1双重抑制剂，已在白血病模型中表现出较强的抗增殖活性，具有明确的协同抑制机制和表观调控效应^[22]。但其临床转化受限于口服生物利用度低（<15%）、合成难度高等药代缺陷。另一种策略则是基于蛋白降解技术开发的BRD4 PROTAC分子，例如WWL0245，通过靶向招募E3泛素连接酶诱导BRD4蛋白降解，实现对前列腺癌细胞中BRD4的高效下调。该分子由BET/PLK1双靶点抑制剂WNY0824衍生，显示出亚纳摩尔级的降解活性及超过99%的最大降解率，并能有效抑制AR及其下游基因表达，在雄激素受体阳性前列腺癌细胞中展现出显著的抗增殖效应，具有良好的治疗潜力，但其组织渗透性差等药物属性问题显著限制了其在实体瘤中的应用^[23-24]。此外，近期报道的如化合物NB512等BRD4/HDAC双靶点小分子虽具有一定体内活性，但其靶点选择性、药代稳定性及结构可优化空间仍有待进一步提升^[25]。

针对上述问题，本研究通过结构模块化思路设计开发了新型BRD4/HDAC双靶点小分子11b，其采用“Cap-Linker-ZBG”布局策略，在合理控制分子量的同时（424.2 Da），实现了对BRD4和HDAC协同位点的特异性精准结合。动物实验显示，11b在15 mg/kg剂量下即达到87.6%的肿瘤体积抑制率，且未引起明显体质量下降（P > 0.05），显示出良好的体内耐受性与转化前景。与现有代表性双靶点化合物相比，11b具有更优的结构可调性和靶点结合特异性，为后续结合前列腺癌特异性分子（如PSMA等）进行组织靶向递送奠定了结构基础。本研究存在以下局限：首先，体外实验的3种前列腺癌细胞系虽然涵盖了AR阴性、阳性细胞系，以及原发和转移型细胞系，未来仍须在更多细胞系中进行验证以评估11b的广谱抗肿瘤活性；其次，尽管发现自噬通路参与11b作用机制，但具体调控节点（如LC3 Ⅱ或Beclin-1）尚未明确；最后，11b药代动力学及长期毒性评估的缺乏限制了临床前推进。后续研究拟通过单细胞测序解析耐药亚群特征，并探索11b与免疫检查点抑制剂联用的协同效应，为联合治疗方案设计提供依据。

本研究成功设计、合成了BRD4/HDAC双靶点抑制剂11b，其在体内外实验中显现出对靶标及下游蛋白表达的有效调控，并得益于双靶点抑制分子结构和作用机制，体现出优于单靶点药物SAHA、JQ-1的体内外抗肿瘤药效，化合物11b是PCa靶向治疗的潜在先导小分子抑制剂。未来将进一步在多种前列腺癌细胞系及临床相关动物模型中验证其广谱抗肿瘤活性，深入解析其在自噬通路等分子机制中的关键调控环节，并开展药代动力学、长期毒性及组织特异性递送等临床前研究，以推动其向临床应用转化。

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作者贡献声明　冯树杨负责论文构思、研究方法、研究项目管理和初稿写作，邵彦翔负责数据审编和正式分析，吴侃负责研究方法和可视化，杨为潇负责提供资源和软件，李响负责论文构思、经费获取、研究项目管理、监督指导和审读与编辑写作。所有作者已经同意将文章提交给本刊，且对将要发表的版本进行最终定稿，并同意对工作的所有方面负责。

Author Contribution　FENG Shuyang is responsible for conceptualization, methodology, project administration, and writing--original draft. SHAO Yanxiang is responsible for data curation and formal analysis. WU Kan is responsible for methodology and visualization. YANG Weixiao is responsible for resources and software. LI Xiang is responsible for conceptualization, funding acquisition, project administration, supervision, and writing--review and editing. All authors consented to the submission of the article to the Journal. All authors approved the final version to be published and agreed to take responsibility for all aspects of the work.

利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

Declaration of Conflicting Interests　All authors declare no competing interests.

Funding Statement

国家自然科学基金（No. 81672552）资助