人工血管钙化机制及抗钙化策略研究进展

Abstract

Artificial blood vessels are commonly applied in the treatment and reconstruction surgeries of cardiovascular diseases, which have a considerable clinical demand. Using a 6 mm diameter as a threshold, they are categorized into large- and small-diameter types. Calcification is one of the factors affecting whether artificial blood vessels can successfully be transplanted and function. The occurrence of calcification after implantation may lead to graft failure, particularly compromising the long-term patency of small-diameter grafts. Therefore, focusing on the research of calcification mechanisms and anti-calcification strategies for artificial blood vessels is of great importance. In this paper, we summarized the possible calcification mechanisms of artificial vessels and methods to prevent or delay post-implantation calcification, with the aim of providing insights for future research on anti-calcification artificial vessels.

0. 引言

近年来，心血管疾病的发病率和死亡率不断增高，已成为威胁人类健康和导致死亡的主要原因之一^[1]。其发病机制主要涉及动脉粥样硬化、内皮功能障碍、炎症反应、血栓形成等，目前常用的干预方法包括药物溶栓、支架介入、血管移植等。尽管在药物治疗和微创手术方面已取得了长足的进展，但血管移植仍是治疗心血管疾病的有效策略，对于部分患者甚至是唯一的治疗手段。然而，自体血管来源有限，因此临床上对人工血管有着较大的需求量。

人工血管是指利用人工材料或生物工程技术制造的血管替代物，用于修复或替换病变、狭窄或闭塞的天然血管，以恢复血流功能。理想的人工血管应具有良好的生物相容性、抗血栓形成能力和机械特性，并兼顾快速内皮化及与宿主血管相匹配的性能。先前的人工血管研究大多侧重于改善血管材料的顺应性、改善抗凝效果以及使血管材料更快内皮化，而对人工血管植入后的钙化却少有研究。

钙化是人工血管植入后面临的主要问题之一。该过程不利于血管的收缩和舒张，可诱发人工血管形成栓塞，促使血管通路逐渐钙化，增大移植失败的风险。目前，根据直径不同，人工血管主要分为大口径（> 6 mm）与小口径（< 6 mm）两类。对于前者，已有使用膨体聚四氟乙烯（expended polytetrafluoroethylene，ePTFE）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene glycol terephthalate，PET）、聚氨酯（polyurethane，PU）等材料制备的多项产品完成临床转化，而后者却仅有一款组织工程血管迈入临床。造成小口径人工血管研发进程缓慢的原因主要包括植入后内膜增生、血栓形成、炎症反应、钙化、弹性蛋白变性等。其中，钙化问题在制约小口径人工血管临床应用中起重要作用，却长期未受到足够重视。小口径人工血管因血流动力学环境较为复杂，易出现钙化现象。而对于大口径人工血管，由于口径较大，腔内血流速度较快，理论上发生钙化的概率相对较小；但口径之外，不同材料特性的限制以及植入后可能发生的炎症反应仍可能导致钙化发生。因此，关注人工血管是否具有出色的抗钙化性能，是决定其能否实现长期移植的重要因素之一。

近些年，人工血管的抗钙化研究逐渐走入研究者的视野。国内外学者从不同方面对人工血管的钙化机制进行了探究，并根据不同机制提出针对性的抗钙化策略及具有应用潜力和可行性的抗钙化方法。本篇综述将对近年来人工血管的钙化机制研究及抗钙化策略作一总结，同时对抗钙化移植物的研发方向进行展望。

1. 人工血管钙化机制

1.1. 动物源人工血管钙化机制

动物源人工血管主要包括脱细胞基质（decellularized extracellular matrix，dECM）移植物、同种异体来源人工血管等。来源于生物体的天然材料具有易于获得、组织相容性较好等优点。自体来源的人工血管移植物更被称为治疗血管闭塞的“金标准”移植物^[2]。但因动物源材料机械性能较差，在实际应用中需通过交联其他材料进行改善。戊二醛（glutaraldehyde，GA）作为经典的交联剂，常应用于心血管医用材料或医疗器械的制备。但经GA交联的材料寿命有限，植入体内后常发生钙化，这也成为限制动物源生物材料应用的原因之一。

Schoen等^[3]提出，在交联过程中，GA会对生物组织材料中的富磷钙化结构产生稳定和修饰作用；植入体内后，当细胞外液处于相对高钙水平时，这些位点会发生钙化。具体机制为：GA处理后，血管上的部分可溶性蛋白丢失，增加胶原上磷酸键的暴露程度。这些暴露在外的钙离子结合位点为离子沉积提供了空间，并与细胞外液中的钙结合形成磷酸盐沉淀，加速钙化进程^[4]。

除了直观上引起钙结合位点增多，GA的细胞毒作用也是诱发钙化的原因。这种作用源于材料上的游离GA。残留的醛基不仅会影响内皮细胞（endothelial cells，ECs）生长，还可与钙离子结合，影响移植物的再生和重塑效果^[5]。然而，与多数研究结果相矛盾的是，有研究^[6]发现，在一定范围内升高GA浓度未增加钙化，而且还增加了移植物的机械性能，为高强度接枝提供了一种潜在的实验方法，但具体机制还有待探索。

1.2. 天然高分子材料人工血管钙化机制

天然高分子人工血管材料主要包括胶原蛋白、丝素蛋白、明胶、壳聚糖、海藻酸钠等，具有低毒、亲水、可促进细胞黏附增殖等优势，植入后的免疫排斥反应程度较轻。但与合成高分子材料相比，力学性能和稳定性较差，易于降解，需经一定技术处理或结合其他材料进行应用。有关天然高分子血管材料直接引发钙化的相关研究较少，大多天然高分子材料通过与合成高分子材料联用以达到改善机械强度、优化生物性能的目的。

天然高分子材料如胶原蛋白和弹性蛋白可作为磷酸钙的成核位点^[7-8]。矿物可沉积在血管壁的不同部位：内膜钙化由胶原纤维上发生矿物质沉积引发，而中膜钙化则以弹性蛋白作为主要的矿物成核位点。明胶是胶原蛋白的变性产物，具有出色的可降解性和生物相容性。Meng等^[9]在骨组织工程研究中提出，明胶分子中的羧基通过吸引和富集溶液中的钙离子，可加速磷灰石晶体的成核和生长。该项研究提到明胶可作为磷酸钙形成的成核中心，但在人工血管领域由明胶引起钙化的机制少有文献记载。

1.3. 合成高分子材料人工血管钙化机制

常用的合成高分子材料包括PET、ePTFE、PU、聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）、聚己内酯（polycaprolactone，PCL）、聚L-丙交酯-己内酯（poly (L-lactide-co-ε-caprolactone)，PLCL）等。特别是前三种材料，在大口径人工血管的制备中已得到普遍应用^[10]，但用于小口径人工血管的效果一直不甚理想，常因发生血栓、内膜增生、钙化现象而导致长期通畅率低。

PET和ePTFE常被加工作为补片和血管移植物，在心血管手术及术后修复领域发挥重要作用，但即使拥有较好的生物相容性，作为移植物植入后仍存在较高的钙化发生率。其中，沉积在移植物间隙中的钙消除了PTFE的多孔结构，使合成的血管壁硬化，可能导致移植物破裂，还会带来血流动力学模式的改变和内皮功能障碍的加剧，引起血栓形成和顺应性降低，最终导致移植失败。ePTFE具有良好的疏水性和化学惰性，然而与血液接触后，可能发生血小板黏附和血浆蛋白吸附过程，继而触发凝血级联反应，导致血栓形成。其次，归咎于较低的顺应性，ECs在ePTFE移植物表面也较难生长，阻碍材料表面内皮化进程^[11-12]，影响内皮衬里这种天然抗血栓形成屏障发挥作用。移植物与组织间的相互作用随着植入时间不同而改变。起初，PET移植物表面渗透了含有血小板抗原的血栓，使得部分组织启动经肉芽转化为纤维组织的转变过程。新形成的组织包含异物巨细胞，并表现出血浆蛋白渗透。随着植入时间增长，该种组织不再包含血小板抗原，但仍能识别出含有脂蛋白和纤维蛋白原相关抗原的载脂蛋白B。在植入时间更长的移植物中，表现为更大面积的钙化沉积以及脂质与脂蛋白的严重浸润^[13]。Yamamoto等^[14]对钙化的ePTFE带瓣管道进行了组织病理学分析，观察到植入材料出现蛋白质浸润以及巨噬细胞和异物巨细胞的集聚现象。综上，对于ePTFE移植物，其具有的非生物降解性或将导致慢性异物反应持续存在，同时，吻合口和组织的接触仍是狭窄和潜在钙化的诱因之一^[15]。可以推测，蛋白质浸润和材料异物反应的发生可能是导致管道钙化和狭窄的部分原因。

PCL和PLCL因其良好的机械强度和性能的可调控性为研究者所青睐。与其他常见聚合物人工血管相似，PCL在长期植入后产生的内膜增生和钙化可能源于长期而持久的炎症反应^[16]。此外，钙化还可能归因于移植物顺应性降低，以及电纺PCL移植物降解缓慢，使得具有血管活性的动脉壁无法再生。另一项研究观察到，植入18个月后，钙化出现在以PLCL为内层的双层移植物与新生内膜的交界处。这揭示了合成移植物钙化的又一可能原因：PLCL分子结构中含有更多酯基，在加快降解速率的同时，降解产物中增多的羧酸根自由基促进了血液中钙离子的扩散与积累，加速了降解部位的钙化^[17]。

PTFE在生物材料领域占据重要地位。尽管已得到广泛临床应用，但在一些血管移植的临床不良事件监测中，仍观察到PTFE移植物引起吻合口新生内膜增生和急性血栓形成。其原因可能是ECs、平滑肌细胞和血小板与材料的相互作用。Lamichhane等^[18]研究指出，ECs和平滑肌细胞与血小板间的响应很大程度上依赖于PTFE的表面形貌。先前已证实材料的表面形貌与巨噬细胞的行为和异物反应的程度有关，而Lamichhane团队的研究同样表明电纺PTFE移植物的随机取向微纤维可减少巨噬细胞的黏附激活以及异物巨细胞的形成。综上，材料的表面形貌是影响细胞反应的重要因素之一，可通过影响免疫反应和细胞行为间接影响血管的长期通畅。

人工血管钙化的形成原因较为复杂，迄今为止，合成高分子材料制备的人工血管钙化机制仍不完全明朗。早期研究认为钙化是体内矿物沉积的被动过程。近些年的研究证明，血管钙化是与骨发育相似的、主动的、高度可调控的复杂病理过程，多发生在血管壁的两个不同部位——内膜和中膜，包括基质重塑、内质网应激、细胞凋亡、炎症和活性氧（reactive oxygen species，ROS）在内的多种刺激因素均可影响该过程^[19]。一些研究者提出，移植物发生的钙化与动脉粥样硬化中的血管钙化进程具有相似之处，与生物材料特性引发的异物反应有关。前者主要通过氧化的低密度脂蛋白促进巨噬细胞向促炎表型转化，加速炎症反应，并通过巨噬细胞产生骨桥蛋白和骨连接蛋白等钙结合蛋白，分泌胞外囊泡而间接诱导钙化^[15]。后者则由于移植物植入后被机体识别为异物，募集炎症细胞释放细胞因子等，同时创造间充质干细胞成骨分化的微环境，产生骨基质蛋白，进而促使羟基磷灰石成核位点的增多及磷酸钙晶体沉积^[15]。

综上所述，影响合成高分子材料钙化与否的重要因素是材料的特性和生物相容性，它们会影响人工血管植入后在体内发生的细胞活动，协同多种因素共同干预钙化进程。例如材料的降解率、孔隙率可介导巨噬细胞浸润和之后的炎症反应，材料表面的润湿性可调控血小板和血细胞黏附。因此，针对合成高分子材料血管移植物的抗钙化改性需经过多重考量，基于不同应用场景和病理状态具体分析。

2. 预防及延缓人工血管钙化的措施

在实践中，为了提升人工血管的通畅率，会结合不同材料的特性针对性地进行优化。目前，以优化交联方法、血管表面改性、探索新型材料为代表的措施最为常见。

2.1. 优化交联方法

GA是以dECM为代表的天然来源人工血管最主要的钙化引发因素，目前通用的抗钙化策略基本围绕GA交联进行改进，主要包括优化或替代传统固定方法及针对材料进行表面改性。

Wang等^[20]研究发现，铁离子-单宁酸共处理可显著提升牛颈静脉抗钙化能力，并赋予其良好的生物力学性能。Liu等^[21]将己二酸二酰肼用于中和GA交联后的残余醛基以及结合寡聚透明质酸，取得了降低钙化以及提升内皮化性能的双重效果。Wang等^[22]分别使用GA、京尼平、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺联用等方法对脱细胞小口径血管进行交联，移植物展现出的长期通畅率和优异的生物相容性证明了京尼平交联法的可行性。Jiang等^[23]将I-谷胱甘肽与GA联用，使钙化水平降低80%，有望拓展这种新型抗钙化剂的应用领域。

还有一些研究对人工血管进行表面改性修饰。一些观点认为，导致组织钙化的退行性过程可能始于生物假体上存在的异种抗原所触发的炎症反应^[24]。鉴于多酚类物质的强大抗炎能力以及掩盖异种抗原的能力，它们可能在交联胶原蛋白和弹性蛋白时表现出一定的抗钙化潜力。Wang等^[25]使用柯里拉京以替代先前的交联方法，成功制备了具有抗钙化功能和炎症抑制作用的血管材料。Hu等^[26]使用姜黄素与黄原胶作为瓣膜材料的交联试剂，展现出优于GA交联的钙化抑制能力。而在体外钙化抑制试验中，槲皮素同样显示了对动物源瓣膜材料矿物质沉积的抑制作用^[27]。Melder等^[28]使用混合多酚溶液对动物源瓣膜进行处理，结果表明，与空白样品相比，经多酚处理后钙化抑制率高达99.4%。Melder等的实验进一步证实，多酚类物质对心血管材料的保护性作用可能是几种效应的协同，能够抑制包括钙化在内的多种退行性机制。

2.2. 对血管材料进行改性

对血管材料进行表面改性是常用的人工血管修饰方法，包括物理改性和化学改性两类。不同的改性方法通过影响不同生物学功能，达到预防和延缓钙化的目的。

2.2.1. 促进人工血管快速内皮化

促进人工血管植入后的快速内皮化一直是研究者们致力于解决的问题。ECs是血管内表面与血流的分界，能够合成和分泌例如一氧化氮（nitric oxide，NO）、前列环素的多种生物活性物质，可抗血小板聚集、抑制血小板黏附和活化^[29]，防止血栓形成。相较于自体血管，大多数人工血管缺少ECs衬里，植入后短期通畅率低的主要原因是急性血栓形成，而快速内皮化可提升植入后的抗凝性能和通畅率。Ding等^[30]发现，内皮化不完全的组织工程移植物可能产生钙化，实现完全内皮化则可防止血栓形成以及抑制钙化。简而言之，人工血管植入后的内皮化程度是影响钙化现象发生发展的关键，实现快速内皮化对提高小口径血管移植物的通畅率具有决定性作用^[31]。

促进内皮化的技术有两类。一类是通过直接在人工血管表面种植ECs，使其快速贴壁形成内皮层；一类则通过各种修饰改性等方法提升内皮化性能，目前的研究大多聚焦于第二种。Li等^[31]发现丝素蛋白基质能够促进ECs的黏附和增殖，在血管植入术后一个月即形成内皮层。Zhou等^[32]等将原花青素掺入移植物，证明了其抗炎、抗钙化和快速内皮化的功效及良好的应用前景。Wei等^[33]制备的静电纺丝人工血管，通过负载谷氨酰胺合成酶，显著促进了移植物内皮化，减轻了炎症反应，从而防止血管钙化。

NO是一种血管活性因子，可抑制血小板、促进ECs增殖，具有广泛的血管保护和抗血栓作用^[34]，还可用于减少血管移植物中的钙化^[19]。Li等^[35]设计了双层小口径人工血管，其NO释放功能增强了对ECs的促进作用，在6个月内保持通畅、无钙化。Wang等^[36]开发了能够局部输送NO的生物杂化血管移植物，持续释放的NO增强了内皮化，有效抑制内膜增生和血管钙化。

2.2.2. 调节人工血管植入后的免疫反应

人工血管移植后引发的免疫反应也值得关注。炎症在自体血管钙化的发生和转归过程中起重要作用^[37]，而人工血管的钙化也与炎症息息相关。移植物在体内长期存在可诱发异物反应，加速内膜增生和移植物钙化^[32]。

不少研究者通过调控人工血管的降解速率而减轻植入后的免疫炎症反应，减少钙化发生。Wu等^[38]认为，移植物的快速降解可以减少外来物质在宿主体内暴露的时间，为细胞浸润、增殖及新组织形成提供更多空间。再者，过于持久的材料会导致纤维包裹的组织变硬，激活炎症细胞，诱导新生内膜增生。快速降解的材料有利于移植物的快速重塑；而降解速度过慢的材料虽然能长时间提供结构支撑，但也导致长期炎症，并阻碍新组织形成^[39]。基于以上观点，加速移植物降解速度也成为减少钙化的手段之一。Sugiura等^[40]在缓慢降解和快速降解两种情况下观察相同人工血管的钙化情况，经过8周后，仅在缓慢降解的移植物中观察到钙化。鉴于PCL相对缓慢和不受控制的降解会导致长期的慢性炎症，Xiao等^[41]结合两种以上高分子材料以加速移植物降解。该种移植物在植入1个月后几乎没有巨噬细胞的表达，12个月内无钙化发生。

2.2.3. 优化人工血管结构

孔隙率、孔径、纤维尺寸等微观结构参数同样会影响人工血管的通畅性。研究发现，较小的孔径会使移植物的细胞浸润受限，不利于新生血管的重塑^[42]。在纤维形态方面，具有定向纤维的移植物拥有更适于组织再生的降解速率，而随机纤维的移植物因降解较慢，可能导致材料在组织中停留时间过长，阻碍组织重建^[43]。

Wang等^[44]增大了PLCL电纺支架的孔径和纤维尺寸，该种移植物可显著促进细胞浸润和功能性中膜的有效再生，12个月后无钙化现象。Tara等^[45]对比了不同孔径聚乳酸血管的植入效果：大孔径移植物的新生内膜层中几乎没有发生钙化；相比之下，小孔径移植物在新生内膜层处钙化严重。

总而言之，人工血管的物理结构对延缓或抑制植入后钙化发生有一定的作用。正常的血管平滑肌细胞具有防止钙沉积的潜能，而结构适宜的移植物则可在物理层面上引导和调节其向成骨细胞的分化；与此同时，较大的孔径为细胞浸润提供了良好的条件，并促进细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的分泌，降低了潜在的钙化风险^[17]。综上，设计具有较大孔径和孔隙率的人工血管能够促进细胞浸润，减少钙化发生。

2.3. 探索具有创新性的人工血管

寻找新型抗钙化材料是研究的热点之一。Liu等^[46]发现，鱼鳔衍生材料具有良好的生物相容性和抗钙化性能。相较于牛心包，在体外钙化实验、大鼠皮下植入等实验中均表现出较低的钙化程度，体现了该种材料在心血管移植领域的和优势和应用潜力^[47]。Song等^[48]将叶酸修饰的银纳米颗粒负载在异种脱细胞瓣膜上，成功得到了具有促内皮化、抗钙化等多功能的支架材料。

2.4. 其他有应用潜力的抗钙化措施

联合其他脱细胞前处理是一种可行的策略，可通过物理方法、酶或去污剂从血管支架中去除细胞成分^[49]。Qi等^[50]使用核糖法交联，得到了抗钙化性能更强的心血管材料。Braile-Sternieri等^[51]使用离子型洗涤剂十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）处理GA交联的猪主动脉，植入3个月后观察到钙化指数有所减少。但SDS在发挥脱细胞作用之外，含有的细胞毒性可能导致ECM溶胀，影响机械性能^[52]。因此，SDS在人工血管抗钙化中的应用有待进一步优化。

聚天冬氨酸（polyaspartic acid，PASP）具有潜在的抗钙化作用，直接应用时可能会因副作用致其疗效降低或失效。Adelnia等^[53]通过将PASP前体负载在纳米颗粒上发挥治疗作用，并结合姜黄素，实现了大鼠模型中的血管抗钙化，为离子螯合剂在人工血管领域的转化和应用提供了经验和参考。

金属离子对钙化也有一定的影响。文献报道，用氯化铝（aluminum chloride，AlCl₃）进行预处理，使弹性蛋白与铝离子不可逆结合，可抑制植入大鼠皮下后发生的钙化现象。Bailey等^[54]进一步说明，这种结合可抑制基质金属蛋白酶-9介导的弹性蛋白降解，经AlCl₃预处理的移植物能够抑制植入后的病理性钙化。镁具有很强的抑制磷酸盐诱导的血管平滑肌细胞钙化的能力^[55]，在血管平滑肌细胞钙化途径中起关键作用，可通过直接抑制羟基磷灰石晶体的形成及上调钙化抑制剂水平而延缓血管钙化进展^[56]。研究发现，镁对Wnt/β–catenin信号通路的抑制是实现其抗钙化作用的潜在细胞内机制之一^[57]。在基因层面，镁的另一个潜在作用机制是调节microRNA。镁离子的加入可拮抗高磷酸盐水平促进的特异性microRNA表达失调，有助于抑制血管钙化^[57]，这或为金属离子实现在抗钙化领域的应用提供新的思路。

3. 总结与展望

随着发病率和临床医疗需求日益增长，人工血管在疾病治疗中占据着愈发重要的地位，但其寿命短、通畅率低的难题仍亟待解决，开发满足治疗需求的人工血管已成为研究者们当前的首要任务。

钙化是可能导致人工血管植入失败的一种病理过程。近些年，研究者们对不同材料开展了许多研究，探索了钙化的形成机制和防治措施。截止目前，通过优化交联方法、表面改性修饰、探索新型血管材料等途径进行的抗钙化研究已实现一些突破，然而在扩大治疗效果、推行大规模应用等方面还存在一定的局限性。在已有基础上实现移植物长期、稳定的抗钙化研究和临床应用将是未来工作的重点和难点所在。

今后的抗钙化研究，应重点关注如何发挥不同材料的优势，实现多种因素共同优化，基于对材料性质的理解针对性地加以改进，使具有潜力的人工血管产品真正地走出实验室、走向临床。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：苏晓萌进行文献收集整理、论文构思及撰写；邱凡珊、王涵参与文献收集，修改和完善文章。韩倩倩为本文通信作者，指导选题、搭建文章框架并审阅文章。

Funding Statement

国家重点研发专项课题（2022YFC2409802）