单细胞转录组技术在鼻咽癌研究中应用的进展

Abstract

Nasopharyngeal carcinoma(NPC) is a distinct type of head and neck cancer closely associated with Epstein-Barr virus(EBV) infection and exhibits significant geographic variations in its incidence. Despite recent advancements in radiotherapy techniques and precision medicine for NPC, the overall survival rate remains unsatisfactory due to tumor metastasis, recurrence, and drug resistance. Single-cell RNA sequencing(scRNA-seq) is an emerging technology that allows for the analysis of gene expression at single-cell resolution, providing a clearer understanding of tumor cell subpopulations, the evolutionary trajectory of tumor cells, and the functional roles and interactions of cells within the tumor microenvironment. This provides new ideas for the development of precision medicine in NPC. Here, we review the applications of scRNA-seq in exploring the mechanisms of NPC pathogenesis, tumor heterogeneity, the tumor microenvironment, drug resistance, and therapeutic response.

单细胞转录组测序是最近发展起来的一项可以在单个细胞层面研究细胞转录组的新技术^[1]。传统批量转录组测序(bulk RNA-seq)只能测定特定组织转录的平均水平，难以分析单个细胞间的转录水平的差异，而单细胞转录组测序则是克服了批量转录组测序的局限，可以精确地测定每个细胞的转录水平，从而可以分析细胞间异质性。

鼻咽癌是一类与EB病毒有关的特殊头颈部癌症，发生于鼻咽部黏膜层的上皮性癌，其分布具有明显的地理分布特点，并且全球鼻咽癌发病率在逐年上升^[2-3]。每年全球发病人数约120 000例，死亡人数约70 000例^[4]。其以丰富的免疫浸润而闻名，也具有相当高的异质性。所以将单细胞转录组测序技术应用于鼻咽癌，不仅可以解决肿瘤异质性问题，还能阐明肿瘤细胞的演化过程、肿瘤免疫微环境、转移播散及治疗耐药等。

随着实验研究及临床上对于这项技术的渴求，使得单细胞转录组测序在发明之后就不断更新，在成本控制、灵敏度以及测序通量方面都有显著提高。目前，单细胞转录组测序平台已经形成基本相同的步骤。单细胞转录组测序简要流程可分为单细胞分离和捕获、测序及数据分析。肿瘤组织制备成单细胞悬液后，可采用手动分离、限制稀释、LCM、FACS或微流控技术进行单细胞捕获^[5-9]。方法选择取决于细胞类型、组织中细胞数量及成本^[10]。手动分离、限制稀释和LCM通量低且效率较低^[11]，FACS通量高，适用于稀有细胞捕获^[10]，微流控技术可短时间内分离数千细胞，适用于大规模并行处理^[12]。捕获后需裂解细胞以构建单细胞转录组文库，但单细胞mRNA含量极低(约0.1 pg)，需扩增cDNA以获得足够样本量^[13]。常用扩增方法包括PCR和IVT，但均存在扩增偏倚，因此在逆转录步骤中引入UMIs以降低偏倚^[14]。cDNA扩增后进行测序，数据分析包括数据预处理、处理及下游分析。具体来说，则是不同单细胞转录组测序平台采用不同的方法来预处理数据并且生成原始的计数表达矩阵。在此之后则可以通过多种分析工具对原始的计数表达矩阵进行处理，其中广泛使用的是R语言中的包，包括Seurat^[15-16]、Scanpy^[17]、scater^[18]或SCell^[19]。数据处理通常包括这些处理步骤：质量控制、映射、标准化和降维。数据处理尤其是质量控制之后，会得到一个基于活细胞的数据，这提升了数据的可靠性。最后则利用得到的表达矩阵进行下游数据分析，如聚类分析、细胞类型注释、差异表达、拟时序分析或细胞通讯分析，以获取所需的生物学信息。

1. 同为基于二代测序技术的单细胞RNA测序与批量RNA测序对比分析

二代测序技术也叫下一代测序(next-generation sequencing，NGS)，彻底革新了基因组学研究。它以大规模并行处理为核心，能同时对数百万个DNA片段进行测序，与传统Sanger测序等方法相比，极大提升了通量与效率^[20]。基于二代测序，形成了多种技术，包括基因组、表观基因组(如DNA甲基化)、宏基因组和转录组分析(如批量转录组测序和单细胞转录组测序)^[21]。

对单细胞转录组测序和传统基于二代测序的批量转录组测序进行比较。首先，从测序对象来看，不同于传统基于二代测序的批量转录组测序，只能提供异质性样本中所有细胞的平均转录水平，而单细胞转录组测序可以准确表征样本中每个细胞的转录本^[22]。这一特性使单细胞转录组测序特别适用于研究复杂的体内微环境，如肿瘤微环境、免疫系统及发育生物学等领域。其次，在获取的转录组数据分辨率方面，批量转录组测序获得的是组织或整个细胞群的基因表达谱，而忽略了细胞和细胞之间的个体差异。单细胞转录组测序可以在单个细胞层面检测基因表达，从而更精确地解析细胞亚群及动态变化。因此，单细胞转录组测序技术的出现弥补了传统二代测序在异质性分析方面的局限性，能够更深入地探讨疾病发生和发展过程中细胞类型和进化上的演变。但是单细胞转录组测序对批量转录组测序，单细胞转录组测序的成本相对较高，实验复杂度也远超二代测序，限制了其在某些大规模研究中的应用。因此，需要根据实验研究设计以及目标的生物学问题来选择适合的技术方案。

2. 发生发展机制

单细胞转录组测序除了可以深入地理解肿瘤细胞的组成，识别新的细胞亚型，更有趣的是可以描绘肿瘤转录景观，为探索组织中的细胞状态轨迹和细胞转化提供了新途径。也可通过分析治疗前后肿瘤免疫微环境的动态变化，包括免疫细胞、内皮细胞和促血管生成途径等，显示个体化治疗的潜力。Li等^[23]对比了EBV血清阴性和EBV血清阳性鼻咽癌分化发育轨迹。发现EBV相关的NPC细胞经历了3种潜在的分化状态。进行拟时序分析得到不同EBV DNA状态的肿瘤细胞中细胞状态分布有明显差异，简而言之，EBV血清阴性肿瘤细胞主要位于分化阶段的起始部位，而大部分EBV血清阳性肿瘤细胞处于分化末端。免疫微环境的轨迹分析也得到了关注，其中T细胞发育轨迹尤为引起重视。Gong等^[24]通过分析CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞拟时间发育轨迹。发现耗竭是CD8⁺T细胞发育的终末阶段。静息Tregs被认为是较早开发的亚型，抑制性Tregs作为一种更成熟的形式，具有更强的免疫调节能力，并经历了更强大的克隆扩增。Liu等^[25]结合每个T细胞的TCR库和转录组分析揭示了NPC中CD8⁺T细胞的分化轨迹，外周血中的高迁移浸润并转化为肿瘤中耗竭T细胞。同时还观察到4种异质性Treg细胞簇。其中Treg_C4_TNFRSF4细胞与鼻咽癌中的其他Treg细胞簇比较，表现出最强的免疫抑制功能。Treg_C4_TNFRSF4细胞通过中间Treg_C2_HSPA1A或Treg_C3_MKI67细胞从外周血中的幼稚Treg_C1_SELL细胞分化出来。

3. 肿瘤异质性

鼻咽癌具有显著肿瘤异质性，而肿瘤异质性与肿瘤耐药、侵袭性的转移和复发有密切关系^[26-27]。肿瘤异质性可以分为肿瘤内异质性和肿瘤间异质性。肿瘤间异质性是指具有相同组织学类型肿瘤患者之间的异质性^[28]。已有研究发现，不同鼻咽癌患者中同一肿瘤亚型的组成不同^[29]。Liu等^[25]使用基因集变异分析(gene set variation analysis，GSVA)发现了不同肿瘤样本中信号通路的富集程度不同，体现了鼻咽癌中恶性细胞的肿瘤间异质性除此之外，EBV感染与鼻咽癌肿瘤异质性的关系也得到了关注，Zhao等^[30]通过分析发现EBV阴性鼻咽癌的恶性细胞比EBV阳性恶性细胞分离出来更多的细胞簇，证明EBV阴性患者的肿瘤内异质性高于EBV阳性患者。Liu等^[25]发现恶性鼻咽癌细胞对EBV不同的易感性导致差异的表达谱。另一方面，同一肿瘤内的癌细胞之间出现的表型和功能异质性被称为肿瘤内异质性^[31]。Chen等^[32]通过分析鼻咽癌和正常鼻咽上皮组织，将鼻咽癌细胞分为13个恶性细胞亚簇以及和23个不同的免疫细胞亚簇。另外Lin等^[33]通过分析鼻咽癌恶性上皮细胞，发现失去纤毛的恶性上皮细胞的高度异质性，并且恶性上皮细胞簇拷贝数变异以及角蛋白转录组表达水平差异有统计学意义。

4. 肿瘤微环境

肿瘤微环境由基质细胞，如癌症相关成纤维细胞、内皮细胞和肿瘤浸润免疫细胞；以及非细胞成分，包括信号分子和细胞外基质组成^[34]。这些成分可以对鼻咽癌的发生发展、侵袭、转移、治疗反应产生重要影响^[35]。鼻咽癌展现出显著的免疫细胞浸润特性，甚至和同是头颈鳞癌的口腔癌比较也是如此^[29]。众所周知，鼻咽癌的特殊之处在于它的发生与EBV感染有重要关系。研究表明，与EBV阴性鼻咽癌相比，EBV阳性鼻咽癌肿瘤微环境免疫抑制更显著。鼻咽癌的肿瘤免疫微环境还具有比大多数其他实体瘤更高的肿瘤浸润淋巴细胞(tumour infiltrating lymphocytes，TILs)富集的特征，尽管这些淋巴细胞同时表达效应标志物以及耗竭标志物^[25]。具体来说在EBV阳性鼻咽癌中，肿瘤浸润淋巴细胞的主要成分是T细胞，而在EBV阴性鼻咽癌中，大多数肿瘤浸润淋巴细胞是B细胞^[32]。除此之外，鼻咽癌中的肿瘤浸润性T细胞的耗竭也与EBV感染有关^[36]。虽然鼻咽癌的手术治疗已经得到了部分肯定^[37]。放化疗是鼻咽癌当前的标准治疗。虽然现在放疗有着让人满意结果^[38]，但是约10%的患者出现局部复发。这些局部复发患者中位生存期仅为10~15个月^[39]。对此，Peng等^[40]通过单细胞测序技术分析初发和复发鼻咽癌微环境的异质性，获得了约60 000个细胞的转录组数据，在复发鼻咽癌样本中，其肿瘤微环境的特征与初发鼻咽癌比较，呈现出显著的差异。其特征是免疫抑制细胞的比例或特征增加，包括Tregs、M2型巨噬细胞和成熟的LAMP3⁺DCs等，以及免疫激活和功能失调状态。徐志渊^[41]则探究了局部晚期鼻咽癌放疗抵抗肿瘤微环境的特征，研究发现放疗抵抗患者肿瘤微环境主要富集髓系细胞和成纤维细胞，放疗敏感患者肿瘤微环境中则是T细胞和B细胞。

5. 耐药性的潜在机制和治疗反应

鼻咽癌的标准治疗是放化疗，并且可以获得比较好的疗效^[42]。尽管如此，放化疗耐药性对鼻咽癌患者的复发、转移以及远期疗效造成消极影响^[43]。单细胞转录组测序则可以对耐药患者的测序数据进行分析，从而给出生物学解释。免疫治疗在鼻咽癌中已经表现出一定的临床治疗潜力，但是众所周知免疫逃逸会阻碍这种治疗方式的疗效^[44]。对此，Lin等^[33]通过单细胞转录组测序确定了鼻咽癌恶性细胞的3种免疫逃逸模式，首先，一些鼻咽癌细胞下调了MHC分子的表达；其次，鉴定出一种潜在的肿瘤干细胞的成纤维细胞样恶性细胞；第三，增生的上皮细胞减少免疫浸润，增强肿瘤细胞的免疫逃逸能力。吉西他滨联合顺铂(gemcitabine plus cisplatin，GP)是鼻咽癌化疗的标准方案，但是这项方案的生物学机制依旧不清晰。就此，Lv等^[45]通过使用GP化疗前后的鼻咽癌样本进行单细胞测序，生成了GP化疗后肿瘤免疫微环境的高分辨率图谱，并揭示了以B细胞为中心的抗肿瘤免疫的作用。还确定并验证先天样B细胞作为NPC基于GP治疗的潜在生物标志物。Gong等^[46]发现CD70⁺鼻咽癌细胞可以促进Treg细胞发育以及增强其功能，从而导致免疫逃逸。研究结果表明抗PD-1治疗可以与CD70阻断策略相结合，为肿瘤免疫治疗提供了新的潜在途径。

6. 结论与展望

一言以蔽之，单细胞转录组测序技术，由于其不可替代的高解析度以及对细胞分子差异更加敏感，故而可对鼻咽癌进行更加精确的分型，也能细胞间相互作用进行更深的探索。对于鼻咽癌的免疫浸润丰富的特性，高通量、高分辨率的单细胞转录组测序可以充分的描绘鼻咽癌组织内的免疫景观。进而可通过拟时序分析探索肿瘤微环境内免疫细胞的分化发展过程。虽然单细胞转录组测序现阶段还有其不足，如没有细胞间的空间信息、对细胞样本质量要求较高、测序成本较高以及测序样本较少等。但是随着此技术改进，不断降低成本，以及和空间转录组、代谢组学等多组学不断融合，单细胞转录组技术应用范围会更加广泛，可以对生物信息学和临床医学带来更加深刻而长远的改变。

Funding Statement

广西自然科学基金(No：2023GXNSFAA026225)；北京医学奖基金会(No：YXJL-2022-0665-0210)