水飞蓟宾-磷脂复合物干预胺碘酮诱导的小鼠脂肪肝的实验研究

Abstract

Objective

To probe into the mechanism and interventional effects of silybin-phospholipid complex on amiodarone-induced steatosis in mice.

Methods

Eight-week-old male C57BL/6 mice were divided into three groups (5 mice in each group): a control group (WT) with normal diet, a model group with amiodarone 150mg/kg/d by oral gavage (AM), and an intervention group on amiodarone 150mg/kg/d combined with silybin-phospholipid complex（AM+SILIPHOS. All mice were fed their assigned diet for one week. Then, one week later, serum alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, triglyceride, total cholesterol and high-density lipoprotein were detected of each group. A liver pathological change was observed by oil red O and H&E staining. Ultrastructural pathological changes of hepatocytes were observed to evaluate the intervention effect by transmission electron microscopy. RT-q PCR was used to detect the expression of peroxisome proliferator-activated receptor alpha and its regulated lipid metabolism genes CPTⅠ, CPTⅡ, Acot1, Acot2, ACOX, Cyp4a10 and Cyp4a14 in liver tissues. Intra-group comparison was done by paired t-test. One-way ANOVA was used for comparison between groups and semi-quantitative data were tested using Mann-Whitney U test.

Results

Oil Red O and H & E staining results of liver tissue in the intervention group showed that intrahepatic steatosis was significantly reduced when compared to model group. Transmission electron microscopy showed that the model group had pyknotic nuclei, mitochondrial swelling, structural damage, and lysosomal degradation whereas the intervention group had hepatic nucleus without pyknosis, reduced mitochondrial swelling and slight structural damage than that of model group. RT-q PCR results showed that the expression of peroxisome proliferator-activated receptor alpha, CPTⅠ, CPTⅡ, Acot1, Acot2, ACOX, Cyp4a10 and Cyp4a14 were increased in the model group but the expression of CPTⅠ, Cyp4a14, Acot1 and peroxisome proliferator-activated receptor alpha were decreased in the intervention group (P＜0.05).

Conclusion

Silybin-phospholipid complex can alleviate amiodarone-induced steatosis, and its mechanism may play a role in protecting mitochondrial function and regulating fatty acid metabolism. Thus, silybin-phospholipid complex has potential intervention effect on amiodarone-induced fatty liver.

胺碘酮是最有效的广谱抗心律失常药物，但可引起肝脏脂肪变等不良反应，长期应用可导致肝纤维化等病变，甚至有致死的报告，因此研究干预胺碘酮引起肝损伤的措施有重要临床意义。在动物模型和人类中已证明，胺碘酮可能通过抑制线粒体长、中和短链脂肪酸β-氧化诱导肝脂肪变性^{[1，2，3，4，5，6，7]}。水飞蓟宾-磷脂复合物是水飞蓟宾与磷脂酰胆碱的复合制剂，与磷脂酰胆碱结合后，水飞蓟宾的体内吸收与生物利用度显著提高，并与磷脂酰胆碱在抗脂质过氧化、保护肝细胞膜和维持细胞膜的流动性起协同作用^[8，9]。在小鼠非酒精性脂肪肝模型中运用水飞蓟宾-磷脂复合物可以抑制三磷酸腺苷消耗和质子泄漏，保护线粒体功能，限制氧化应激，调节线粒体膜内的脂肪酸成份^{[10，11，12，13，14]}，但在药物诱导肝脂肪变中研究极少。本研究探索水飞蓟宾-磷脂复合物对胺碘酮诱导的小鼠脂肪肝的干预效果和可能的机制。

材料与方法

1.主要试剂：胺碘酮和羧甲基纤维素钠购自Sigma公司，后者作为助悬剂用于制备水飞蓟宾-磷脂复合物溶液，胺碘酮用蒸馏水按比例溶解；水飞蓟宾-磷脂复合物购自天津天士力制药股份有限公司。

2.实验对象：C57B/6J小鼠，无特定病原级，雄性，8～11周龄，体质量20～25g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于上海交通大学附属仁济医院动物实验中心，实验前适应性喂养1周。

3.动物分组、造模和药物干预：C57B/6J小鼠15只，分成3组，每组5只，空白对照组（WT组）上午给予0.1ml蒸馏水灌胃，下午1%羧甲基纤维素钠0.2ml灌胃。模型组（AM组）上午给予0.1ml胺碘酮（150mg/kg）灌胃。干预组（AM+ SILIPHOS组）上午给予0.1ml胺碘酮（150mg/kg）灌胃，下午给予0.2ml水飞蓟宾-磷脂复合物（50 mg/kg）灌胃，各组均循环处理7d，之后处死取血及肝脏行各项检测。

4.血清生物化学指标检测：中国科学院上海分院的全自动生物化学分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和高密度脂蛋白（HDL）水平。

5.肝组织病理学检查：肝脏组织行常规HE染色、油红染色和透射电镜检查。

6.脂肪肝半定量评分：由经验丰富的肝脏病理医生独立完成，评分参照Brunt评分系统，脂肪变性评分为：0分（无），1分（肝细胞含脂滴≤33%），2分（肝细胞含脂滴≥33%～＜66%），3分（肝细胞含脂≥66%）。

7.荧光实时定量PCR测定：检测肝组织内过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）α及其调节的β-氧化等基因的m RNA表达^{[7，11，12，15，16，17，18，19]}，包括：脂酰辅酶A氧化酶（ACOX），系过氧化物酶体脂肪酸β-氧化的限速酶；脂肪酰辅酶A硫酯酶1（Acot1）和脂肪酰辅酶A硫酯酶2（Acot2），参与不饱和脂肪酸的生物合成；肉毒碱棕榈酰基转移酶Ⅰ（CPTI）和Ⅱ（CPTⅡ），参与线粒体长链脂肪酸转运和摄取；微粒体细胞色素P450酶Cyp4a14和Cyp4a10，参与催化脂肪酸氧化。以β-肌动蛋白（β-actin）基因为内参照，引物序列：m ACOX-F:5′-TTT GTGGAACCTGTTGGCCT-3′，m ACOX-R: 5′-TCGAAGATGAGTTCCGTGGC-3′;m Acot1-F: 5′-CCACAACTGGAAGAGCGAGT-3′;m Acot1-R: 5′-ACGTGCTTTATTTCTCGCAGC-3′;m-Acot2-F: 5′-CGTGGAAAGGTCTGACACGA-3′;m Acot2-R: 5′-CGAGGAACAGGAAGGTCGT-3′;m CPTI-F: 5′-TCCGCTCGCTCATTCCGC-3′;m CPTI-R: 5′-TGCCATTCTTGAATCGGATGAA CT-3′; m CPTⅡ-F: 5′-CACAGCATCGTACCCA CCAT-3′，m CPTⅡ-R: 5′-CTGTCTTCCTGAAC TGGCTGT-3′; m CYP4a10-F: 5′-TTACCCAAA GGTGTCCAGGT-3′; m CYP4a10-R: 5′-CTGAG AAGGGCAGGAATGAG-3′; m CYP4a14-F: 5′-GACTCTTGGGACAATGGACA-3′; m CYP4a14-R:5-AGTTCCTTCCTCTGGCTGGT-3′; m PPARα-F:5′-CGCGTGTGATAAAGCCATTG-3′; m PPAR α-R: 5′-CACGATGCTGTCCTCCTTGA-3′;

8.统计学方法：用SPSS19.0统计软件进行统计，计量资料均以均数±标准差（±s）表示，组内比较采用配对t检验，组间比较用单因素方差分析，半定量资料采用非参数检验的Mann-Whitney U检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.各组小鼠血生物化学指标比较：空白对照组、模型组和干预组小鼠血清ALT、AST、TG、TC和HDL各组间差异无统计学意义，见表1。

表1. 各组间生物化学指标值的比较.

组别	ALT	AST	TC	TG	HDL
对照组	50.00±30.99	135.5±31.84	4.07±1.66	0.34±0.08	1.94±0.88
模型组	75.25±32.08	155.0±37.24	4.60±0.41	0.34±0.10	2.45±0.22
干预组	47.00±18.38	108.5±20.51	2.74±0.06	0.32±0.05	1.21±0.03
P值	0.44	0.32	0.27	0.94	0.12

注：ALT：丙氨酸氨基转移酶（U/L）；AST：天冬氨酸基氨基转移酶（U/L）；TG：甘油三酯（mmol/L）；TC:总胆固醇（mmol/L）；HDL：高密度酯蛋白（mmol/L）

2.各组间肝组织病理变化比较：肝脏组织切片HE染色结果显示，空白对照组的肝脏组织结构完整，无脂肪变等。模型组可见小鼠肝脏组织散在分布的微泡性脂肪变，无肝细胞坏死，可见少许中性粒细胞浸润；干预组肝细胞排列稍显紊乱，可见少许微泡性脂肪变。通过油红染色显示模型组有明显红色脂滴，部分脂滴融合成片；干预组脂滴较模型组明显减少，见图1。

图1. 各组肝脏病理组织学表现.

注：A：空白组无脂肪变；B：胺碘酮150mg·kg^-1·d^-1导致肝细胞内典型的小泡性脂肪变；C：水飞蓟宾-磷脂复合物50mg·kg^-1·d^-1干预后小泡性脂肪变数量明显减少（HE染色×400）。D：空白对照组油红染色阴性；E：模型组示脂滴弥漫性浸润肝细胞，部分脂滴融合成片；F：水飞蓟宾-磷脂复合物50mg·kg^-1·d^-1治疗后可见少量散在的红色脂滴

3.HE半定量评分：经非参数检验分析提示干预组比模型组的脂肪变有明显改善（P＜0.05），各组肝脏脂肪变评分见表2。

表2. 各组肝脏脂肪变的HE染色半定量评分（例）.

分组	0分	1分	2分	3分
空白对照组	3	2	0	0
模型组	0	0	3	2
干预组 a	0	4	1	0

注： ^a：与模型组相比，明显改善（ P<0.05）

4.肝脏组织标本电镜下观察：低、中、高倍电镜（分别为3400、7200、13 500倍）下可见空白对照组肝细胞核膜结构完整，无畸形或固缩，粗面和滑面内质网排列整齐，溶酶体无异常，线粒体分布均匀。模型组见肝细胞结构受损，核固缩，线粒体肿胀，被溶酶体吞噬，出现自噬现象，溶酶体数量增多，高倍镜下可见明显的板层状小体。干预组肝细胞轻度损伤，无核固缩，但与空白对照组比较有变性，线粒体肿胀较模型组明显减轻，溶酶体数量亦减少，见图2。

图2. 各组肝脏病理组织学表现（透射电镜）.

注：小鼠给予胺碘酮150mg·kg^-1·d^-1灌胃×7d（见模型组b、e、h），同时干预组给予水飞蓟宾-磷脂复合物50mg/kg治疗×7d（见干预组C、F、I）；空白对照组：A、D、G；A、B、C×3400，D、E、F×7200，G、H、I×13500);M，mitochoridrion，线粒体；N，nucleus，细胞核；L，lysozyme，溶酶体；LB，lamellar body，板层状小体

5.肝组织PPAR α及其调控的脂肪代谢相关基因的表达：胺碘酮模型组PPAR α、CPTⅠ、CPTⅡ、Acot1、Acot2、ACOX、Cyp4a10和Cyp4a14表达均明显增加；水飞蓟宾-磷脂复合物干预后Acot1、Cyp4a14、CPTⅠ和PPAR α表达降低；CPTⅡ、Acot2、ACOX和Cyp4a10差异无统计学意义，见图3。

图3. 不同组间Acot1、Cyp4a14、CPTⅠ、PPAR α、CPTⅡ、Acot2、ACOX、Cyp4a10的m RNA的表达.

注：胺碘酮150mg/kg（模型组）治疗增加了肝细胞内PPARα及其目标基因Acot1、Cyp4a14、CPTⅠ、CPTⅡ、Acot2、ACOX和Cyp4a10表达；水飞蓟宾-磷脂复合物50mg/kg（干预组）治疗后PPARα、Acot1Cyp4a14和CPTⅠ表达下降（P＜0.05）; ^a: P＜0.05; ^b: P＜0.01; ^c: P＜0.01。

讨论

胺碘酮可在小鼠中抑制肝细胞线粒体脂肪酸β-氧化，致肝脏小泡性脂肪变^{[1，4，7，15]}。我们使用胺碘酮150mg·kg^-1·d^-1喂饲小鼠1周后，HE和油红染色可见明显的肝细胞内小泡性脂肪变的累积。生物化学指标ALT、AST以及TG、CHOL、HDL等，各组间比较无统计学意义，本模型系早期脂肪变表现，尚未达到脂肪性肝炎。

在上述造模的同时给予水飞蓟宾-磷脂复合物干预（即干预组），该组比模型组的脂肪变数量明显减少，肝组织学HE染色的脂肪变半定量评分有统计学意义，无肝细胞坏死和炎症细胞浸润。油红染色亦见干预组含脂滴的肝细胞较模型组减少，分布较局限，且少见脂滴融合成片。电镜检测肝脏组织的微细结构，结果显示模型组肝细胞结构受损，出现核固缩，线粒体明显肿胀，数量减少，甚至被溶酶体吞噬，出现板层状小体；干预组线粒体肿胀减轻，数量增多，肝细胞结构较模型组明显好转。由此推断水飞蓟宾-磷脂复合物具有修复线粒体和保护肝细胞膜的潜力。

转录调节因子PPAR α控制肝脏中脂肪代谢的许多方面，包括脂肪酸的摄取、活化、转运及脂肪酸氧化等，其在脂肪酸氧化中起到关键的作用^[16，17]。PPAR α可通过调节其下游相关基因参与脂肪代谢。曾有报道脂肪酸刺激机体代偿性增加PPARα表达，进而使脂肪酸代谢相关的基因表达增高^[14，18]。已知AMD不是PPAR α的激动剂，可能直接损伤肝脏的脂肪酸β-氧化，造成脂肪酸积聚，从而代偿性上调PPAR α表达。因此，通过检测PPAR α及其调控的基因表达在一定程度上可反映AMD引起的肝细胞脂肪酸β-氧化受损情况。在非酒精性脂肪肝研究中，水飞蓟宾具有广泛的肝细胞保护作用，主要通过抑制脂肪的从头合成，促进脂肪酸的氧化起作用^{[19，20，21，22]}。国内外相关文献报道水飞蓟宾-磷脂复合物对脂肪酸β-氧化具有一定的修复作用^{[9，10，11，12]}，但相关机制并不是很清楚。我们发现PPARα在模型组比空白对照组表达明显增加，和既往的研究结果相一致；其调控的相关基因CPTⅠ、CPTⅡ、Acot1、Acot2、ACOX、Cyp4a10和Cyp4a14表达均明显增高。水飞蓟宾-磷脂复合物干预治疗后，PPARα表达明显降低，相应CPTⅠ、Acot1和CYP4a14表达也下降，CPTⅡ、Acot2、ACOX和Cyp4a10表达有下降，但未达到统计学差异。由此推测，水飞蓟宾-磷脂复合物可能通过调节PPAR α信号通路及其下游相关基因减缓胺碘酮诱导的药物性脂肪变。确切的作用机制有待进一步研究。

微泡性脂肪肝是药物性肝损伤中极为特异的药理变化，主要涉及线粒体损伤。本研究中水飞蓟宾-磷脂复合物150mg·kg^-1·d^-1对胺碘酮诱导的微泡性肝脂肪变取得一定的疗效，可能是通过调节PPAR α信号通路及其下游相关基因，进而减缓线粒体的损伤，改善脂肪酸β-氧化起作用，也为进一步研究胺碘酮相关肝损伤的临床预防和治疗提供重要依据。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明

孙双双：动物实验、采集分析数据、文章撰写；卞兆连：动物实验指导；吴银霞、王晓今、陈成伟、程明亮：支持性贡献；彭延申、苗琪：病理学分析；傅青春：研究设计指导以及对全文的整体修改

Funding Statement

基金项目：南京军区医学创新面上课题（14MS003）；国家自然科学基金（8180030029）

Fund programs: General Programs of Medical Innovation of Nanjing Military Command（14MS003）;National Natural Science Foundation of China（8180030029）