HBV慢性携带小鼠中CD27和CD11b标记NK细胞亚群的变化

Abstract

Objective

To evaluate the changes in natural killer cell subsets marked with CD27 and CD11b for HBV carrier mice.

Methods

The p AAV-HBV1.2 plasmid was injected into the tail vein of C57BL/6 mice by hydrodynamic injection method to construct HBV-carrier model group and empty vector as the control group. Liver function and virological examination at different time points were used to judge the construction of HBV- plasmid carrier animal model. Flow cytometry was used to detect the frequency of NK cells and CD11b combined with CD27 NK cell subsets in spleen and liver. Graph Pad Prism software was used for statistical analysis.

Results

HBV-carrier mouse model was successfully constructed. There were no statistically significant difference in NK cell frequencies between spleen and liver of HBV carrier mice (P＞0.05), compared to control group. NK cells were divided into four subsets with in combination to CD27 and CD11b: CD11b⁺CD27^-(CD11b⁺ SP), CD11b⁺CD27⁺ (DP), CD11b^-CD27⁺ (CD27⁺ SP) and CD11b-CD27-(DN). Furthermore, the spleen of HBV-carrier mice had no statistically significant difference (P＞0.05) with the frequency of the four NK-cell subsets. The frequency of DN NK cell subsets was significantly increased in the liver of HBV carrier mice than control group (P＜0.001); however, the frequency of CD11b⁺ SP cell subsets was significantly decreased (P＜0.05).There were no statistical significance in the frequency comparison between NK subgroups of DP and CD27⁺ SP NK cell subsets (P＞0.05).

Conclusion

HBV-carrier mice with abnormal distribution of hepatic NK cell subsets significantly increased and decreased the frequency of DN NK cell subsets and CD11b⁺ SP cell subsets.

据统计全球约20亿人曾感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV），其中约2.4亿人为慢性HBV感染者。HBV慢性感染可导致肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌的发生，严重威胁人类的健康^[1]。宿主免疫反应是决定HBV感染清除或慢性化的重要因素。HBV在机体形成持续感染，需要通过一系列机制破坏机体的抗病毒反应。自然杀伤细胞（natural killer cells，NK细胞）作为天然免疫系统的重要组成部分，不仅可以通过杀伤功能清除病毒感染的细胞，还能通过分泌细胞因子进一步启动和调节获得性免疫反应。由于获取肝脏组织受限，目前关于NK细胞在HBV感染中的研究主要集中在人类外周血和动物模型上。而高压注射携带HBV基因组的p AAV-HBV1.2质粒能在小鼠中形成HBV持续表达，与人类的慢性感染尤其是免疫耐受阶段相似^[2]，是目前应用最广泛的研究HBV慢性感染的动物模型。NK细胞本身是一个异质性的细胞群体，表面分子CD27联合CD11b可以将小鼠NK细胞划分为CD11b⁺CD27^-（CD11b⁺ SP）、CD11b⁺CD27⁺（DP）、CD11b^-CD27⁺（D27⁺ SP）和CD11b^-CD27^-（DN）四个不同的功能亚群^[3]。研究慢性HBV感染小鼠模型中NK细胞亚群的分布情况有利于我们更加准确阐明NK细胞在慢性HBV感染中的作用。

材料与方法

1.小鼠模型构建：SPF级6～8周龄雄性C57BL/6小鼠，购于中国科学院上海斯莱科实验动物中心。实验操作按重庆医科大学实验动物条例执行。将24只小鼠分成两组，实验组16只，用高压水动力法在5～8s内通过尾静脉注射2ml含10 μg p AAV-HBV1.2质粒的磷酸盐缓冲液（PBS）到小鼠体内，3d后从小鼠眼眶静脉丛取血，分离血清检测HBs Ag和HBV DNA，阳性的为注射成功。另有空载组对照小鼠8只，用高压水动力法注射2ml空载体到小鼠体内。在不同时间点分别进行小鼠尾静脉取血或者眼眶静脉丛采血，收集血清用于检测血清中肝功能及病毒学指标。p AAV-HBV1.2质粒由中国台湾地区台湾大学Peijer Chen教授馈赠。本研究已获得重庆医科大学附属第二医院伦理委员会批准。

2.肝功能及病毒学指标检测：丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）等采用日立全自动生物化学分析仪检测；HBs Ag、HBe Ag使用罗氏电化学发光法分析，血清HBV DNA水平使用罗氏荧光定量PCR仪检测。

3.组织病理学及免疫组织化学检查：分别在0、1、4、5周时，各选取1只成功注射含有HBV质粒的小鼠，且其血清中存在HBs Ag抗原，对其进行取材。用氯胺酮以10 μl/g剂量麻醉所选小鼠后解剖取肝，将取下的肝组织固定于4%的多聚甲醛中，送重庆医科大学附属第二医院病理科，病理切片后进行HE染色、HBs Ag和HBc Ag免疫组织化学检查。

4.脾脏和肝脏中NK细胞及其亚群细胞检测：开腹取出小鼠脾脏、肝脏置于无菌PBS中，于200目筛网上轻轻碾磨成单个细胞，同时参照淋巴细胞分离试剂盒加入适量样本稀释液冲洗细胞、离心后获取淋巴细胞。调整淋巴细胞浓度为1×10⁶个/ml，每管取100 μl，按试剂说明加入适量体积荧光标记的流式抗体CD3-APC、NK1.1-PE、CD27-FITC及CD11b-Percep5.5，同时使用Ig G作为阴性对照。抗体在4℃染色30min，流式缓冲液洗涤后，用BD Canto Ⅱ流式仪检测，并用Flow jo 7.42流式软件分析流式数据。

5.统计学方法：采用Graphpad Prism软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用成组t检验，计数资料比较采用x²检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.p AAV-HBV1.2质粒高压注射小鼠造模情况：对雄性C57 BL/6小鼠尾静脉高压注射p AAV/HBV1.2质粒，在注射后0周、3d、1、2、3、4、5周分别取血检测血清中HBs Ag和HBV DNA含量变化。与对照组相比，p AAV/HBV1.2质粒高压注射组血清中HBs Ag和HBV DNA含量在3d时达到最高峰，2周后处于相对稳定的水平，5周时血清中仍能检测到HBs Ag和HBV DNA的表达（图1A～B）。进一步检测血清中ALT的水平，ALT水平仅在高压注射后由于压力导致肝实质细胞破坏出现升高，3d后血清中ALT就逐渐恢复到正常水平（图1C），提示p AAV/HBV1.2质粒注射后持续表达HBV并没有导致炎症发生。免疫组织化学检测结果显示与对照组相比，质粒注射5周后肝实质细胞中仍有HBs Ag和HBc Ag表达（图1D）。以上结果提示C57BL/6鼠高压注射p AAV/HBV1.2质粒后能形成HBV持续表达携带。

图1. p AAV-HBV1.2质粒高压注射小鼠建立HBV慢性携带动物模型.

注：A～C：不同时间点小鼠血清中HBs Ag、HBV DNA及ALT的水平；D：质粒高压注射5周后，采用免疫组织化学ABC法检测小鼠肝组织中HBs Ag和HBc Ag表达×200

2.脾脏和肝脏中NK细胞比例变化：NK细胞及NK细胞亚群的圈门策略见图2A。CD27联合CD11b可以将CD3^-NK1.1⁺NK细胞划分为CD11b⁺CD27^-（CD11b⁺ SP）、CD11b⁺CD27⁺（DP）、CD11b^-CD27+（D27⁺ SP）和CD11b^-CD27-（DN）四个亚群（图2A）。流式细胞仪检测高压注射后5周脾脏和肝脏中NK细胞的比例。与对照组相比，造模组小鼠脾脏和肝脏中NK细胞的比例差异均无统计学意义（P值均＞0.05）（图2B），提示HBV持续携带并不影响NK细胞的比例。

图2. 比较对照组与造模组小鼠脾脏、肝脏中NK细胞频数.

注：A：小鼠自然杀伤（NK）细胞及NK细胞亚群圈门策略；B：比较高压注射后5周对照组与HBV慢性携带小鼠脾脏、肝脏中NK细胞频数

3.脾脏和肝脏中NK细胞亚群比例变化：流式进一步检测高压注射后5周脾脏和肝脏中CD27联合CD11b划分的NK细胞亚群比例，见图3。与对照组相比，造模组小鼠脾脏中NK细胞四个亚群的比例差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。然而造模组小鼠肝脏中NK细胞亚群比例与对照组比较，其差异有统计学意义：CD11b⁺ SP亚群比例明显减少（65.76%±7.15%对比58.10%±6.89%，t=2.179，P=0.046 9），而DN亚群比例明显增加（19.60%±1.60%对比27.88%±3.73%，t=5.764，P＜0.001）。以上结果提示HBV持续携带会导致肝脏中NK细胞亚群比例发生显著变化。

图3. 比较对照组与造模组小鼠脾脏、肝脏中NK亚群频数.

注：比较高压注射后5周对照组与造模组小鼠脾脏、肝脏中自然杀伤（NK）细胞频数；^a：P＜0.05；^b：P＜0.001

讨论

NK细胞是机体抵御病毒感染的第一道防线，可以通过两种方式发挥抗病毒感染的功能：（1）通过脱颗粒直接发挥杀伤功能，杀灭病毒感染的细胞；（2）可以产生包括干扰素-γ在内的多种细胞因子间接发挥抗病毒效应。本课题组曾荟萃多项研究发现HBV慢性感染患者的外周血中NK细胞比例减少，杀伤功能异常活化而分泌细胞因子的能力却无明显变化，提示HBV慢性感染时NK细胞并不能有效清除病毒，其功能主要倾向于致肝损伤^[4]。目前关于HBV慢性感染的研究主要集中在外周血，但外周血中的免疫参数并不能完全揭示HBV慢性感染时肝脏中真实的免疫状态。因而建立动物模型模拟疾病状态，研究疾病微环境下的免疫功能变化成为我们探索慢性乙型肝炎发病机制的一种有效手段。目前建立的HBV相关小鼠模型有：HBV转基因鼠动物模型、人-鼠嵌合肝模型和高压水动力注射模型。其中，转基因小鼠与生俱来携带病毒，其免疫耐受方式与感染导致的耐受存在较大差异；嵌合肝模型缺乏免疫功能，不能用于研究HBV与宿主免疫系统的关系。因此，高压水动力法建立HBV转染小鼠模型是现今应用最广泛的研究乙型肝炎免疫状态的动物模型。本研究建立的高压水动力p AAV-HBV1.2转染C57BL/6小鼠模型，在2周以后有较稳定的HBs Ag和HBV DNA表达，而且能持续到5周以后，是适合我们进行HBV慢性感染相关免疫研究的动物模型。

NK细胞本身是一个异质性群体，根据基因组学和过继转输NK细胞亚群的证据，小鼠的NK细胞可以通过CD27联合CD11b划分为4个具有稳定发育顺序的功能亚群CD11b⁺CD27^-（CD11b⁺ SP）、CD11b⁺CD27⁺（DP）、CD11b^-CD27⁺（D27⁺ SP）和CD11b^-CD27^-（DN）^[3]。最近已有研究表明人类NK细胞也可进行类似的亚群划分，因此这种新型的NK细胞分群方式不但能够将NK细胞划分为四个更加精细的、功能迥异的细胞亚群，同时有利于统筹分析来自人和鼠的NK细胞免疫参数，便于利用小鼠模型重构疾病模型探索NK细胞的作用机制^[5]。已经证实CD11b⁺ SP细胞亚群表现出很强的细胞毒作用，CD27⁺ SP和DP NK亚群则通过分泌细胞因子发挥免疫调节效应，而DN NK细胞亚群表现出未成熟的免疫表型和潜在的分化潜能，其杀伤与分泌细胞因子的功能都较弱，是一种无功能性的细胞亚群，主要介导免疫耐受。我们的研究表明HBV慢性携带小鼠肝脏中CD11b⁺ SP亚群比例明显下降，而DN亚群比例明显增加，提示具有杀伤功能的NK细胞亚群减少，介导免疫耐受的细胞亚群扩增，抑制机体通过NK细胞清除病毒，将有利于HBV慢性感染的形成。这提示在HBV慢性感染建立过程中，肝脏NK细胞亚群的重新分布可能在其中发挥了关键作用。同时，我们的研究表明HBV慢性携带小鼠脾脏中NK细胞的比例和亚群分布并未发生显著变化，但是肝脏中NK细胞亚群发生异常分布。这提示HBV慢性感染时，外周环境中的免疫状态并不能完全反映肝脏的异常免疫状态。

综上所述，不同NK细胞亚群发挥不同的免疫功能，HBV慢性携带小鼠肝脏中具有抗病毒功能的NK细胞亚群锐减、而介导免疫耐受的NK细胞亚群异常扩增，可能提示我们可以从细胞亚群的角度解释HBV慢性感染时NK抗病毒功能受损，将为我们进一步研究HBV慢性感染的发病机制提供新的线索。

作者贡献声明

张琼方：文献查阅、实验室检测、数据收集与分析和论文撰写；张大志：课题设计、质量控制和对文章的知识性内容作批评性审阅

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（30872250）

Fund program: National Natural Science Foundation of China (30872250)