肠道菌群失衡与非酒精性脂肪性肝病之间的关系

Abstract

With the improvement of living standards in recent years, the incidence rate of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) has kept increasing, with 15%-30% in general population and 50%-90% in obese population. The “second-hit” theory has been widely recognized as the pathogenesis of NAFLD. In-depth studies have found that intestinal flora imbalance may promote the progression of NAFLD by increasing energy absorption in the body, damaging intestinal mucosal barrier, and producing large amounts of toxic metabolites, which provides a new direction for exploring the pathogenesis of NAFLD and effective therapies. This article reviews the role of intestinal flora imbalance in the development and progression of NAFLD.

一、前言

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）指与肥胖和代谢综合征密切相关的代谢性肝病，包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）及其相关肝硬化和肝细胞肝癌。NAFLD在全球广泛分布，现已成为发达国家第一位肝病，普通成人患病率为20%～33%，其中NASH占10%～20%，相关肝硬化2%～3%。60%～90%肥胖症或70%以上糖尿病患者并发NAFLD，高脂血症患者达27%～92%。随着肥胖症和代谢综合征在全球的流行，亚洲国家近年NAFLD的患病率迅速上升且呈低龄化起病趋势^[1]。长期以来，人们对NAFLD的研究从未停止，但其具体发病机制尚未得到完全阐明。普遍认为NAFLD的发生与胰岛素抵抗、氧化应激等多种因素相关^[2]。最新研究发现肠道菌群失调在NAFLD发生、发展中起着至关重要的作用。

二、健康人群及NAFLD患者肠道菌群的差异

人类肠道菌群是一个复杂庞大的生态系统，由数量超过10¹⁴、5000多物种的细菌组成，其中绝大多数为厌氧型细菌[3]。肠道菌群的稳定对维持人体健康至关重要。它不仅能抵抗病原菌入侵，保护肠黏膜表面，刺激黏膜免疫的形成，还能发挥新陈代谢、管理储存宿主脂肪等多种功能^[4]。肠道菌群基因组十分庞大，是人类基因组的100余倍。这些菌株编码许多人类自身不具有的代谢相关基因，如与植物多糖消化相关基因，可增强宿主能量的摄取与吸收^[5]。肠道菌群的紊乱，常常导致一系列严重代谢相关疾病。

肠道菌群种系繁多，但在数量上占主导地位的仅几种，如厚壁菌门约占60%，拟杆菌门约15%，放线菌门约15%，疣微菌门约2%，变形菌门约1%，甲烷杆菌目约1%。因此，肠道菌群的失调常常表现为这些主要菌群的改变。早期研究结果表明，与健康人群相比，NAFLD患者体内厚壁菌门比例上升，拟杆菌门比例下降^[6]。最近报道NAFLD患者肠道内埃希氏菌属、厌氧杆菌属、乳杆菌属和链球菌属数量相对较高，这些菌群的改变与NAFLD患者血清脂多糖内毒素（lipopolysaccharide, LPS）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）α水平增高密切相关^[7]。

三、肠道菌群与机体能量代谢

大量临床观察证明能量摄取和利用的失衡及不良饮食习惯是NAFLD向NASH发展的关键因素^[8]。肠道菌群能够提高食物能量提取量，改变机体整体代谢，促进脂肪组织分解、产生更多游离脂肪酸^[9]。长期高脂饮食可诱导小鼠出现NAFLD，进入NASH阶段，并进一步向肝硬化及肝细胞肝癌发展，同时可见小鼠肠道菌群组成与结构发生改变。而食用高浓度果糖亦被证明可导致NAFLD的发生。

人们应用无菌小鼠最早将肠道菌群与机体能量代谢联系起来。Lim等^[10]将正常小鼠盲肠微生物群移植到无菌小鼠，14d后无菌小鼠体脂含量增加60%，并且出现胰岛素抵抗。提示肠道菌群能有效促进机体能量摄取与吸收。后续研究结果表明，该过程通过三种途径促进能量代谢与吸收。首先，该过程抑制了小肠上皮细胞表达禁食诱导脂肪因子。该因子是一种由小肠、肝脏及脂肪组织产生的循环脂肪酶抑制剂，能抑制循环脂肪酶活性增强，增加细胞对脂肪酸吸收，脂肪细胞甘油三酯的积累。其次，该过程伴随肝脏、骨骼肌AMP依赖的蛋白激酶水平增高，促进外周组织对脂肪酸的氧化，减少肝糖原的积累。宿主体内用于消化植物多糖的酶——糖苷水解酶活性有限，而肠道菌群能够合成大量该类酶，使得机体能够将复杂的糖类加工处理成单糖和短链脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）如乙酸、丙酸和丁酸^[4]。SCFA作为机体主要的能量来源，能增强肝脏自身脂质合成和甘油三酯的积累，同时也是肠上皮细胞、肠内分泌细胞和脂肪细胞G蛋白偶联受体的重要配体。通过与G蛋白偶联受体结合SCFA可增强胃肠激素如胰高血糖素样肽1和酪酪肽的分泌，直接或间接影响胰岛素和胰高血糖素的产生，调节食欲和食物的摄入^[11]。总之，稳定的肠道微生态多样性能有效限制肥胖，而品种少、热量高的饮食可改变肠道微生态多样性，导致肥胖^[12]。

四、受损的肠黏膜屏障如何加速NAFLD进程

大量研究结果表明肠道菌群改变和肠黏膜屏障破坏都可诱导NAFLD的发生^[8]。Rahman等^[13]喂食黏附分子基因缺陷小鼠（肠黏膜通透性增加）与正常对照小鼠高饱和脂肪、果糖和胆固醇。8周后，实验组小鼠出现严重的NASH症状，包括脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变和纤维化；而对照组小鼠只出现轻微脂肪变性。在NAFLD患者体内，肠道菌群的失调伴随着肠黏膜屏障的损伤，微绒毛呈现不规则状、紧密连接明显变宽。受损黏膜的通透性增大，促进细菌易位，细菌及其代谢产物如LPS、细菌DNA等大量涌入肝脏，导致肝炎性反应甚至纤维化。在一些NAFLD患者体内可见到炎性相关链球菌属数量增加，如牛链球菌和粪链球菌。这些细菌与炎性肠病相关，这使得他们成为潜在的炎性细菌，促进炎性细胞因子如TNF α、白细胞介素（interleukin, IL）-6、干扰素γ等增加^[7]。

五、肠道菌群及其代谢产物在NAFLD发生过程中的作用

1.丁酸的保护作用：肠道菌群拥有人类所不具有的多种代谢基因，能帮助宿主消化吸收许多难吸收物质，同时产生许多代谢产物，包括多种短链脂肪酸。肠道微生群的构成决定了短链脂肪酸的水平和比例，如丁酸和丙酸。丁酸是结肠的主要能量来源，肠道微生态失衡将直接降低丁酸代谢水平^[14]。丁酸能够促进肠黏膜密封蛋白、紧密连接蛋白-1、转录因子SP1与启动子之间的交互作用。它不仅能够增加肠黏膜紧密连接，降低通透性，对肠黏膜机械性损伤亦具治疗作用^[15，16]。在高脂饲料中加入丁酸盐后，小鼠的肥胖及胰岛素抵抗症状减弱，这可能下调过氧化物酶体增殖物激活受体-γ，促进脂肪酸合成向脂肪酸氧化过程的转变。丁酸代谢的减少将严重降低机体对高脂饮食所致代谢紊乱的抵抗能力^[17]。

2.LPS的毒性作用：肠道细菌的产物，如LPS、肽聚糖、细菌DNA、RNA等，具有潜在的肝毒性，能促进肝脏炎症及纤维化进程。这些细菌产物作用于细胞表面多种模式识别受体激活细胞，产生一系列炎症反应。其中，以LPS及细菌Cp G DNA引起的效应最为显著。LPS作用于Toll样受体（toll-like receptor, TLR），介导炎症信号通路，直接参与NAFLD的病理进程，其中又以TLR4信号通路为主^[18]。TLR4表达于不同细胞表面，包括肝细胞、单核细胞、枯否细胞以及肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）。LPS通过与细胞表面LPS结合蛋白及CD14结合，激活TLR4，TLR信号通过My D88激活TRAF6等过程，使核转录因子κ B（nuclear factor- κ B, NF-κB）和转录因子激活蛋白1活化，促进TNFα、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等炎性细胞因子的产生。同时，LPS亦可通过My D88非依赖途径促进下游干扰素1β的高表达^[19]。

LPS可通过直接和间接两条途径激活HSC。首先，肠道来源的大量LPS可刺激枯否细胞产生大量转化生长因子（transforming growth factor, TGF）β。体内和体外研究结果均证明TGFβ是最重要的促纤维化因子，其能激活HSC，加速肝脏纤维化进展。其次，LPS可直接作用于HSC表面的TLR4而激活HSC。一方面，活化的HSC分泌CC趋化因子配体2（CC chemokine ligand 2, CCL₂）和CCL₄等趋化因子，招募枯否细胞，后者分泌TGFβ促进肝纤维化；另一方面，LPS通过下调TGFβ负向调节受体Bambi的功能，提高HSC对TGFβ的敏感性，进一步加速肝脏纤维化的进程^[11]。

3.肠道细菌DNA：Gäbele等^[20]通过结扎小鼠胆管，与健康小鼠相比，发现缺乏TLR9的小鼠肝脏巨噬细胞趋化因子-1和胶原表达水平降低，肝纤维化程度变轻，表明TLR9在NAFLD进程中起着重要作用。已知TLR9是细菌DNA唯一受体，主要表达于机体免疫细胞，包括树突细胞、单核细胞及B淋巴细胞，但也可在肝细胞、肝窦内皮细胞、HSC及枯否细胞内检测到。细菌DNA富含Cp G序列，与细胞表面TLR9结合后，通过MYD88招募和激活下游NF-κ B等信号分子，促进炎症分子表达^[11]。在高脂饲料诱导NASH小鼠模型中，与野生型小鼠相比，缺乏TLR9小鼠肝脏病变程度更轻，肝脏内多种炎症相关的细胞，包括枯否细胞，炎性基因表达程度更低。对野生型小鼠使用TLR7-9拮抗剂，可降低肝脏炎性因子的表达及改善小鼠NASH的症状^[21]。在小鼠NASH模型中，细菌DNA与枯否细胞表面TLR9结合后，My D88依赖途径上调IL-1 β表达。IL-1 β可促进肝细胞脂质沉积、加速肝细胞死亡。同时，IL-1 β可通过活化HSC，上调Ⅰ型前胶原和金属蛋白酶组织抑制剂1等促纤维化基因及下调Bambi表达，加速肝纤维化^[11，22]。

六、有关NAFLD较新的治疗方案

1.养成良好的生活习惯：随着对NAFLD认识的深入，人们找到了许多针对NAFLD切实可行的治疗方法，诸如抗生素、益生菌、益生元、合生元、粪菌移植等。临床上NAFLD的治疗方案虽多，但对缓解症状、扭转组织学改变的效果难以肯定。养成良好的生活习惯，改变饮食结构、坚持长期锻炼才是最为有效的预防措施^[9]。不健康的生活习惯如摄入过多饱和脂肪酸、高糖、食盐、乙醇，加之精神过度紧张、生活长期不规律等常导致一系列代谢相关疾病，包括超重、肥胖、高血糖（糖耐量低下或糖尿病）、高血压、高血脂（脂代谢紊乱）等^[23]；可直接或间接造成肝功能损伤。定期适当的有氧运动有助于缓解压力，消除不良情绪，更可以减轻体质量，降低体脂含量，增加机体带氧量，预防一系列肥胖相关疾病。饮食结构对肠道微生物群的组成拥有至关重要的影响。目前，对于NAFLD患者应遵循一个什么样的饮食结构还没有达成共识，但增加摄入ω-3脂肪酸，推荐食用健康食物，如水果和蔬菜。同时，NAFLD患者应减少摄入饱和脂肪酸、碳水化合物饮料（含有果糖）^[24]。这些改变有利于患者减轻体质量，缓解体内代谢紊乱状况，恢复机体稳态。

2.抗生素：调控肠道菌群能有效改善代谢紊乱，并有可能成为肥胖及相关代谢疾病的潜在治疗方案。Bergheim等^[25]供给C57BL/J6小鼠30%的果糖饮水，8周后小鼠门静脉血液内毒素水平、脂质过氧化及TNF α表达水平明显升高，而伴随抗生素治疗（如多黏菌素B和新霉素）的果糖喂养小鼠的肝脂质积累明显减少。然而，并非所有研究结果均支持抗生素治疗。一项随机对照试验表明抗生素并没改善人类肥胖相关的代谢疾病，抗生素治疗对于一个肠道菌群具有恢复力的人来说，在代谢指标上没有达到长期或短期的观察要求^[26]。因此，抗生素对于NAFLD的治疗效果有待进一步验证。

3.益生菌与益生元复合制剂：益生菌分布广泛，种类繁多，用于人体的主要分为三大类，乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和部分革兰阳性球菌。益生元是膳食调节剂，具有刺激益菌群生长的作用。多项研究结果表明益生菌对NAFLD具有治疗效果，而益生元常与益生菌联合使用，以复合制剂治疗NAFLD。Raso等^[27]使用拟干酪乳杆菌B21060株同时给予阿拉伯半聚乳糖和低聚果糖，结果显示大鼠NAFLD肝硬化程度明显减轻，血清TNF α及IL-6水平明显下降。益生菌可有效降低患者血清氨基转移酶、总胆固醇和TNF α的水平，提示患者肝功能得到改善。然而，尽管在益生菌治疗NAFLD领域有许多文献可供查询，亦有多项实验肯定益生菌的治疗效果，但由于不同实验所用的动物模型和菌株均不相同，所以很难评估益生菌对NAFLD的实际效用。

4.奥贝胆酸：奥贝胆酸（obeticholic acid, OCA）属法尼醇X受体（farnesoid X receptor, FXR）激动剂，通过活化FXR，间接抑制人重组细胞色素P450家族成员7A1的表达。由于它是胆酸生物合成的限速酶，因此，OCA可以抑制胆酸合成。胆酸是人类四种胆汁酸中含量最丰富的一种。胆汁酸经肠道菌群转换能变成更具疏水性的脱氧胆酸（deoxycholic acid, DCA）。DCA细胞毒性强，能破坏肠黏膜屏障，增加肠黏膜通透性，促进肠道菌群及其产物移位^[28]。与正常小鼠相比，喂食高脂饲料小鼠粪便中DCA的浓度增加近十倍。Úbeda等^[29]给予肝硬化大鼠OCA治疗2周，证明OCA能有效减少肠道细菌移位（从78.3%到33.3%）。Neuschwander-Tetri等^[30]报道OCA能有效改善NASH患者组织学特征，包括肝脏纤维化；患者血清ALT和AST降低并伴体质量减轻，证明患者肝功能得到改善，但停药后这几项指标均上升。值得注意的是，患者血清胆固醇总量增高，出现低密度脂蛋白增高，高密度脂蛋白降低现象，因此，临床上冠心病患者需慎用。同时，OCA治疗有一定的不良反应，3%实验组患者出现严重的皮肤瘙痒，具体原因有待进一步研究。Mudaliar等^[31]也证明OCA能够有效改善患2型糖尿病和NAFLD患者肝脏的炎症和纤维化，且具有增加胰岛素敏感性的功效。OCA是目前临床唯一证明能改善NAFLD患者肝纤维化的药物，对NAFLD具有一定治疗效果，但因存在一定的不良反应，故临床需考虑个性化使用^[32]。

利益冲突

无

作者贡献声明

马明剑：起草文章；吴健：审阅文章内容，修改全文、定稿

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（81572356）;科技部政府间创新合作重点项目（2016YFE0107400）

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