Toll样受体4与肝脏缺血再灌注损伤

Abstract

Toll-like receptor 4 (TLR4) is a member of the toll-like receptor family and belongs to the family of pattern recognition receptors. The role of TLR4 signaling pathway in liver ischemia-reperfusion injury has been widely studied in recent years, and its control methods in inflammatory response is becoming the most important research hotspot. In this paper, the research progress of the molecules and their regulatory mechanisms involved with TLR4 signaling pathway in liver ischemia-reperfusion injury is reviewed, which act as a new foundation of clinical research to study the pathogenic mechanisms and treatment plan.

肝移植是治疗终末期肝病的唯一有效手段^[1-2]。肝缺血再灌注损伤（hepatic ischemia reperfusion injury, HIRI）是手术中肝脏经历缺血过程后，血供恢复时，肝脏损伤进一步加重的现象^[3]，是影响手术成功率及患者预后的重要因素，随着供肝严重短缺，选择的边缘供肝更易受到缺血再灌注损伤的影响^[4]。因此，深入探索HIRI的发生机制及保护机制，对指导临床具有重要意义。

HIRI是涉及多种复杂因素的病理生理过程，包括细胞内钙超载、氧自由基损伤、内皮细胞和枯否细胞激活、多种细胞因子参与及微循环障碍^[3,5]。在分子机制方面，Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）与HIRI之间有着密切的联系，TLRs是启动HIRI固有免疫的重要调节因素，在识别HIRI产生的内源性配体中发挥关键作用，其中与HIRI病理生理关系较为紧密的是TLR4，随着不断深入研究TLR4在HIRI病理生理过程发挥的作用机制，发现TLR4主要通过免疫途径及炎症途径参与HIRI^[6]。

一、TLR4及其信号通路

（一）TLRs的概述

TLRs首次在果蝇中被发现，是一组进化上保守的Ⅰ型跨膜蛋白，包含具有受体特异性富亮氨酸重复序列（leucine-rich repeats, LRRs）的胞外结构域，与白细胞介素（interleukin, IL）-1受体相似的高度保守的细胞结构域；TLRs有13个家族成员，TLR1～TLR13，是一类模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）家族，位于细胞表面与致病性配体相互作用或在细胞内核内体中与致病核酸相互作用；通过识别病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）和损伤相关分子模式分子（damage-associated molecular pattern molecules, DAMPs）启动固有免疫应答，在发育、免疫反应、组织损伤和炎症反应中发挥重要作用^[7-9]。配体介导的TLRs激活下游衔接子分子：髓样分化因子88（myeloid differen-tiation factor, My D88）、髓系Toll/白细胞介素-1受体（Toll/interleukin-1 receptor, TIR）结构域诱导干扰素β衔接蛋白（Toll/IL-1 receptor-domain containing adaptor protein inducing interferon-β, TRIF）和TRIF相关的衔接分子（TRIF related adaptor molecule, TRAM）。细胞表面的TLR1、TLR2、TLR5～TLR9仅以My D88为衔接分子启动信号转导，TLR3仅以TRIF为衔接分子启动信号转导，而TLR4能以两种衔接分子启动信号途径^[7,10]。研究证明TLRs参与多种生理病理反应，如免疫应答、上皮再生及肿瘤发生等^[11-12]。

（二）TLR4的概述

1.TLR4的结构、配体：TLR4是发现的第一个哺乳动物TLR，表达于造血细胞和非造血细胞表面，主要由细胞外LRRs、疏水性膜内结构域和胞质内TIR结构域组成；其主要的配体包括PAMPs（即外源性配体）：细菌、真菌、病毒及植物等含有的脂多糖（lipopolysaccharide）、葡萄糖醛酸甘露聚糖、肺炎衣原体热休克蛋白（heat shock protein, HSP）60等；和DAMPs（即内源性配体）：透明质酸、二聚糖、纤维蛋白原、硫酸乙酰肝素、高迁移率家族蛋白1（high mobility group box 1 protein, HMGB1）、HSP22、HSP60、HSP70、HSP72等，大多数是TLR4/髓样分化2（myeloid differentiation 2, MD2）受体复合物的激动剂^[7,10]。TLR4识别外源性PAMPs脂多糖时，通过与脂多糖相互作用形成TLR4/MD2受体复合物，与TLR4的胞外结构域非共价结合，配体活化；TLR4同样识别损伤组织和坏死细胞释放的内源性DAMPs，通过与受损组织和坏死细胞相互作用而诱导强烈的促炎反应TLR4。TLR4具有较其他TLRs更广泛的功能，参与免疫调节、炎症及肿瘤发展等，在多方面都有广泛研究^[10]。

2.TLR4信号通路：TLR4信号通路由配体诱导的受体二聚体触发，TLR4与配体结合之后，发生TLR4/MD2复合物的二聚化，涉及两种信号通路：TLR4的TIR结构域招募含有TIR结构域的衔接蛋白My D88和My D88衔接样（My D88 adaptor like, MAL）蛋白（My D88依赖性途径）或TRIF和TRAM蛋白（TRIF依赖途径）。TIR结构域是TLRs调节固有免疫的关键分子，所有哺乳动物类TLRs C端均含有TIR结构域，TIR结构域的同源或异型二聚化是启动下游信号传导所必需的^[7]。

My D88依赖途径：TLR4/MD2复合物与My D88的TIR结构域结合后激活My D88，形成活性TLR4/My D88复合物，激活IL-1R相关激酶1（IL-1R-associated kinases 4, IRAK4），使IRAK1和IRAK2磷酸化后与肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）受体相关因子6（TNF-receptor-associated factor 6, TRAF6）结合，进而激活转化生长因子激酶1（transforming growth factor β-activated kinase 1, TAK1），TAK1激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPKs）和细胞核因子κB抑制物激酶复合物（IκB kinase complex, IKK）；MAPKs进而激活JUN N端激酶（JUN N-terminal kinase, JNK）、p38、细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases, ERK1/2），进而活化转录因子激活蛋白-1（activator protein 1, AP-1）；IKK激活核因子κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）；这些重要的转录因子易位到核内促进促炎性细胞因子的产生^[13]。

TRIF依赖途径：TLR4/MD2复合物与TRIF和TRAM的TIR结构域结合后，激活TNF的活化受体相关因子TRAF，通过TRAF3募集TANK结合激酶1（tank-binding kinase 1, TBK1）、IKKε，随后诱导转录因子干扰素调节因子（interferon regulator factor, IRF）3的核内激活和易位，TRIF依赖途径诱导Ⅰ型干扰素的产生^[13]。

二、肝缺血再灌注损伤

HIRI分为热缺血再灌注损伤和冷缺血再灌注损伤，热缺血再灌注损伤多发生于肝切除术中，冷缺血再灌注损伤多发生于心脏死亡器官捐献供肝移植中，HIRI发生时，会迅速引起急性炎症反应，造成严重的肝细胞坏死、凋亡和肝功能障碍^[14]；再灌注期间，从凋亡和坏死细胞释放的DAMPs刺激枯否细胞产生炎性介质，如趋化因子、细胞因子和活性氧类物质（reactive oxygen species, ROS），进而通过协调嗜中性粒细胞的归巢来刺激下一阶段的再灌注损伤^[3]。研究表明热缺血造成的损伤较冷缺血造成的损伤更严重，热缺血通常对细胞和分子途径有害，热缺血诱导的ROS生成及许多炎症介质的释放促进并加重再灌注早期导致的损伤^[15]；因此热或冷缺血造成的缺血再灌注损伤（IRI）均与炎症反应及ROS损伤有密切关系，是HIRI发生的主要病理生理机制。

三、HIRI中TLR4信号通路的调节

TLR4表达于各型肝细胞，在无菌性炎症级联反应导致的IRI中发挥关键作用^[13-14]。IRI导致肝脏无菌性炎症、炎症细胞活化、大量ROS产生、微循环障碍等可损伤肝细胞及内皮细胞并释放DAMPs^[16]。DAMPs结合到固有免疫细胞表面TLR4上，通过TLR4下游产生的前炎症细胞因子和趋化因子触发炎症级联反应，最终导致中性粒细胞、T淋巴细胞聚集和肝脏坏死^[14,16]，以及大量的促炎细胞因子产生如TNF和IL-1，这些细胞因子在介导肝脏缺血再灌注损伤中发挥重要的作用^[3]。TLR4信号途径在HIRI的发病机制中具有重要作用，也是导致细胞因子释放的主要途径，Ben-Ari等^[17]发现TLR4基因缺陷型小鼠发生肝脏HIRI后，体内肝酶谱、肝TNF-α、IL-1β水平及肝细胞凋亡显著低于野生型小鼠，但两者肝JNK和NF-κB的表达水平无差异，下调TLR4的表达和功能可显著改善HIRI，因此，TLR4可成为预防HIRI的潜在干预靶点^[17]。

Nasiri等^[18]研究了TLR/衔接子/干扰素调节因子/细胞因子轴在部分HIRI肝再生过程中的基因表达谱，发现肝脏和外周血细胞中TLR2、TLR4/My D88和TRIF/IRF1、IRF3、IRF5、IRF9以及p65/TNF-α、IL-1β、I-6基因的伴随转录激活在HIRI后肝脏再生的不同阶段具有协同作用，提示了HIRI后不同阶段参与肝脏修复的TLR信号通路变化的复杂性。IRF5是TLR4-My D88依赖性信号通路的主要转录因子，也是TLR4-My D88信号通路激活促炎细胞因子的主要调节因素，研究发现激活TLR4/IRF5信号通路轴可能在早期HIRI早期炎症阶段发挥必要的作用，强效抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可抑制TLR4/IRF5信号通路及其下游的促炎细胞因子，被认为是改善HIRI的一种可能机制，更为临床肝移植中发生的HIRI提供治疗靶点^[16]。

高迁移率族蛋白1（high-mobility group box 1, HMGB 1）是一种进化上保守的核蛋白，参与DNA的组装和转录调控，并与自噬和炎症体活化有关；其扮演重要的DAMPs分子，通过诱导释放细胞因子和招募白细胞触发并维持炎症反应，在评估肝移植中供肝质量及预测供肝早期命运方面具有重要价值^[19-20]。HMGB1是TLR4导致IRI中炎症免疫活化的关键内源性配体，是HIRI中研究最为广泛的DAMPs^[21-22]，在HIRI期间，HMGB1主要由过度产生ROS的肝细胞释放，肝细胞持续主动分泌HMGB1进入循环，HMGB1结合TLR4导致衔接子TRAM和TRIF的募集，其随后诱导转录因子IRF3的核转移以引发Ⅰ型干扰素如干扰素β的产生^[23]。

CD14是一种糖蛋白，主要表达于巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突状细胞，参与TLR4/MD2识别脂多糖，介导热缺血再灌注诱导的损伤和炎症，与HIRI密切相关^[24]。

四、阻断TLR4信号通路改善HIRI

HMGB1通过与TLR4相互作用是HIRI的关键介质，抑制HMGB1与TLR4的结合可改善HIRI，TLR4受体拮抗剂通过拮抗HMGB1-TLR4相互作用，干扰HMGB1的表达和释放，减弱HMGB1对先天免疫细胞的细胞因子样作用，阻断TLR-TRAM/TRIF-IRF/干扰素轴进而减轻HIRI，显著改善了IRI导致的急性肝损伤^[6]。另外，重组人血栓调节蛋白可下调NF-κB的活化进而减少HMGB1的表达和分泌，减轻肝细胞损伤，下调前炎症因子表达，减少细胞凋亡，发挥改善HIRI的作用^[25]。丹参酮IIA通过下调枯否细胞中的HMGB1-TLR4/NF-κB途径来减弱由肝移植物引起的IRI，提示其在肝移植期间预防HIRI的潜在作用^[26]；同样维格列汀也是通过下调HIRI时TLR4/NF-κB/HMGB1通路发挥肝细胞保护作用的^[27]。但Sakai等^[28]发现上调NF-κB的表达对HIRI具有保护作用，是通过诱导Bcl-2基因的表达上调，抗氧化，抑制细胞凋亡通路，并非通过对抗炎症通路发挥保护HIRI的作用。

敲低核转录因子HMGB1的表达显著降低了肝缺血期间HMGB1的核质转移程度和再灌注后HMGB1释放程度，显著改善HIRI。另外，HMGB1-si RNA预处理显著抑制肝移植再灌注后肝内TLR4的表达，进而HMGB1下调了缺血诱导的HMGB1释放，防止HIRI^[29]。研究发现烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, NOX）在枯否细胞中高表达，是HIRI损伤过程中ROS产生的重要酶，通过增加的ROS产生刺激TLR4和HMGB1的表达，这种恶性循环可能加重HIRI；因此，抑制NOX2，下调HMGB1-TLR4相互作用，可能成为预防严重HIRI损伤的临床工具^[23]。

研究表明外源性mi R-148a可通过间接去磷酸化TAK1和IRF3，参与TLR4信号途径减轻HIRI，可能成为保护肝脏的一种有前景的生物策略^[30]。

五、展望

综上所述，TLR4以及其介导的信号通路在HIRI中具有重要的作用。对TLR4和其配体的调控及其对TLR4介导的信号通路的调控均能显著改善肝功能，具有对抗HIRI的作用。目前TLR4在HIRI中作用的研究主要停留在动物模型上的研究，深入研究其信号通路中的各个环节，将为TLR4在人体HIRI发生和发展及治疗中的作用提供实验依据，为临床中各种肝病发生的IRI治疗提供新的启迪及可靠的治疗靶点。

作者贡献声明

杨柳：综述；宋红丽：审校

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（81670574、81270528、81441022）

Fund program: National Natural Science Foundation of China (81670574, 81270528, 81441022)