肝硬化与肝癌临床细胞治疗进展与展望

Abstract

The treatment options for liver cancer and liver cirrhosis are limited. Cell therapy (immune cells, stem cells) can significantly improve the therapeutic effect by actively regulating body's immunity. In addition, when choosing different methods of cell therapy, clinicians should also fully consider the adverse reactions associated with cell therapy. This article reviews the progress of cells therapy in clinical trials of liver cancer and liver cirrhosis,including therapeutic mechanism, advantages, disadvantages and limitations.

各种病因导致的肝硬化、肝癌严重影响患者的生存时间和生活质量。免疫检查点抑制剂的成功应用显示免疫治疗在该领域的广泛应用前景。细胞治疗作为免疫治疗的重要组成部分，在疾病治疗中占有重要位置。本文将对目前临床细胞治疗在肝癌和肝硬化方面的进展与前景择要简述。

一、肝硬化的干细胞治疗

肝硬化是不同病因引起的肝纤维化终末阶段，药物治疗效果不佳。目前，肝移植仍是治疗晚期肝病最有效的治疗方法，然而，由于供肝的缺乏，高昂的治疗费用等问题，亟需寻找可以广泛应用且安全有效的替代方案。细胞治疗在基础及临床研究上取得了突出的成绩，是极有潜力的新兴治疗方式。

1.骨髓干细胞：1999年Petersen等^[1]在肝损伤大鼠模型中发现骨髓干细胞能够在肝脏内转化为肝卵圆细胞，甚至成熟的肝细胞和胆管细胞，由此拓展了干细胞在肝损伤修复中的应用。2000年，Alison等^[2]在接受男性供者骨髓细胞的女性患者肝脏内检测到Y染色体阳性的肝细胞，证明了干细胞移植在肝细胞转化方面的可行性，随后的一系列动物实验使人们逐渐认识到骨髓细胞可能在减少肝纤维化并刺激肝脏再生，改善肝脏的合成功能，减轻肝损伤，提高生存率方面拥有巨大潜能^[3]。

2010年，Salama等^[4]应用粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor, G-CSF）动员，收集骨髓干细胞通过肝动脉或门静脉回输，治疗36例慢性丙型肝炎肝硬化，结果患者白蛋白（albumin, Alb）升高，胆红素（bilirubin, BIL）和血清天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase, AST）下降，国际标准化比值（international normalized ratio, INR）恢复正常，腹水明显减少。Lyra等^[5]通过分离患者骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cells, BM-MNC）经肝动脉回输治疗2例由慢性丙型肝炎、4例慢性丙型肝炎合并酒精性肝炎导致的肝硬化，提示有一定效果。然而，一项多次输注G-CSF动员CD133⁺自体干细胞治疗肝硬化的多中心、Ⅱ期、开放标签、随机对照临床研究，未证明单独使用G-CSF或G-CSF加干细胞输注在肝硬化中可以带来临床益处，并且可能引起不良事件发生率增高，未来的进一步研究需要提高警惕^[6]。

2.间充质干细胞：间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）是来源于中胚层具有多向分化潜能的干细胞，能行使组织修复以及免疫调节等生物学功能。且其提取来源广泛，在骨髓、脐带组织、脐带血、脂肪组织等部位均有分布。

以往观点认为，MSC通过分化为肝细胞样细胞，补充受损肝脏功能，而目前认为还可通过其旁分泌机制改善局部受损组织微环境^[7]。在肝硬化损伤过程中，局部免疫过度激活，MSC分泌白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）、转化生长因子- β 2(transforming growth factor β 2,TGF-β 2）等诱导调节性T淋巴细胞（regulatory T cells, Treg）细胞产生，同时直接或间接抑制Th17细胞增殖，减少IL-17、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-6等炎性因子产生，减轻肝脏局部过度炎症反应，维持肝细胞的存活与再生，改善肝脏炎性状态^[8,9]。另外，在改善肝纤维化方面，MSC通过诱导肝星状细胞凋亡并抑制其激活，同时分泌肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）等抑制ECM沉积，为MSC改善肝纤维化提供了理论基础。

Mohamadnejad等^[10]最早报道了MSC在治疗病毒性肝炎相关肝硬化的应用，4例慢性乙型肝炎失代偿期肝硬化患者给予自体骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSC）输注治疗，安全性良好，临床症状和生活质量明显改善，终末期肝病模型（model for end-stage liver disease, MELD）评分降低。我们团队应用脐带来源的MSC治疗慢性乙型肝炎失代偿期肝硬化共30例，脐带来源间充质干细胞（umbilical cord-derived mesenchymal stem cell, UC-MSC）通过外周静脉输注，结果显示UC-MSC治疗安全性好，腹水量明显减少，血清白蛋白水平增加，总胆红素水平降低，MELD评分降低^[11]。

针对其他病因诱导的肝硬化，Suk等^[12]纳入72例患者，应用自体BM-MSC治疗酒精性肝硬化进行了一项多中心、随机、开放标签的Ⅱ期临床研究，结果显示BM-MSC治疗可以明显改善肝脏纤维化，肝脏胶原的比例显著减少，Child-Pugh评分明显改善。孙凌云团队应用MSC治疗多种自身免疫性疾病（原发性干燥综合征、原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cirrhosis，PBC）、混合性结缔组织病、系统性硬化症、类风湿性关节炎等）导致的肝硬化患者共26例，安全性良好，血清Alb、凝血酶原时间（PT）、MELD评分等指标在随访的2年时间内均明显改善^[13]。我们团队^[14]应用UC-MSC治疗对熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid, UDCA）治疗无效的7例PBC患者，患者无明显不良反应，疲劳、瘙痒等症状明显减轻，同时血清碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）和γ-谷氨酰转移酶（GGT）明显下降，说明UC-MSC对该类患者有一定的疗效。

目前的基础研究和临床试验结果均显示出细胞治疗在肝硬化治疗方面的巨大潜力，已有多项临床实验在Clinical Trials网站上注册（NCT03945487、NCT03209986等）。另外，还有诸如巨噬细胞等尚未进入临床试验的治疗方式有待进一步研究。

二、肝癌的细胞治疗

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）发病率在世界范围内呈上升趋势，病死率高。由于发病隐匿，大多数HCC患者发现时多为晚期，传统治疗方法复发风险高，长期预后差。因此，通过免疫治疗主动提升患者的抗肿瘤免疫功能或许是提高患者预后的有效方法。

免疫治疗中，免疫检查点抑制剂已经成功地用于多种肿瘤的治疗，但有效率也仅有10%～40%，部分病例对免疫检查点抑制剂治疗耐受^[15]。更有研究表明，部分患者应用免疫检查点抑制剂不会引起特异性T细胞反应，或无法有效靶向肿瘤^[16]。

细胞治疗是利用宿主免疫系统主动攻击肿瘤，可与包括免疫检查点抑制剂在内的其他治疗方法联用，特异性攻击肿瘤细胞。目前已有许多细胞治疗的相关临床试验正在开展，2017年，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准CD19特异性嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T-cell, CAR-T）用于治疗晚期B细胞淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病。目前获批的产品主要集中于血液系统肿瘤，在实体瘤治疗方面仍有许多待攻克的问题。

（一）适应性免疫细胞治疗

1.基因修饰T细胞：研究表明，应用传统方法治疗HCC，复发率与肿瘤中淋巴细胞浸润水平和外周血中肿瘤抗原特异性T淋巴细胞比率均呈负相关，提示肿瘤特异性T细胞在HCC治疗中的巨大潜能。通过基因修饰的方法，提高T细胞识别的特异性是目前的研究热点，主要包括两类，即CAR-T和TCR-T，二者均能特异性识别肿瘤抗原，并具有较强的杀伤活性^[17]。

2.CAR-T细胞是通过引入嵌合肿瘤抗原受体实现的基因工程T细胞，可以特异性识别肿瘤相关膜表面抗原，并以非主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）限制性的方式清除肿瘤细胞。同时，通过增加共刺激信号分子，实现了更强的抗肿瘤作用。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3,GPC3）是HCC特异性靶点，它在HCC中高表达，但在正常组织中表达较少^[18]。2014年，李宗海团队首次报道构建GPC3为靶点的CAR-T细胞在体外特异性杀伤GPC3阳性HCC细胞，显著延长HCC异种移植模型的存活时间^[19]。其后纳入13例患者进行的Ⅰ期临床研究显示，该治疗延缓了HCC的进展，且安全性良好^[20]。目前可供选择的CAR靶标信号分子有限，并且这些抗原也可低表达于机体的正常组织器官，造成CAR-T的“误伤”，即脱靶效应。虽然目前动物和小样本的临床试验未观察到严重的不良反应，但在后期临床试验中，如何减少或避免发生，以及发生后如何治疗该类不良反应，仍是不可回避的问题。除了GPC3，针对其他HCC相关抗原的CAR也正在研究中。CD133是高表达于HCC表面的跨膜糖蛋白，与HCC分期、转移、预后有关，韩卫东团队进行了针对CD133的CAR-T治疗（CART-133）Ⅰ期临床研究，结果表明其用于CD133阳性、晚期转移HCC患者的可行性、有效性，不良反应方面主要集中于胆系毒性，且CD133缺乏一定的肿瘤限制性，纳入患者时需谨慎^[21]。已有针对上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule, Ep CAM）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）等靶标的特异性CAR-T方案在Clinical Trials网站上注册（NCT02905188，NCT02395250，NCT02723942等），未来研究中治疗有效性和安全性的结果令人期待。

3.TCR基因修饰的T细胞：不同于CAR-T，TCR基因修饰的T（TCR-T）细胞主要识别加工后MHC呈递的胞内抗原，具有MHC限制性。胞内抗原在肿瘤细胞中与正常细胞差异较大，靶点种类数量多，可以选择亲和力适中、安全性好的抗原作为特异性靶点，形成了TCR-T的独特优势。2015年，Antonio实验室构建了针对乙型肝炎病毒（HBV）的特异性T细胞受体（TCR）修饰的T细胞，以病例报告的形式阐述了治疗过程。该研究发现患者的肿瘤细胞上可表达HBV-HLA-Ⅰ类分子复合物，HBV特异性TCR-T在体内存活、扩增并使HBsAg水平的大幅降低，且不会加剧肝脏炎症，也无明显脱靶效应，证实了该治疗对HCC的安全性、可行性和潜在的抗肿瘤效果^[22]。此后，国内启动了两项相关临床试验，采取逐渐加量的HBV/TCR-T输注，治疗（NCT02719782）和预防（NCT02686372）肝癌复发。Antonio团队随后的研究证实，无完整HBV抗原表达的HCC细胞整合有短HBV DNA片段，编码并提呈后可被T细胞识别并激活；对整合HBV DNA的分析可指导HBV特异性TCR的正确筛选，并选用于TCR-T的构建^[23]。2016年，Spear等^[24]提出了一种针对丙型肝炎病毒抗原的TCR基因修饰T细胞，可以有效治疗丙型肝炎相关性肝癌。一项评估AFPc332特异性TCR-T在HLA-A2阳性晚期肝癌患者中的安全性和抗肿瘤活性的Ⅰ期开放标签临床试验（NCT03132792）目前正在招募受试者。

4.基因修饰T细胞治疗面临的问题：不同于最早应用基因修饰T细胞治疗的血液肿瘤，基因修饰T细胞在治疗HCC方面面临着许多实体肿瘤治疗共有的问题，如肿瘤体积过大、归巢不足、抗原的选择以及实体肿瘤内的免疫抑制微环境等，均可能是导致基因修饰T细胞疗效欠佳的原因。为了解决这些障碍，目前常用的解决思路，一般包括将趋化因子受体导入CAR-T细胞，使用串联CAR-T细胞靶向多种抗原，以及联用免疫调节剂等，但是上述治疗在HCC中的效果仍需更多的验证。另外，在治疗中不良反应方面，诸如细胞因子释放综合征、神经毒性以及脱靶效应等，也是在研究过程中需要解决的问题。

5.肿瘤浸润淋巴细胞：肿瘤浸润淋巴细胞治疗是从切除的肿瘤中分离和体外培养的淋巴细胞，比基因工程T细胞具有更多的肿瘤特异性TCR。该治疗主要问题在于提取分离困难和扩增激活时间长，虽然最新研究已经有所改善，但在HCC中尚缺乏应用，是潜在的细胞治疗方式。

6.树突状细胞（dendritic cells, DCs）：一些研究探讨了DCs作为肝癌癌症疫苗的作用，虽然实验结果的临床疗效尚不能得出明确的结论，但在安全性方面未见明显不良反应。Palmer等^[25]进行的一项Ⅱ期临床试验，Hep G2体外刺激成熟自体DCs后回输，结果显示安全性、耐受性良好，放射和血清学上均显示出抗肿瘤效果，部分还产生了抗原特异性免疫反应。Lee等^[26]进行的随机、多中心、开放标签的Ⅱ期试验中，以DC为辅助免疫疗法降低了除射频消融术（radiofrequency ablation, RFA）以外的标准治疗方式的HCC患者肿瘤复发风险。另有研究表明，DC外泌体可作为新型疫苗在HCC小鼠模型中诱发抗原特异性抗肿瘤反应，重塑肿瘤微环境，拓展了DC的抗肿瘤应用^[27]。

（二）固有免疫细胞输注治疗

1.细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced killer, CIK）细胞：T细胞是抗肿瘤免疫反应的主要细胞，2000年有报道体外诱导的自体淋巴细胞能够降低HCC手术后的复发率，延长无复发生存期^[28]。CIK细胞属于NK样T淋巴细胞，同时表达CD3和CD56两种表型^[29]，由干扰素-γ、IL-2和抗CD3等体外诱导扩增，具有杀伤肿瘤活性和无MHC限制性。欧洲肝病学会在最新的HCC指南中将CIK作为可能有效治疗方式进行了推荐^[30]。目前，在Clinical Trials.gov网站上注册的CIK临床试验已有近百例。我们团队于2002年开始针对CIK治疗原发性肝癌的Ⅰ期临床试验，发现HCC患者的症状得到缓解，没有明显的不良反应。韩国学者针对CIK作为辅助方法治疗HCC的Ⅲ期临床试验中，延长了总生存率和无复发生存率。不良事件发生率较高，但严重不良事件发生率没有明显差异^[31]。对该疗法进行的5年随访观察，结果类似^[32]。在一项对226例患者的研究中，CIK细胞的应用无复发生存率增加了33%，全因死亡风险降低了67%，中位数随访时间为68.5个月。可见CIK细胞疗法可作为一种有效的辅助手段，治疗早期HCC，降低复发率并增加总生存率^[34]。而对于晚期HCC，由于肿瘤微环境中髓系抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cell, MDSC）与CIK细胞的相互作用，抑制了CIK的治疗效果，诱导免疫逃逸^[33]。在小鼠HCC模型中，已被FDA批准的磷酸二酯酶5抑制剂他达拉非，可用于阻止CIK细胞治疗后MDSC在肿瘤微环境中的积聚，提高其抗肿瘤效果^[33]。

2.NK细胞：NK细胞在肿瘤免疫中占有重要的一席之地，外周血和肝脏中NK细胞的频率和功能与HCC切除术后复发和生存率相关^[34]。有研究已经证明同种异体NK细胞在HCC治疗中的有效性，可改善晚期预后^[35,36]。此外，基因修饰的NK细胞具有对肿瘤细胞更高的特异性和有效性。将CAR导入NK细胞，降低了自身免疫反应和肿瘤转化的风险，且释放的细胞因子，比CAR-T细胞治疗产生的细胞因子风暴更安全。目前已有多项临床试验开展以证明治疗效果。

三、展望

目前的基础研究和临床试验结果均显示出细胞治疗在肝癌、肝硬化治疗方面的巨大潜力，但还有很多不足之处。基础研究方面，目前细胞治疗有效率较低，特异性靶点的选择、免疫微环境与效应细胞的相互作用、不同亚型治疗预后的判断、治疗安全性控制等问题均是有待突破的难点问题。临床研究方面，存在多为单中心、小样本临床研究，治疗方案各异且缺乏水平对照、随访时间较短、评价指标不一致等问题；在细胞制备方面，如何获得稳定、质量可控、能够满足临床需求的效应细胞，仍是需要改善的问题。治疗方案方面，输注细胞数量、最佳输注途径、最佳治疗时机、个体化治疗选择等问题尚待解决。目前，我国已颁布了《干细胞临床研究管理办法（试行）》，干细胞临床研究已实行临床研究机构备案和临床研究项目备案的双项备案制，免疫细胞的开展也已进一步规范，相信细胞治疗临床研究将会得到不断深入和有序的发展。希望在各方努力下，安全有效的细胞治疗能早日在临床推广应用。

作者贡献声明

刘凯、施明：撰稿；王立峰、王福生：审稿

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

基金项目：国家重点研发计划（2017YFA0105703）;国家自然科学基金创新群体项目（81721002）;国家自然科学基金（81571567）

Fund Program: National Key R&D Program of China(2017YFA0105703);Innovation Groups of the National Natural Science Foundation of China(81721002);National Natural Science Foundation of China(81571567)