应用CRISPR/Cas9技术构建跨膜蛋白超家族6成员2 E167K基因敲入小鼠模型

Abstract

Objective

To construct a transmembrane 6 superfamily member 2 (Tm6sf2) E167K gene knock-in mouse model.

Methods

The plasmid was constructed to simultaneously express the single-stranded guide RNA Cas9 at a specific site of the mouse Tm6sf2 gene in the donor plasmid carrying the Tm6sf2 E167K fragment. The above two plasmids were injected into the mouse fertilized eggs together. The positive F0 generation mice were validated by PCR detection and sequencing. The number of F2 generation surviving mice in three genotypes of wild (Wt), heterozygous and knock-in (KI) were calculated. Wt and KI male mice (8 mice/group) of F2 generation littermates were selected and given a normal diet for 8 weeks. The body weight of the mice was recorded every week, and the glucose metabolism and lipid metabolism indexes of the two mice were detected. The comparison between groups was performed with an independent sample t-test.

Results

Genotype detection and sequencing results showed that the Tm6sf2 E167K gene knock-in mouse model was successfully established. KI mice had absence of homozygous lethal embryo phenotype. The body weight of KI mice was higher than that of Wt mice during lactation, and the difference between the two groups was statistically significant (P＜0.05).The fasting blood glucose of KI mice (9.50±0.33)mmol/L was higher than that of Wt mice (7.80±0.30)mmol/L, and the difference between the two groups was statistically significant (P＜0.05). During the oral glucose tolerance test, the 2-hour blood glucose level of KI mice (9.20±0.51)mmol/L was higher than that of Wt mice (7.60±0.18)mmol/L, and the difference between the two groups was statistically significant (P＜0.05). The liver triglyceride content of KI mice (8.40±0.55)mg/g was higher than that of Wt mice (7.30±0.63) mg/g, but the difference was not statistically significant (P＞0.05). There was no significant difference in plasma triglyceride levels between the two mice (P＞0.05). The Oil red O staining results showed that KI mice had more lipid accumulation in the centrilobular region of liver than Wt mice.

Conclusion

Tm6sf2 E167K gene knock-in mice were successfully constructed. Tm6sf2 E167K gene knock-in can cause abnormal glucose metabolism in mice and promote the occurrence of hepatic steatosis.

随着肥胖及代谢综合征的流行，非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的发病率日益增高，亚洲普通成人NAFLD的患病率为28%～31%^[1]。在NAFLD患者当中，将有27%的比例会发展为非酒精性脂肪性肝炎患者^[2]，而后在10年内肝硬化的发生率高达25%^[3]。有研究结果显示遗传因素在NAFLD发生和发展过程中起到了重要的作用。一项外显子组关联研究的结果显示跨膜蛋白超家族6成员2基因（transmembrane 6 superfamily member 2，Tm6sf2）是一个重要的NAFLD致病风险因子，其编码蛋白的E167K多态性与NAFLD进程显著相关^[4]。随后多项研究进一步证实了这一相关性^[5,6,7]。Tm6sf2蛋白在肝脏、小肠和肾脏中特异性高表达^[4]，其中在肝脏中主要表达于肝实质细胞^[8,9]，在肝实质细胞中它主要定位于内质网和内质网-高尔基体中间层^[10]。Tm6sf2 E167K突变是指该蛋白的第167个氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸，是一种错义突变（即p.Glu167Lys）。虽然E167K多态性与NAFLD进程显著相关，但关于它对脂质代谢影响及NAFLD发生和发展中的作用与机制尚不明确。因此本研究应用新兴的CRISPR/Cas9技术建立Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠模型，在动物水平探讨Tm6sf2 E167K多态性对脂质代谢的影响，以探究Tm6sf2 E167K突变在NAFLD中的致病机制。

材料与方法

1.实验材料：选用5～6周龄的C57BL/6小鼠和7～8周龄的ICR小鼠，且均饲养于无特定病原级动物房；p UC57质粒空载体来自南京大学生物医药研究院；2×Taq master Mix，T4 DNA Ligase，DNA标志物均由南京Vazyme公司提供；琼脂糖G-10由西班牙BIOWEST公司提供；50×TAE和4%组织细胞固定液由北京索莱宝公司提供；乙二胺四乙酸二钠由湖北新德晟材料科技有限公司提供；甘油三酯（total cholesterol，TG）检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；葡萄糖注射液由湖北科伦药业公司提供；血糖仪和血糖试纸由日本OMRON公司提供。

2.F0代阳性小鼠的获得：小鼠的Tm6sf2基因位于第8条染色体，全长1446bp，有10个外显子，起始密码子位于外显子1，TGA终止密码子位于外显子10。TM6SF2蛋白全长378个氨基酸，其E167K突变位点位于外显子6上。针对小鼠的Tm6sf2基因的特点在网站（http://crispr. mit.edu/）上设计单链向导RNA（single guide RNA，sgRNA），具体序列见表1。构建可以同时表达针对小鼠Tm6sf2基因特定位点的sgRNA和Cas9的质粒，以及携带有Tm6sf2 E167K片段的Donor质粒，将上述两质粒一起注射到超排的小鼠受精卵，并移植到代孕小鼠子宫，在Cas9 system切开DNA链后通过同源重组将Tm6sf2 E167K片段重组到靶位点，具体过程见图1。通过PCR、Southern blot和测序得到阳性小鼠。

表1. sg RNA的靶向基因组序列.

sgRNA名称	sgRNA序列（5’→3’）	间隔前体紧邻模块
Tm6sf2-E167K-5S1	GAGATTAAATACGTTGTGC	AGG
Tm6sf2-E167K-3S2	CATGGGACCAGCATGTAC	AGG

图1. 利用CRISPR/Cas9技术构建Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠模型的策略.

3.Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠的鉴定：剪取2～3周龄小鼠0.5～0.8cm长的尾尖，置于1.5ml离心管，加70 μl碱性裂解液A（A液：25m m ol/L氢氧化钠；20 μmol/L乙二胺四乙酸二钠），95℃金属浴40min，再加70 μl裂解液B（B液：40 m m ol/L Tris-Cl），机械研磨、离心取上清液，得尾尖基因组DNA作为模板进行PCR扩增，基因型鉴定引物见表2，Tm6sf2-E167K-Wt-tF1和Tm6sf2-E167K-Wt-tR1分别位于突变位点的前后。将PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，根据条带的数量和大小判断基因型。此外，将PCR产物进行基因测序，进一步验证Tm6sf2 E167K位点突变是否成功。

表2. 用于小鼠基因型鉴定的引物序列.

PCR引物名称	引物序列（5’→3’）
Tm6sf2-E167K-wt-tF1	GGCCTTTCCTAGACTCCTCA
Tm6sf2-E167K-wt-tR1	CCTTCTCAGATGTTCCTCCCT

4.Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠子代存活数量统计：F1代杂合（heterozygous，HET）小鼠自交，得到F2代小鼠。鉴定并统计F2代中野生（wild type，Wt）、HET和敲入（knockin，KI）3种基因型小鼠存活个体数量，分析是否符合孟德尔分离定律。

5.Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠生长曲线：选取同窝对照的Wt和KI雄性小鼠分别作为对照组鼠（n=8）和实验组鼠（n=8），从出生第1周起，每周称量Wt和KI两种基因型小鼠的体质量，至8周结束，做两种基因型小鼠的生长曲线。

6.Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠口服葡萄糖耐受试验（oral glucose tolerance test，OGTT）：将同窝对照的8周龄Wt和KI雄性小鼠于8：00开始禁食，禁食6h后称体质量并测量鼠尾静脉的血糖。按照每千克体质量2g葡萄糖给小鼠进行葡萄糖灌胃^[11]，并测量灌胃后0.5h、1h和2h小鼠的血糖，记录血糖值并制作Wt和KI小鼠的OGTT曲线图，并计算OGTT曲线下面积。

7.Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠的血浆和肝脏TG含量检测：将同窝对照的8周龄Wt和KI雄性小鼠于8:00开始禁食，禁食6h后用4%的水合氯醛以0.01ml/g对小鼠进行麻醉，并心脏取血（采用乙二胺四乙酸二钠抗凝），2500×g，4℃离心10 min，取血浆测TG的含量。采血完成后将小鼠解剖，分离两种基因型小鼠的各主要器官进行形态学对比，然后将小鼠完整的肝脏用等渗盐水清洗后称重，之后取新鲜肝脏组织0.05g于0.45ml的无水乙醇中机械研磨，2500×g，4℃离心10min，取上清液，测肝脏TG的含量。

8.Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠肝脏HE染色和油红O染色：取上述同窝对照的8周龄Wt和KI雄性小鼠的肝脏，等渗盐水清洗后用4%多聚甲醛固定。脱水后用石蜡包埋、切片，分别做小鼠肝组织的HE染色和油红O染色，镜下观察肝组织脂肪变性和炎症活动等情况。

9.统计学方法：数据使用GraphPad prism 6软件处理，检验方法使用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.F0代小鼠的获得：将同时表达sg RNA和Cas9的质粒与携带有Tm6sf2 E167K片段的质粒一起体外注射到小鼠超排的受精卵，并移植到假孕小鼠的子宫，共得到111只F0代小鼠，对显微注射出生的小鼠进行PCR、Southern blot检测和测序验证，结果显示获得5只阳性F0代鼠。

2.Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠基因型的鉴定：利用鼠尾提取的DNA作为模板进行PCR，并将PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳。只扩增出203 bp大小条带的为KI小鼠，只扩增出147 bp大小条带的为Wt小鼠，同时扩增出不同大小两个条带的为HET小鼠，如图2A。测序结果证实第499个碱基由鸟嘌呤突变成了腺嘌呤，即G＞A，发生了点突变，见图2B。

图2. Tm6sf2 E167K敲入小鼠基因型的鉴定和测序.

注：A：Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠基因型鉴定的结果；B：Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠基因组测序的结果。KI：Tm6sf2 E167K纯合敲入小鼠；HET：Tm6sf2 E167K杂合小鼠；Wt：野生小鼠

3.Tm6sf2 E167K基因敲入对小鼠各组织外观的影响：分离8周龄的KI小鼠和Wt小鼠的脑、甲状腺、胸腺、心、肺、脾、胃、小肠、大肠、肾和睾丸，对比两组小鼠的各器官大小、形态，结果显示两组间各器官没有明显差异（图3）。

图3. KI小鼠和Wt小鼠各组织的形态对比.

注：KI：Tm6sf2 E167K纯合敲入小鼠；Wt：野生小鼠

4.Tm6sf2 E167K杂合小鼠自交子代存活个数比例分析：F1代HET小鼠自交子代中，W t、HET和KI 3种基因型小鼠所占的比例分别为26.5%、49.0%和24.5%，见表3，约为1∶2∶1，符合孟德尔遗传分离定律，表明Tm6sf2 E167K基因敲入不会引起小鼠胚胎致死。

表3. F1代小鼠自交所产生的3种基因型小鼠比例.

基因型	数量（只）	比例（%）
Wt	26	26.5
HET	48	49.0
KI	24	24.5

注：KI：Tm6sf2 E167K纯合敲入小鼠；HET：Tm6sf2 E167K杂合小鼠；Wt：野生小鼠

5.Tm6sf2 E167K基因敲入对小鼠体质量与肝指数的影响：我们从小鼠出生后第1周开始记录两种基因型小鼠的体质量增长变化并制作小鼠生长曲线。KI小鼠体质量在1～5周内始终高于Wt小鼠的体质量，且差异有统计学意义（P＜0.05），随着小鼠周龄的增长，在6～8周内KI小鼠体质量依然高于Wt小鼠的体质量，但差异无统计学意义（P＞0.05），提示Tm6sf2 E167K基因敲入能够导致幼鼠体质量的增加。利用小鼠肝脏重量和体质量计算8周龄小鼠的肝指数，结果显示KI小鼠的肝指数与Wt小鼠的肝指数差异无统计学意义（P＞0.05）（图4）。

图4. KI小鼠和Wt小鼠生长曲线和肝指数的比较.

注：A：示两种基因型小鼠生长曲线的比较（n=8）；B：示两种基因型小鼠肝指数的比较（n=8），^aP＜0.05，^bP＜0.01，^cP＜0.001。KI：Tm6sf2 E167K纯合敲入小鼠；Wt：野生小鼠

6.Tm6sf2 E167K基因敲入对小鼠葡萄糖代谢的影响：同窝8周龄雄性小鼠在禁食6h以后，KI小鼠的空腹血糖明显高于Wt小鼠的空腹血糖（P＜0.01），给小鼠灌胃葡萄糖后，KI小鼠在2h时的血糖要高于Wt小鼠的血糖（P＜0.05），如图5A，提示Tm6sf2 E167K基因敲入会引起小鼠空腹血糖的升高和葡萄糖耐受能力的下降。KI小鼠较Wt小鼠的OGTT曲线下面积升高，但差异无统计学意义（图5B）。

图5. KI小鼠和Wt小鼠葡萄糖耐量的比较.

注：A：示两种基因型小鼠OGTT的比较（n=8）；B：示两种基因型小鼠OGTT曲线下面积的比较（n=8）；^aP＜0.05；^bP＜0.01；KI：Tm6sf2 E167K纯合敲入小鼠；Wt：野生小鼠

7.Tm6sf2 E167K基因敲入对小鼠血浆和肝脏TG水平的影响：同窝8周龄雄性小鼠在禁食6h以后，KI小鼠的血浆TG水平和Wt小鼠的血浆TG水平差异无统计学意义（图6A）。KI小鼠的肝组织TG含量比Wt小鼠的肝组织TG含量高，但差异无统计学意义（图6B），Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠的肝组织TG含量高于野生小鼠的肝组织TG含量，提示Tm6sf2 E167K突变基因可能会使小鼠更容易发生TG在肝脏内的蓄积。

图6. KI小鼠和Wt小鼠血浆TG含量和肝脏TG含量的比较.

注：A：两种基因型小鼠血浆TG含量的比较（n=8）；B：两种基因型小鼠肝脏TG含量的比较（n=8）；^aP＜0.05；^bP＜0.01；^cP＜0.001；KI：Tm6sf2 E167K纯合敲入小鼠；Wt：野生小鼠

8.小鼠肝脏切片的HE和油红O染色分析：HE染色结果显示KI小鼠的肝脏组织学表现与Wt小鼠的无明显差异（图7A）。油红O染色结果表明KI小鼠肝脏内的脂质含量较Wt小鼠有较为明显的增多（图7B）。这些结果说明Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠的肝脏更易发生脂质的积累。

图7. KI小鼠和Wt小鼠肝脏的HE染色和油红O染色图片（×200）.

注：KI：Tm6sf2 E167K纯合敲入小鼠；Wt：野生小鼠

讨论

基因敲入技术是目前新兴且十分有效的研究特定基因功能的方法^[12]。在众多方法中，CRISPR/Cas9技术是目前最高效的基因组编辑系统^[13]。与以往较为传统的基因敲入技术不同，CRISPR/Cas9技术具有操作简单、高效、低成本、能实现特定基因位点修饰等特点^[14,15]。CRISPR/Cas9系统是最早发现于细菌和古细菌中的一种具有防止病毒DNA或者其他外源DNA入侵的免疫机制。通过对cr RNA和tracr RNA进行改造并连接在一起，得到sg RNA。通过将表达sg RNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作^[16,17]。在我们的研究中，应用CRISPR/Cas9技术构建Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠模型，通过分析E167K位点突变对脂质代谢的调控效应及进程的影响，进一步研究Tm6sf2 E167K多态性与NAFLD的相关性，有助于阐明Tm6sf2 E167K突变引发NAFLD的分子机制。

本研究中，根据小鼠Tm6sf2基因，设计并构建同时表达针对小鼠Tm6sf2基因特定位点的sg RNA和Cas9的质粒；同时构建携带Tm6sf2 E167K片段的Donor质粒将上述两种质粒一起体外显微注射到小鼠超排的受精卵，并移植到假孕的小鼠子宫，通过PCR、Southern blot和测序得到F0代阳性小鼠，随后通过繁殖得到Tm6sf2 E167K基因敲入纯合小鼠。通过PCR、Southern blot和测序结果证实了Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠模型构建成功。在该Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠模型的基础上，我们对Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠的表型做了初步研究。统计F1代HET小鼠自交子代中Wt、HET和KI 3种基因型小鼠存活的个体数量，并计算其比例，结果符合孟德尔遗传学定律，提示Tm6sf2 E167K基因的敲入不影响小鼠胚胎期正常发育。我们制作Wt和KI小鼠的生长曲线，发现Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠的平均体质量要高于Wt小鼠的平均体质量，而在哺乳期这种差异更加明显。同时我们还研究了Tm6sf2 E167K基因对小鼠糖耐量的影响，发现Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠的空腹血糖和OGTT 2h血糖升高，葡糖糖耐受能力下降，这提示Tm6sf2 E167K突变会引起小鼠血糖调节的异常。两种基因型小鼠的各个主要器官在大小形态上没有明显的差异，测量其空腹血浆和肝组织匀浆脂质水平，发现Tm6sf2 E167K突变基因会引起小鼠肝组织内TG含量的升高，肝组织油红O染色也证实KI小鼠更易发生肝脏脂质的累积，提示Tm6sf2 E167K基因突变小鼠会出现自发的肝脏内脂质累积。

本项目运用最新的CRISPR/Cas9技术，成功构建了Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠模型。该动物模型的建立有利于分析Tm6sf2 E167K多态性对脂质代谢的调控效应及NAFLD进程的影响，为探究Tm6sf2 E167K的多态性在NAFLD中的作用机制提供了实验动物模型。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明

孙宝凯：进行课题设计与实施、撰写论文；刘守胜：进行课题设计、论文审阅；张杰：进行课题实施、数据收集；宣世英、辛永宁：进行课题设计、实验指导和提供经费

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金资助项目（31770837）

Fund program: NThe National Natural Science Foundation of China(81873542)