HBeAg阴性低病毒载量慢性乙型肝炎患者的肝组织学状态与转归

Abstract

Objective

To retrospectively analyze the serological, virological, biochemical, liver histological status and clinical outcomes in HBeAg-negative chronic hepatitis B (CHB) patients withlow HBV viralload, and to explore the necessity of antiviraltherapy for these patients.

Methods

A total of 99 HBeAg-negative CHB patients with HBV DNA level＜4 lg copies/ml who performed liver biopsy at the baseline were enrolled from the follow-up cohort. Among them, 23 cases received the second liver biopsy during follow-up. The relationships among the degree of inflammation and fibrosis of liver tissues, the status of HBsAg and HBcAg, age, gender, family history, HBV DNA load, serological markers and other indicators were analyzed. The pathological differences between two liver biopsy examinations were compared. The effect of nucleos(t)ide analogues (NAs) treatment on patient's clinical outcomes were analyzed. For multivariate analysis, a binary logistic regression model was performed. Log-rank test was used to compare the cumulative incidence of hepatocellular carcinoma (HCC) in NAs-treated and non-NA streated patients.

Results

Baseline liver histology status showed that 58.6% (58/99) patients had obvious liver tissue damage in their baseline liver tissue pathology (G≥2 and/or S≥2). Univariate logistic regression analysis showed that aliver cirrhosis (LC) family history, a HBsAg-positive family history, baseline alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase levels were positively correlated factors forliver tissue damage. Multivariate logistic regression analysis showed that a LC family history was the main risk factor for liver tissue damage. Twenty-three cases had received a secondliver biopsy after an interval of 4.5 years.In 10 untreated cases, the second liver biopsy results showed the rate of obvious liver tissue damage (G≥ 2 and/ or S≥ 2) increased from 50.0% to 90.0%. In the other 13 cases who received NAs treatment, the secondliver biopsy showedimprovement inliver histology, and the rate of obvious liver tissue damage decreased from 61.5% to 46.2%. The 5-year HCC cumulative incidence in non-NAs-treated patients was significantly higher than that of in NAs-treated patients (17.7% vs. 3.8%, P=0.046).

Conclusion

For most HBeAg-negative CHB patients with low viral load, liver tissue pathology result suggests that it meets the indications for antiviral therapy, especially in patients with a LC familial history. Without antiviral therapy, liver tissue damage for these patients will progressively worse with the high incidence of HCC. Therefore, itis suggested that antiviraltherapy should be started as soon as possible forthe HBeAg-negative CHB patients with low viralload regardless ofthe alanine aminotransferase level, especially in patients over 30 years-old with a LC or HCC family history.

以往指南推荐^[1]，一般人群HBeAg阴性患者，HBV DNA≥2 000IU/m（相当4lg拷贝/ml）时，接受核苷酸类似物（nucleoside analogues, NAs）抗病毒治疗；如果HBV DNA＜4lg拷贝/ml时，只有肝组织学检查提示明显炎症和/或纤维化（G≥2和/或S≥2）才考虑抗病毒治疗[肝硬化（liver cirrhosis,LC）、肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）患者除外]^[1]。肝活组织病理检查具有创伤性，在临床上难以作为常规检查，如果HBeAg阴性且HBV DNA＜4lg拷贝/ml患者不愿意接受肝活组织病理检查，继续等待是否会错过抗病毒治疗时机？其临床转归如何？本研究通过长期NAs抗病毒治疗队列，探究HBeAg阴性低病毒载量慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）患者的肝组织学状况，临床转归。阐明HBeAg阴性低病毒载量的CHB患者抗病毒治疗必要性。

资料与方法

1.研究对象的选择：本研究项目获得广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准。入选标准：（1）HBs Ag和/或HBV DNA阳性6个月以上；（2）患者在知情同意下行肝活组织病理检查；（3）HBV DNA阳性且HBV DNA载量＜4lg拷贝/ml；（4）HBeAg阴性；（5）患者基线未抗病毒治疗。

排除标准：（1）合并丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等其他病原体感染；（2）合并药物性肝损伤、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫肝病、全身系统性疾病累及肝脏等；（3）使用过免疫抑制剂感染者；（4）曾经用过干扰素感染者；（5）应用降酶药物感染者；（6）HCC患者、临床诊断LC患者。乙型肝炎LC诊断标准：符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》^[2]相关诊断标准：满足（1）和（2）的病理学诊断或（1）和（3）的临床诊断：（1）目前HBs Ag阳性，或HBs Ag阴性、抗-HBc阳性且有明确的慢性HBV感染史（既往HBs Ag阳性＞6个月），并除外其他病因者；（2）肝脏活组织检查病理学符合HCC表现者；（3）符合以下5项中的2项及以上，并除外非肝硬化性门静脉高压者：①影像学检查显示LC和/或门静脉高压征象；②内镜检查显示食管胃底静脉曲张；③肝脏硬度值测定符合LC；④血生物化学检查显示白蛋白水平降低（＜35g/L）和/或凝血酶原时间延长（较对照延长＞3s）；⑤血常规检查显示血小板计数＜100×10⁹/L等。

2.相关定义：低病毒载量（low-level viremia, LLV）：HBV DNA水平持续或间歇大于检测下限但小于4lg拷贝/ml^[3]。

3.研究方法：所有研究对象均来自广西医科大学第一附属医院本团队随访队列。本团队自2002年建立了抗病毒治疗的慢性HBV感染者的随访队列，对患者全程管理，定期随访、检测血清HBV DNA、HBV血清学标志物、肝功能。HBV DNA定量检测采用荧光定量PCR法，检测下限＜500拷贝/ml，试剂由湖南圣湘公司提供；HBV标志物检测采用荧光免疫分析法，试剂由上海新波生物技术有限公司提供；生物化学仪器为日本日立公司7600全自动生物化学分析仪，试剂由上海执诚物科技股份有限公司提供。以上检测均由广西医科大学第一附属医院检验中心完成。

患者签署知情同意书后接受B超引导下行肝活组织病理检查。采用一次性美国巴德公司穿刺活检针（MN1620，16G×20cm），穿刺针穿刺活组织长度＞1.5cm，所获得标本用10%甲醛固定，石蜡包埋，肝组织切片后分别行苏木精-伊红染色和网状纤维染色，由两位病理学教授盲法将肝脏炎症分为G0～G4级，将肝纤维化分为S0～S4期。肝组织内HBs Ag和HBc Ag表达检测用Supervision TM二步法免疫组织化学检测，试剂由福州迈新生物技术有限公司提供，以上均由广西医科大学第一附属医院病理科完成。

4.统计学分析：数据结果采用SPSS 22.0统计学软件进行分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示；计数资料采用百分率表示；多因素分析采用二分类Logistic回归模型，Log-Rank检验比较未NAs治疗患者与NAs治疗患者的HCC累计发生率。当P＜0.05时，差异有统计学意义。

结果

1.研究对象一般资料：2008年7月至2017年2月本团队慢性HBV感染者随访队列中HBV DNA水平＜4lg拷贝/ml，并做肝活组织病理检查HBeAg阴性的CHB患者121例，剔除肝穿刺基线已经抗病毒治疗、合并其他肝炎等不符合入组标准的22例患者，共有99例符合纳入标准进入统计分析。患者一般资料见表1。

表1. 患者一般资料.

临床指标	总例数（ n =99）
年龄（岁）	42.28±8.14
年龄≥30岁[n（%）]	93（93.9）
男性[n（%）]	73（73.7）
发现HBsAg时间（年）	13.15±9.41
肝硬化家族史a[n（%）]	21（21.2）
HBsAg阳性家族史b [n（%）]	75（75.8）
基线丙氨酸转氨酶（U/L）	32.61±14.44
基线天冬氨酸转氨酶（U/L）	30.61±11.74
丙氨酸转氨酶正常[n（%）]	95（96.0）
基线HBV DNA均数[lg拷贝/ml]	3.09±0.67
平均随访时间（年）	5.45（1～10年）

注：^a：肝硬化家族史：三代以内的直系亲属有一个人或者多个人患过肝硬化；^b：HBsAg阳性家族史：三代以内的直系亲属有一个人或者多个人HBsAg阳性

2.基线肝组织学状态以及与血清学、家族史的关系：99例HBeAg阴性低病毒载量的CHB患者，肝组织平均炎症活动度G（1.61±0.97）级，纤维化程度S（1.73±1.40）期；肝组织损伤程度见图1。明显肝组织损伤（G≥2和/或S≥2）达58.6%（58/99）。肝细胞HBsAg（+）和/或HBcAg（+）占91.9%。采用单因素Logistic回归模型对可能影响患者明显肝组织损伤（G≥2和/或S≥2）的危险因素[年龄、性别、HBV DNA水平、ALT、天冬氨酸转氨酶（AST）、乙型肝炎家族史、LC家族史]进行单因素分析，筛查出ALT、AST、乙型肝炎家族史、LC家族史具有统计学意义，再进一步进行多因素logistic回归模型分析，显示LC家族史是肝组织明显损伤（G≥2和/或S≥2）的危险因素，见表2。

图1. 99例HBeAg阴性低病毒载量慢性乙型肝炎患者肝组织学分布状况.

表2. Logistic回归模型生存分析结果.

影响因素	单因素分析			多因素分析
	HR	95% CI	P 值	HR	95% CI	P 值
ALT（U/ml）	1.050	1.012～1.090	0.009
AST（U/ml）	1.079	1.024～1.136	0.004
HBsAg家族史	4.000	1.509～10.605	0.005
LC家族史	21.053	2.692～164.660	0.004	14.695	1.777～121.501	0.013

3.患者肝组织学及临床转归：23例患者平均间隔4.5年行第二次肝活组织病理检查，其中10例未经抗病毒治疗的患者第二次肝活组织病理检查肝组织学有进展，明显肝组织损伤（G≥2和/或S≥2）从50.0%上升到90.0%，LC从10.0%上升到30.0%，并发生1例HCC；另13例经NAs抗病毒治疗后，第二次肝活组织病理检查肝组织学有改善，患者明显肝组织损伤比例（G≥2和/或S≥2）从61.5%下降到46.2%，LC比例从23.1%下降到0，见图2。

图2. 两次肝活组织病理检查肝组织学变化.

99例患者肝穿后失访16例、未抗病毒治疗21例、NAs治疗62例。未抗病毒治疗组患者5年HCC累计发生率显著高于NAs抗病毒治疗患者（17.7%对比3.8%，P=0.046），见图3。

图3. 随访期间肝细胞癌累计发生率.

讨论

以往研究认为HBV感染自然史中^[1]，免疫控制期的感染者处于低复制期，此期患者肝脏病理学提示无或仅有轻度炎症，可有或无纤维化，因此，不主张积极抗病毒治疗。也有研究表明不活跃的HBV携带者仍然有HCC和相关死亡的风险，Yenilmez等^[4]研究发现在年轻的低病毒载量CHB患者中，发生明显的肝纤维化达30.2%。本研究入组的HBeAg阴性低病毒载量的CHB患者ALT正常占96.0%，临床上尚不符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》一般人群抗病毒治疗指征，但肝活组织病理检查却显示58.6%出现明显肝组织损伤（G≥2和（或）S≥2），达到指南抗病毒治疗指征。虽然本研究93.9%患者年龄≥30岁，缺乏对低年龄段患者情况的反映，但Yenilmez等^[4]研究也显示，即使是年轻的低病毒载量CHB患者仍不可忽视发生肝纤维化的风险。

一般认为CHB患者发生LC是多因素共同作用的结果，本研究单因素、多因素分析显示LC家族史是明显肝组织损伤（G≥2和/或S≥2）的主要危险因素，HBs Ag家族史、ALT和AST异常是次要危险因素。有研究指出^[5]，病程长、LC家族史是LC的危险因素。我国慢性HBV感染以母婴传播为主，有HBs Ag家族史的患者，往往HBV感染时间长，肝脏炎症持续时间就越长，导致肝纤维化风险高。在本研究中，有LC家族史的患者发生明显肝组织损伤（G≥2和/或S≥2）是无LC家族史的患者的15倍，因此有HBs Ag家族史，尤其是LC家族史的CHB患者更应当重视。

有研究指出，持续低水平HBV DNA会促进CHB的进展^[6]，长期的NAs治疗可逆转肝组织损伤^[7]。本研究中，未抗病毒治疗的患者，第二次肝活组织病理检查肝组织学明显进展，LC、HCC发生率升高；而经NAs治疗的患者第二次肝活组织病理检查肝组织学有所改善，治疗后LC均已逆转。可见，HBeAg阴性低病毒载量的CHB患者，给予NAs治疗是能够获益的，可逆转明显肝组织损伤和LC，降低HCC的风险。

抗病毒治疗最终目标是减少硬终点事件（HCC）^[3]。虽然Cho等^[8]的研究提示即使有效抑制HBV复制不能完全消除HCC的风险，但Paik等^[9]研究也表明，长期有效的NAs治疗可降低HCC的发生风险。本研究的长期随访结果显示，低病毒载量ALT正常的CHB患者，不抗病毒治疗5年HCC累计发生率高达17.7%，而NAs治疗后HCC发生率明显降低到3.8%，提示：病毒存在，即使是低载量，依然是导致HCC根本原因。事实上，在临床实践中，对于低病毒载量的CHB患者，NAs治疗更容易获得完全病毒学应答，我们的研究也显示HBeAg阴性低病毒载量的CHB患者予以NAs治疗有效，能够临床获益。既然我国一线NAs药物已经可及、可负担，为什么这类患者还要等待观察呢？随着循证医学证据的增加，2019年版中国指南^[3]已经放宽了抗病毒治疗适应症：只要HBV DNA阳性，无论病毒载量如何，ALT异常也不限于升高2倍；年龄大于30岁、有LC或HCC家族史的患者，也可无需行肝活组织病理检查即可以启动抗病毒治疗^[3]。本研究佐证了新版指南放宽抗病毒治疗适应症的必要性。

综上所述，HBeAg阴性低病毒载量的CHB患者，即使ALT正常，大部分患者的肝组织学已达到抗病毒治疗指征（G≥2和/或S≥2），如果不抗病毒治疗肝组织损伤进行性加重，LC、HCC发生风险明显增高，而抗病毒治疗能够逆转LC，减少HCC硬终点事件，因此，建议HBeAg阴性低病毒载量的CHB患者，尤其是年龄大于30岁、有LC或HCC家族史的患者，无论ALT水平如何，应该及早启动抗病毒治疗。

本研究建立在长达10多年的随访队列及数据库的基础上，数据可靠，但该研究入组患者年龄偏大，行二次肝穿的患者例数偏少，仍需扩大样本量，纳入不同年龄段低病毒载量的CHB患者，

为HBeAg阴性低病毒载量的CHB患者抗病毒治疗提供更广泛可靠的依据。

作者贡献声明

邓德丽：病例收集和采集数据、数据分析、撰写论文；江建宁：研究设计，指导论文撰写；苏明华：诊疗；王荣明、臧伟伟、零小樟、韦慧兰、梁先帅、周珲堃、何文明、郭荣晟：收集数据、随访

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金项目（81960115）;“十三五”国家科技重大专项（2017ZX10202201）;广西病毒性肝炎防治研究重点实验室开放课题基金项目（GXCDCKL201802、GXCDCKL202001）;区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室自主课题（GKE2018-05、GKE2019-04）;广西医科大学青年科学基金项目（GXMUYSF201910）

Fund program: National Natural Science Foundation (81960115);National Science and Technology Major Project of China (2017ZX10202201);Guangxi Key Laboratory for the Prevention and Control of Viral Hepatitis (GXCDCKL201802, GXCDCKL202001);Key Laboratory of High-Incidence-Tumor Prevention& Treatment (Guangxi Medical University), Ministry of Education (GKE2018-05, GKE2019-04);Guangxi Medical University Youth Science Foundation Project(GXMUYSF201910)