Abstract
目的
总结肝豆状核变性患者肝脏临床及病理形态学特征，提高对该病的诊断水平。
方法
回顾性分析我院2013年1月至2018年8月期间明确诊断肝豆状核变性并行肝脏活组织检查的病例21例，分析患者的肝脏病理形态学特点及临床特征。采用Fisher精确检验法分析肝穿刺及肝移植活组织检查中病理形态学的差异，分析病理模式与活组织检查类型及临床指标之间的关系。
结果
21例肝豆状核变性患者中有10例行肝脏穿刺活组织检查，11例行肝移植切除病肝活组织检查；表现为单纯性脂肪肝模式4例（19.0%,4/21）、脂肪性肝炎样模式8例（38.1%,8/21）、炎症坏死不伴肝硬化模式4例（19.0%,4/21）、炎症坏死伴肝硬化模式5例（23.9%,5/21）。肝脏内出现铜沉积12例（57.1%,12/21），且铜在肝脏内分布不均。
结论
肝豆状核变性肝脏形态学主要表现为4种模式，但缺乏特征性改变，应该结合患者的临床病史、实验室检查、基因检测结果及肝脏形态学改变进行综合判断。
Keywords: 肝豆状核变性, 病理损伤模式, 铜沉积
Abstract
Objective
To improve the diagnostic quality of hepatolenticular degeneration by summarizing the clinicopathological features.
Methods
A retrospective analysis of 21 cases that were diagnosed as hepatolenticular degeneration with liver biopsy in our hospital from January 2013 to August 2018 was reviewed, and then their clinicopathologic features were analyzed. The pathomorphological differences between liver biopsy and liver biopsy after transplantation, and the relationship between histopathological patterns and biopsy types and clinical indicators were analyzed by Fisher's exact test.
Results
Ofthe 21 patients with hepatolenticular degeneration, 10 patients had liver biopsy, and 11 patients underwent liver biopsy after liver transplantation. Among them, four cases were presented as simple fatty liver pattern (19.0%, 4/21), eight cases as steatohepatitis pattern (38.1%, 8/21), four cases as inflammatory necrosis without cirrhosis pattern (19.0%, 4/21), and five cases as inflammatory necrosis with cirrhosis pattern (23.9%, 5/21). Twelve cases had copper deposition in the liver (57.1%, 12/21), and the pattern of copper distribution in the liver was uneven.
Conclusion
A clinicalpathological features of hepatolenticular degeneration mainly manifests in four patterns, but lack characteristic changes. Hence, comprehensive judgment should rely on clinical history, laboratory examination, genetic test results and liver histopathological changes.
Keywords: Hepatolenticular degeneration, Histopathologic patterns, Copper deposition
肝豆状核变性，即Wilson病（wilson's disease, WD），是一种常染色体隐性遗传性疾病。本病因ATP7B基因突变引起机体铜排泄障碍，过量的铜沉积在全身各脏器，从而导致以肝脏和脑等脏器为主的功能损害。该病少见，早期驱铜治疗以及晚期肝移植可挽救多数WD患者生命，因此成为少数几种可以治疗的遗传代谢性疾病之一。通过肝脏活组织检查，客观评估肝脏病理改变，探讨肝脏病理改变与临床表现的关系是明确诊断、选择治疗方案及手术时机的关键手段。目前，肝脏穿刺活组织检查在国内外已广泛开展，成为评估WD肝脏损伤及诊断的重要手段之一。由于该病临床表现多样，基因突变的种类和数量繁多，肝脏组织学改变不尽相同，容易引起误诊和漏诊。现总结我院明确诊断WD病例的肝脏组织学特征，希望对本病的诊断有所帮助。
资料与方法
1.入组资料：收集2013年1月至2018年8月北京友谊医院病案系统中明确诊断WD的病例52例，从中选取行肝脏活组织检查或肝脏移植手术的病例21例。所有病例均经复核确认。
2.诊断标准：根据临床表现、铜蓝蛋白降低及铜代谢障碍，参照《2012欧洲肝脏研究会肝豆状核变性Wi Ison病的诊治指南》及《肝豆状核变性的诊断与治疗指南》诊断[1]。
3.方法：统计2013年1月至2018年8月北京友谊医院肝穿刺活组织检查病例及肝移植病例，分析WD在同期肝穿刺活组织检查中的比例，病肝在同期肝移植总体及儿童中的比例。回顾性分析21例WD患者的临床表现、实验室检查、基因检测和病理形态学特点等。病例标本均经4%中性甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，光镜检查。特殊染色（包括Masson胶原染色法、Timm硫化银铜染色法、罗丹宁铜染色法）及免疫组织化学染色。免疫组织化学染色采用En Vision两步法，所用抗体包括CK7、CK19均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
4.统计学方法：计数资料以百分数表示，采用Fisher精确检验法分析肝穿刺及肝移植活组织检查中病理形态学的差异，分析病理模式与活组织检查类型及临床指标之间的关系。
结果
1.WD在同期肝穿刺及病肝在同期肝移植患者中的比例：2013年1月至2018年8月北京友谊医院肝穿刺病例共1 516例，WD在同期肝穿刺患者中的比例为0.66%（10/1516）。肝移植病例共680例，WD在同期肝移植患者的比例为1.62%（11/680），儿童患者（年龄≤14岁）肝移植病例共443例，WD在同期儿童肝移植患者的比例为2.0%（9/443），见图1。
图1. 21例Wilson病病例选择路径图.
2.患者的临床特点：21例患者中，男性10例，女性11例。年龄4～51岁，中位年龄15岁，儿童患者（年龄≤14岁）10例（中位年龄9岁），成人患者（年龄＞14岁）11例（中位年龄32岁）。以消化道症状如腹胀、腹痛、呕血、便血等为首发症状者12例；出现皮肤、巩膜黄染、肝脏生物化学指标异常等肝病表现者9例；伴有神经精神症状者10例；经眼科检查角膜K-F环阳性者8例。以肝脏生物化学指标异常为主要表现者12例，以神经、精神异常为主要表现者2例，两系统均受累者为7例。10例患者采用口服青霉胺或硫酸锌驱铜治疗，11例患者因肝功能失代偿行肝移植手术。实验室检查方面，全部患者血清铜蓝蛋白均低于正常值（200mg/L）。共有15例患者检测24h尿铜含量，均高于正常参考值（40μg）。见表1。
表1. 21例Wilson病患者临床资料统计.
| 病例序号 | 标本类型 | 性别 | 年龄（岁） | 病程（月） | 临床分型 | ATP7B基因突变位点 | 病理模式 | 诊断评分系统 | Child-Pugh评分 | Child-Pugh分级 | 终末期肝病模型评分 | 预后指数 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 肝穿刺 | 男 | 32 | 72 | 混合型 | R952K,K832R | 单纯性脂肪肝 | 4 | 5 | A | 6 | 5 |
| 2 | 肝穿刺 | 男 | 34 | 53 | 肝型 | S406A,K832R,A874V | 单纯性脂肪肝 | 4 | 5 | A | 7 | 5 |
| 3 | 肝穿刺 | 男 | 17 | 5 | 肝型 | NA | 脂肪性肝炎样 | 4 | 5 | A | 8 | 5 |
| 4 | 肝穿刺 | 女 | 15 | 4 | 肝型 | A874V | 脂肪性肝炎样 | 3 | 5 | A | 9 | 5 |
| 5 | 肝穿刺 | 男 | 31 | 96 | 肝型 | P992L b,A874V | 脂肪性肝炎样 | 8 | 6 | A | NA | 5 |
| 6 | 肝穿刺 | 女 | 34 | 48 | 肝型 | V11061 | 炎症坏死不伴肝硬化 | 4 | 5 | A | 13 | 5 |
| 7 | 肝穿刺 | 女 | 51 | 24 | 肝型 | R778L,R1151C | 单线性脂肪肝 | 4 | 8 | B | 12 | 6 |
| 8 | 肝穿刺 | 女 | 49 | 60 | 肝型 | R778L | 炎症坏死不伴肝硬化 | 6 | 5 | A | 9 | 5 |
| 9 | 肝穿刺 | 男 | 5 | 1 | 肝型 | R778L | 单纯性脂肪肝 | 4 | 5 | A | 7 | 5 |
| 10 | 肝穿刺 | 女 | 26 | 1 | 肝型 | D765G,K832R,A874V,R952K | 脂肪性肝炎样 | 6 | 5 | A | 7 | 5 |
| 11 | 肝移植 | 女 | 42 | 48 | 肝型 | R778L,A874V | 炎症坏死不伴肝硬化 | 4 | 6 a | A | 9 | 5 |
| 12 | 肝移植 | 女 | 4 | 26 | 混合型 | K832R,R952K,V456L | 炎症坏死不伴肝硬化 | 5 | 6 a | A | NA | 7 |
| 13 | 肝移植 | 女 | 9 | 2 | 混合型 | R778L | 炎症坏死伴肝硬化 | 7 | 9 | B | 19 | 9 |
| 14 | 肝移植 | 女 | 7 | 1 | 混合型 | NA | 脂肪性肝炎样 | 4 | 9 | B | 7 | 5 |
| 15 | 肝移植 | 男 | 12 | 24 | 脑型 | NA | 炎症坏死伴肝硬化 | 6 | 6 a | A | 7 | 5 |
| 16 | 肝移植 | 女 | 13 | 1 | 混合型 | R778L | 脂肪性肝炎样 | 7 | 9 | B | NA | 5 |
| 17 | 肝移植 | 男 | 11 | 12 | 脑型 | NA | 脂肪性肝炎样 | 5 | 10 | C | 12 | 6 |
| 18 | 肝移植 | 男 | 9 | 6 | 混合型 | Q1004X | 炎症坏死伴肝硬化 | 7 | 7 | B | 8 | 8 |
| 19 | 肝移植 | 男 | 30 | 240 | 混合型 | NA | 炎症坏死伴肝硬化 | 5 | 12 | C | 20 | 6 |
| 20 | 肝移植 | 女 | 8 | <1 | 肝型 | NA | 脂肪性肝炎样 | 6 | 13 | C | 38 | 13 |
| 21 | 肝移植 | 男 | 12 | 132 | 肝型 | K832R,V456L | 炎症坏死伴肝硬化 | 5 | 14 | C | NA | 10 |
注： a：3例患者Child-Pugh评分为6分，病例11因食管胃底静脉重度曲张、随时有上消化道出血可能；病例12有明显的精神症状，肝脏生物化学指标异常，转氨酶反复升高，药物治疗效果不佳；病例15因头颅磁共振成像结果提示两侧基底节区、丘脑、中脑可见对称性异常信号，保守治疗差；肝移植成为3例患者治疗的唯一手段。 b：此例患者P992L突变类型为纯合突变，其余突变类型均为杂合突变
3.肝脏病理形态学观察：本组21例WD患者中有10例行肝脏穿刺活组织检查，肝穿组织长1.0～1.3cm，平均长1.27cm；汇管区4～15个，平均11个。11例患者行肝移植肝脏切除活组织检查。由于肝脏损伤程度存在差异，早期主要表现为出现糖原核肝细胞及脂肪变性等单纯性脂肪肝改变。随病变发展，肝脏由早期改变进展到肝硬化的速度及病理模式个体差异较大。某些患者可出现慢性活动性肝炎，伴有淋巴浆细胞的浸润，可有点灶状坏死、桥接坏死和不同程度的肝纤维化，可进展为大结节性肝硬化或大小结节混合性肝硬化[2]。21例WD患者中，出现脂肪变性者12例，其中表现为单纯性脂肪肝模式者（G0～G1且S0～S2）4例，脂肪性肝炎样模式者（G2～G3或S3～S4）8例。无脂肪变性者9例，主要表现为炎症坏死不伴肝硬化模式者（S0～S3）4例，炎症坏死伴肝硬化模式者（S4）5例。WD患者肝脏组织还出现凋亡小体、胆汁淤积、糖原核肝细胞、脂褐素沉积等表现，有的病例伴有不同程度的汇管区周边细胆管反应，偶尔可见胆栓形成及肝细胞胆管化生。12例患者表现为肝脏铜沉积，铜染色结果显示肝脏内沉积的铜分布不均，有的呈小叶内弥漫性分布，有的集中在汇管区周围，有的肝硬化结节中铜弥漫沉积，有的肝硬化结节未出现铜沉积。统计分析结果显示，脂肪变性、纤维化程度、出现糖原核肝细胞、出现气球样变肝细胞和Mallory小体在肝穿刺和肝移植活组织检查中的差异具有统计学意义，病理模式在肝穿刺和肝移植活组织检查中的差异也有统计学意义（P＜0.05）。21例WD患者肝脏病理形态学特点见表2，病理模式与活组织检查类型及临床因素之间的关系见表3。
表2. 21例Wilson病患者肝脏病理形态学特点[例（%）].
| 形态学特点 | 例数 | 肝穿 | 肝移植 | P 值 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 脂肪变性 | |||||
| 有 | 12 | 8(66.7) | 4(33.3) | 0.044 a | |
| 无 | 9 | 2(22.2) | 7(77.8) | ||
| 小叶内炎症 | |||||
| G0 | 3 | 3(100.0) | 0(0.0) | ||
| G1 | 6 | 3(50.0) | 3(50.0) | ||
| G2 | 9 | 4(44.4) | 5(55.6) | 0.164 | |
| G3 | 3 | 0(0.0) | 3(100.0) | ||
| G4 | 0 | 0(0.0) | 0(0.0) | ||
| 纤维化程度 | |||||
| S0 | 2 | 2(100.0) | 0(0.0) | ||
| S1 | 2 | 2(100.0) | 0(0.0) | ||
| S2 | 2 | 2(100.0) | 0(0.0) | 0.004 a | |
| S3 | 5 | 3(60.0) | 2(40.0) | ||
| S4 | 10 | 1(10.0) | 9(90.0) | ||
| 坏死 | |||||
| 有 | 19 | 9(47.4) | 10(52.6) | 0.943 | |
| 无 | 2 | 1(50.0) | 1(50.0) | ||
| 凋亡小体 | |||||
| 有 | 4 | 0(0.0) | 4(100.0) | 0.09 | |
| 无 | 17 | 10(58.8) | 7(41.2) | ||
| 胆汁淤积 | |||||
| 有 | 5 | 1(20.0) | 4(80.0) | 0.311 | |
| 无 | 16 | 9(56.3) | 7(43.7) | ||
| 糖原核肝细胞 | |||||
| 有 | 9 | 7(77.8) | 2(22.2) | 0.030 a | |
| 无 | 12 | 3(25.0) | 9(75.0) | ||
| 脂褐素沉积 | |||||
| 有 | 2 | 1(50.0) | 1(50.0) | 1 | |
| 无 | 19 | 9(47.4) | 10(52.6) | ||
| 气球样变肝细胞 | |||||
| 有 | 16 | 10(62.5) | 6(37.5) | 0.035 a | |
| 无 | 5 | 0(0.0) | 5(100.0) | ||
| Mallory小体 | |||||
| 有 | 16 | 10(62.5) | 6(37.5) | 0.035 a | |
| 无 | 5 | 0(0.0) | 5(100.0) | ||
| 细胆管反应 | |||||
| 有 | 19 | 9(47.4) | 10(52.6) | 1 | |
| 无 | 2 | 1(50.0) | 1(50.0) | ||
| 铜沉积 | |||||
| 有 | 12 | 5(41.7) | 7(58.3) | 0.67 | |
| 无 | 9 | 5(55.6) | 4(44.4) | ||
注： a P<0.05
表3. 病理模式与活组织检查类型及临床因素之间的关系[例（%）].
| 病理模式 | 例数 | 活组织检查类型 | 性别 | 年龄 | 临床表现 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 肝穿刺 | 肝移植 | 男 | 女 | ≤ 14岁 | >14岁 | 伴有神经系统症状 | 不伴有神经系统症状 | ||
| 单纯性脂肪肝 | 4 | 4(100) | 0(0) | 3(75.0) | 1(25.0) | 1(25.0) | 3(75.0) | 1(25.0) | 3(75.0) |
| 脂肪性肝炎样 | 8 | 4(50.0) | 4(50.0) | 3(37.5) | 5(62.5) | 4(50.0) | 4(50.0) | 3(37.5) | 5(62.5) |
| 炎症坏死不伴肝硬化 | 4 | 2(50.0) | 2(50.0) | 0(0) | 4(100) | 1(25.0) | 3(75.0) | 1(25.0) | 3(75.0) |
| 炎症坏死伴肝硬化 | 5 | 0(0) | 5(100) | 4(80.0) | 1(20.0) | 4(80.0) | 1(20.0) | 4(80.0) | 1(20.0) |
| P值 | 0.022 a | 0.086 | 0.332 | 0.344 | |||||
注： a P<0.05
4.临床病理联系：收集患者的临床表现及实验室检查数据，分别计算肝功能Child-Pugh分级、终末期肝病模型（model for end-stage liver disease, MELD）评分，并参照《2012欧洲肝脏研究会肝豆状核变性Wi Ison病的诊治指南》[1]，计算WD诊断评分及预后指数（表1）。因4例患者实验室数据不全，不能计算MELD评分。对比每例患者的Child-Pugh分级、MELD评分及WD预后指数发现，Child-Pugh分级高、MELD评分及WD预后指数高的患者，主要表现为脂肪性肝炎样模式及炎症坏死伴肝硬化模式。
5.病例基因突变特点：21例WD患者中15例行基因检测，全部检测到ATP7B基因的突变。其中1例为P992L位点纯合突变及A874V位点杂合突变，其余14例均为不同位点的杂合突变。
讨论
WD是由ATP7B基因突变引起的遗传性铜代谢障碍疾病，在1912年由Kinnier Wilson首次报道。WD的发病年龄从2岁到72岁不等[3-4]，发病高峰为15～19岁[5]。此病世界范围内的发病率为（15～30）/100万。随着对ATP7B基因研究的深入，目前已发现超过600种与WD相关的ATP7B基因突变类型，不同的突变类型可以引起不同的临床表现[6-7]。ATP7B基因突变可引起铜蓝蛋白合成障碍、胆汁排铜障碍及溶酶体缺陷等生理机制的异常[11]，导致铜沉积在全身各脏器。因ATP7B基因突变的类型和数目不同，铜在体内沉积的部位和数量存在一定个体差异，其产生的临床表现复杂多样，临床上以肝脏损害、神经系统退行性变和角膜边缘铜沉着环等为主要特征。因此可通过患者的临床表现及对血铜蓝蛋白、24h尿铜及角膜K-F环的检测而获得确诊。本研究中患者出现铜沉积的不同临床表现；21例患者血清铜蓝蛋白含量均低于正常值（200mg/L）；15例患者检测24h尿铜含量，均高于正常参考值（40 μg）；8例发现角膜K-F环。本研究入组的21例WD患者其临床表现及实验室检查与文献报道基本一致[6,8-11]。
通过对本组病例肝脏形态学观察，按照脂肪变性、炎症坏死及纤维化程度的不同，将本组病例分为单纯性脂肪肝模式、脂肪性肝炎样模式、炎症坏死不伴肝硬化模式及炎症坏死伴肝硬化模式。本研究的结果提示对于肝脏组织学损伤严重的病例，其患者的临床表现更严重，肝脏组织学表现与患者的临床表现相一致。将患者分为肝穿刺组及肝移植组分析发现，肝穿刺组患者的肝脏形态学主要表现为单纯性脂肪肝模式及炎症坏死不伴肝硬化模式，而肝移植组患者的肝脏形态学主要表现为脂肪性肝炎样模式及炎症坏死伴肝硬化模式，并且统计分析结果显示，病理模式在肝穿刺及肝移植活组织检查中的差异具有统计学意义。对于肝脏功能较差、预后不良的WD患者，肝移植是挽救患者生命的唯一手段，所以肝移植患者的肝脏损伤较之肝穿刺患者为重。
本研究中儿童患者的肝脏形态学主要表现为脂肪性肝炎样模式及炎症坏死伴肝硬化模式，但统计分析未发现病理模式在儿童患者及成人患者中的差异具有统计学意义。这可能是因为本研究病例数量有限，病理模式在儿童及成人患者中的差异是否有统计学意义还需要进一步扩大样本量来验证。本组中12例伴有脂肪变性的患者中，以大泡性脂肪变性为主者6例（6/12,50.0%），大泡性脂肪变性和小泡性脂肪变性混合者6例（6/12,50.0%），小泡性脂肪变性出现的频率较其他单纯性脂肪肝及脂肪性肝炎病变高，提示出现小泡性脂肪变性对于诊断WD有一定的提示意义。此外，本组21例患者中有19例伴有不同程度的汇管区周边细胆管反应，说明几乎所有的WD患者可出现不同程度的肝细胞损伤伴修复现象，这也对诊断WD有一定的指导作用。
WD患者肝脏内铜的分布形式多样。在疾病早期阶段，肝铜水平升高，铜主要与金属硫铁蛋白结合，位于胞质，通常铜难以用组织化学方法证实。在疾病后期，铜在肝细胞溶酶体内聚积，则容易染色。WD患者肝脏内沉积的铜分布不均匀，穿刺标本取材有限，不能完全代表病变肝脏的全貌，而移植活组织检查标本取材全面，相对更容易检测到肝铜的沉积，因此肝移植病例中肝铜的检出率要高于其在肝穿活组织检查病例中的比例。由于铜在肝脏内的分布不均，因此肝铜染色阴性不能完全排除WD的诊断。此外，过量的铜沉积也可见于其他慢性胆汁淤积性疾病如原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎及胆道闭锁。与WD相比，这些患者缺乏中枢神经系统损害，多无角膜K-F环，血清铜蓝蛋白正常或升高，并且多数不会检测到ATP7B基因的突变。这些患者肝组织中铜及铜结合蛋白通常分布于汇管区周围，铜及铜结合蛋白染色阳性率较高。
铜和铜结合蛋白染色在WD的诊断中起着至关重要的作用。正常肝脏内铜及铜结合蛋白含量低，且为弥散状态；多量铜沉积后以硫氢键及双硫键相结合形成铜结合蛋白。铜及铜结合蛋白的组织化学染色方法有多种，罗丹宁和Timm硫化银染色法可检测肝内沉积的铜，地衣红及维多利亚蓝染色法可检测铜结合蛋白。日常工作中，罗丹宁染色法是最为常用的铜染色法，因为与其他染色法相比其更为简单可行，而且很容易把桔红色的铜与胆汁区分出来。然而，Timm硫化银染色法的敏感性更高[12-14]。本研究中，部分病例采用Timm硫化银染色法，部分病例采用罗丹宁染色法，但并未对2种染色法检测出肝脏内铜的概率进行比较，今后还需进一步完善。
综上所述，肝脏活组织检查是评估WD肝脏损伤及诊断的重要手段之一。WD肝脏形态学可表现为单纯性脂肪肝模式、脂肪性肝炎样模式、炎症坏死不伴肝硬化模式及炎症坏死伴肝硬化模式；出现小泡性脂肪变性及铜沉积对WD的诊断有一定的提示意义。但其肝脏形态学缺乏特征性改变，沉积的铜在肝脏内分布不均，因此肝铜染色阴性不能排除WD的诊断，而过量的铜沉积也可见于其他肝脏疾病。因此，应该结合患者的临床病史、症状和体征、实验室检查、基因检测结果及肝脏形态学改变，进行综合判断。WD是目前少数几种可以治疗的遗传代谢性疾病之一，早期诊断及治疗，对改善患者预后有积极影响，对疑似WD的患者进行肝脏病理学检查对于该病的诊断及预后判断有重要意义。
利益冲突
无
作者贡献声明
王琳：收集资料、分析数据、撰写论文；孙丽莹：提供临床数据；黄坚：指导实验操作；陈光勇、赵新颜：研究立题、文章修改及指导
参考文献
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