DEK基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建及其对肝癌细胞生物学行为的影响

Abstract

Objective

To construct RNA interference (RNAi) lentiviral expression vector of DEK gene, and to explore its effect on the biological behavior of liver cancer cells.

Methods

Double-stranded oligo DNAs were annealed and synthesized according to the interference sequence of DEK gene by RNAi technology. Small interfering RNA expression vector pLKO.1 was cloned after enzymatic digestion. The recombinant lentiviral pLKO. 1-sh h DEK was constructed, and then the virus supernatant was collected, packed and infected by 293T cells. Real-time reverse transcription PCR (RT-PCR) and Western blot were used to detect DEK expression in human liver cancer cells Bel-7402, Hu-7, Sm MC-7721 and Hep G2, and DEK knockdown efficiency in each group of lentivirus-infected cells. Cell proliferation ability, cloning ability, apoptosis and migration ability were detected by cell counting kit-8 (CCK8), flow cytometry and scratch test, respectively. The t-test was used to compare the mean between the two groups, and one-way ANOVA was used to compare the multiple groups.

Results

Enzymatic digestion and DNA sequencing results confirmed that the recombinant lentiviral vectors pLKO.1-sh h DEK1 and pLKO.1-sh h DEK3 were successfully constructed. RT-PCR and Western blot results showed that the expression of DEK in human liver cancer cells BEL-7402 and Huh7 cells was higher, and pLKO.1-sh h DEK3 was more effective in inhibiting the DEK gene expression (P＜0.05). Therefore, pLKO.1-sh h DEK3 was selected to infect BEL-7402 and Huh7 cells for subsequent functional experiments. CCK8 cell proliferation test result showed that the cell proliferation ability of BEL-7402 and Huh7 cells infected with recombinant lentivirus was weakened when compared with blank control and negative control group (P＜0.05). Apoptosis results showed that the apoptosis rate of knockdown group was higher than that of blank and the negative control group (P＜0.05). Cell scratch test result showed that the wound healing rate of knockdown group was lower than that of blank control and negative control group (P＜0.05), and the difference was statistically significant; however, there was no statistically significant difference between blank control and negative control group.

Conclusion

Targeting DEK expression in silent liver cancer cells can inhibit the cell proliferation, migration ability, and induce apoptosis, which lays the foundation for further study of the role of DEK gene in liver cancer.

肝癌是最常见的原发性恶性肿瘤之一，具有早期诊断困难、发展迅速、恶性程度高、治疗困难和病死率高等特点，对人类的健康和生存造成了严重的威胁^[1]。肝癌的发生是多种因素协同作用的结果，与多种基因的表达异常有直接或间接联系。寻找引发肝癌发生的关键分子并探索治疗手段成为目前肝癌研究领域的热点。DEK蛋白是多细胞生物体内含量丰富的可磷酸化的核蛋白，人类DEK基因编码蛋白由375个氨基酸组成，是细胞核内的常染色质蛋白，也是一种原癌蛋白，最早在t（6;9）（p23；q34）易位的急性髓细胞白血病亚型中被发现，并以DEK-CAN融合蛋白的形式被分离出来，定位于6P22.3染色体^[2]。研究表明，DEK基因在结肠癌、宫颈癌等多种人类肿瘤中有高表达，与肿瘤的发生和转移有关^[3,4,5]。DEK积极参与转录调控^[6,7]，且与DNA修复和细胞周期控制密切相关^[8]。近年来的研究发现在卵巢癌细胞中干扰DEK的表达后，检测到细胞的增殖能力降低，而凋亡增加^[9]。DEK在肺癌组织中高度表达，正调节肺癌细胞的增殖和侵袭^[10]，促进凋亡^[11]。但DEK基因对肝癌的影响及其作用机制尚不明确，研究尚少。因此，本研究通过RNA干扰技术沉默肝癌细胞中DEK基因的表达，研究DEK表达下调后肝癌细胞的增殖、凋亡及迁移情况，以期为该病的分子诊断及靶向治疗提供理论基础。

材料与方法

一、材料

1.细胞系、质粒：人肝癌细胞系Bel-7402、Huh7、SMMC-7721、Hep G2及包装细胞293T感受态大肠杆菌DH5 α、pLKO.1-puro载体均由本实验室保存。

2.主要试剂：DMEM高糖培养基购自美国Hy Clone公司；胎牛血清、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液购自美国Gibco公司；3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）单克隆抗体、DEK多克隆抗体购自美国Proteintech Group公司；细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8, CCK-8）细胞增殖-毒性检测试剂盒购自东仁化学科技有限公司；Prime Script^TMRT reagent Kit with g DNA Eraser（Perfect Real Time）逆转录试剂盒、1000bpDNA分子量标准、10000bpDNA分子量标准购自宝日生物技术有限公司；无内毒素质粒小量快速提取试剂盒购自杭州昊鑫生物科技股份有限公司；polybrene购自Sigma公司，引物合成及测序由擎科生物公司完成。

二、方法

1.DEK shRNA慢病毒质粒的构建及鉴定：在Sigma mission数据库中搜索人DEK基因的shRNA干扰序列得到3个干扰序列（表1）。

表1. DEK的shRNA干扰靶序.

序号	物种	序列（5'-3'）	靶位
DEK/PLKO.1RNAi#1	人	CCGGTGAAATTGAGAGGATACATTTCTCGAGAAATGTATCCTCTCAATTTCATTTTTG	422-479
DEK/PLKO.1RNAi#2	人	CCGGAGGCACTGTGTCCTCATTAAACTCGAGTTTAATGAGGACACAGTGCCTTTTTTG	506-563
DEK/PLKO.1RNAi#3	人	CCGGTGACTAAAGTACCAGATTATACTCGAGTATAATCTGGTACTTTAGTCATTTTTG	524-581

按照RNA干扰序列设计原则，设计并合成针对DEK基因shRNA的两段寡核甘酸序列（oligo）（表2），分别将合成的oligo退火处理形成双链寡核苷酸，与经Age I和Eco RI双酶切的shRNA表达载体pLKO.1-puro连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆提质粒进行酶切及测序鉴定，重组质粒命名为pLKO.1-sh h DEK1、pLKO.1-sh h DEK2、pLKO.1-sh h DEK3。

表2. shDEK oligo序列.

DEK/PLKO.1RNAi#1-F	5'-CCGGTGAAATTGAGAGGATACATTTCTCGAGAAATGTATCCTCTCAATTTCATTTTTG-3'
DEK/PLKO.1RNAi#1-R	5'-AATTCAAAAATGAAATTGAGAGGATACATTTCTCGAGAAATGTATCCTCTCAATTTCA-3'
DEK/PLKO.1RNAi#2-F	5'-CCGGAGGCACTGTGTCCTCATTAAACTCGAGTTTAATGAGGACACAGTGCCTTTTTTG-3'
DEK/PLKO.1RNAi#2-R	5'-AATTCAAAAAAGGCACTGTGTCCTCATTAAACTCGAGTTTAATGAGGACACAGTGCCT-3'
DEK/PLKO.1RNAi#3-F	5'-CCGGTGACTAAAGTACCAGATTATACTCGAGTATAATCTGGTACTTTAGTCATTTTTG-3'
DEK/PLKO.1RNAi#3-R	5'-AATTCAAAAATGACTAAAGTACCAGATTATACTCGAGTATAATCTGGTACTTTAGTCA-3'

2.慢病毒包装：将293T细胞接种于6孔板，转染时密度约为80%，转染前2h换为无血清培养基（无抗生素）。实验分组：（1）阴性对照组：不含shDEK的pLKO.1空载；（2）KD1组：包装pLKO.1-sh h DEK1重组质粒；（3）KD2组：包装pLKO.1-sh h DEK3重组质粒；（3）绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）对照组：包装含GFP的空载体，表达荧光，作为慢病毒包装效率的对照。将包装质粒PSPAX2 1500ng、包膜质粒PMD2.G 500ng分别与2 μg上述质粒混匀，DMEM补加至100μl混合，将PEI（16μl）工作液加入到DNA稀释液中，轻轻混匀，室温下温育25min后将转染复合物加到293T细胞培养液内。培养12h后更换完全培养基，24h后观察GFP荧光确定包装效率，48h后收集含有慢病毒的上清液，离心去除沉淀，分装后置于-80℃冰箱中保存。

3.mRNA及蛋白水平筛选肝癌细胞株：培养肝癌细胞Bel-7402、Huh-7、SMMC-7721和Hep G2，按照TRIzol RNA试剂盒说明书步骤操作，反转录成cDNA，然后以cDNA为模板，以荧光定量PCR的方法扩增DEK mRNA，RT-PCR检测各组细胞中DEK mRNA的表达。DEK引物序列：上游为TCTGTGAGGTTCTTGATTTGGA，下游CTGTTCCGTTCCTTTTTACTGC。GAPDH引物序列：上游为GTGAAGGTCGGAGTCAACG,下游为TGAGGTCAATGAAGGGGTC。反应体系（20μl）:2× SYBR Premix EX Taq Ⅱ 10μl, PCR Forward Primer (10μmol) 0.8μl, PCR Reverse Primer (10μmol) 0.8μl, DNA模板2.0μl，灭菌蒸馏水6.0μl。反应条件：步骤1：95℃30s，步骤2：PCR反应GOTO 39, 95℃ 5s,60℃ 30s，步骤3：Melt Curve。每个样品设置6个重复，利用2^-△△Ct法计算肝癌细胞中DEK mRNA相对表达量。2^-△△Ct为基因相对表达，△△Ct=（Ct_目的基因-Ct_{内参照基因}）实验组（Ct目的基因-Ct内参照基因）对照组。同样收集各组肝癌细胞，加3倍体积RIPA，冰上裂解30min后，12000r/min离心15min，吸取上清液于-80℃保存。使用BCA法测定蛋白浓度。加入5×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液，煮沸10min，经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭后第一抗体（1∶1000）4℃过夜孵育，TBST清洗3次后室温下第二抗体（1∶1000）孵育1h，TBST清洗3次，滴加显影液显色，在成像仪中曝光。

4.慢病毒感染肝癌细胞：将肝癌细胞Bel-7402、Huh7接种于6孔板，分别设置以下分组：（1）空白对照组：仅含Bel-7402、Huh7细胞；（2）阴性对照组：感染pLKO.1空载慢病毒；（3）KD1组：感染pLKO.1-sh h DEK1重组慢病毒；（4）KD2组：感染pLKO.1-sh h DEK3重组慢病毒。细胞融合至50%左右，配制DMEM∶病毒液=1∶1（polybrene，8μg/ml），细胞换液。连续培养24 h后更换为完全培养基，继续培养48～96h后加入嘌呤霉素（1～2μg/ml）连续筛选2周左右后验证敲低效率。

5.mRNA水平及蛋白水平检测DEK shRNA的干扰效率：收集上述慢病毒感染后的各组细胞，检测DEK在mRNA和蛋白水平的敲低效率，实验步骤如3所示。

6.CCK-8检测细胞增殖：收集感染后细胞，以2×10³个/孔接种于96孔细胞培养板中，每组6个复孔，置于37℃、5%的CO₂培养箱中培养，分别于12、24、48h和72h向每孔中加入CCK8试剂10μl，继续孵育1h，酶标仪测定在450nm波长处各组的吸光度（A值）。实验重复3次。

7.Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡：收集感染后细胞，待长到一定密度时用不含EDTA的胰酶消化细胞，收集于离心管离心，弃上清液，磷酸盐缓冲液（PBS）重悬计数。取约10⁶个细胞于EP管离心，吸出上清液，用1×Binding buffer清洗，离心后再次以100μl Binding buffer重悬细胞，先加入5μl Annexin-V避光放置20 min，再加入5μl PI染色10min，1h内上机测试分析。实验重复3次。

8.划痕实验检测细胞的迁移能力：取6孔板，先用记号笔在背后均匀地划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。在孔中加入5×10⁵个细胞，细胞铺满后，用100μl枪头在直尺辅助下，垂直于背后横线快速划出一条宽窄均匀的道，用PBS轻柔洗涤3次，去掉划掉的细胞，加入无血清无抗生素的基础培养基于37℃、5%CO₂条件下培养，在处理后0、6、12h和24h分别定点拍照。划痕愈合百分比（%）=（0h划痕面积-24h划痕面积）/0h划痕面积×100%。实验重复3次。

9.统计学方法：所有数据以均数表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，两样本均数间比较采用t检验，多样本均数间比较采用单因素方差分析，P＜0.05被认为差异有统计学意义。

结果

1.阳性克隆的酶切及测序鉴定：将得到的pLKO.1-sh h DEK 1、2、3重组质粒，每种各3个，分别进行Age I单酶切，同时以不进行酶切处理作为对照，空载pLKO.1的大小为8901bp，3个干扰片段大小均为58 bp，酶切后的重组质粒条带比未进行酶切的重组质粒条带位置略高，结果显示pLKO.1-sh h DEK1、2、3构建成功的重组质粒分别为5、6、9、10、11、12、13、14、17、18（图1）。测序结果表明pLKO.1-sh h DEK1、3插入的干扰序列完全正确，重组质粒构建成功（图2）。

图1. 3种重组慢病毒质粒的单酶切鉴定.

注：1～6为PLKO.1-sh h DEK1重组质粒；7～12为PLKO.1-sh h DEK2重组质粒；13～18为PLKO.1-sh h DEK3重组质粒；1、3、5、7、9、11、13、15、17表示未进行酶切的重组质粒；2、4、6、8、10、12、14、16、18表示进行Age I单酶切的重组质粒

图2. 3种重组慢病毒质粒DNA测序结果.

2.慢病毒质粒转染293T细胞的荧光结果：四种慢病毒质粒转染293T细胞24h后，GFP空载对照组在荧光显微镜下可见大量绿色荧光，对比明视野下293T的生长情况，表明有大量质粒转入293T细胞，慢病毒包装成功（图3）。

图3. 293T细胞转染慢病毒质粒后的荧光图×100.

注：A：明视野；B：荧光视野

3.筛选DEK基因表达量高的肝癌细胞株：分别从mRNA及蛋白水平检测人肝癌细胞株Bel-7402、SMMC-7721、Hep G2和Huh7中DEK的表达情况，实时逆转录PCR（RT-PCR）结果显示，肝癌细胞株Bel-7402、Huh7中DEK mRNA的相对表达量分别为2.14±0.17、1.66±0.08，较SMMC-7721、Hep G2的1.46±0.04、1.37±0.04高，与免疫印迹法（Western blot）结果一致（图4），因此选择Bel-7402、Huh7这两株细胞用于后续研究。

图4. 4种肝癌细胞株中DEK的表达.

注：A：DEK基因mRNA的表达；B：DEK蛋白的表达

4.转染DEK-shRNA后DEK基因的表达：收集嘌呤霉素筛选后的各组细胞，RT-PCR法检测转染后DEK基因的mRNA的表达水平，结果显示Bel-7402细胞中KD1、KD2组DEK的相对表达量分别为0.54±0.06、0.23±0.04均较阴性对照组的1.23±0.11明显降低（P值分别为0.0017、0.0003）；同样Huh7细胞中KD1、KD2组DEK的相对表达量分别为0.74±0.06、0.65±0.04亦较阴性对照组1.12±0.12明显降低，P值分别为0.0171、0.0007），蛋白灰度分析的结果与PCR的结果一致，差异均有统计学意义（图5）。表明两个重组质粒转入肝癌细胞均能有效地敲低DEK的表达，其中KD2组的敲低效率更高，因此选择其进行后续实验。

图5. 肝癌细胞转染DEK-shRNA后DEK的表达.

注：A：DEK基因mRNA的表达；B：DEK蛋白的表达

5.DEK基因沉默对肝癌细胞增殖的影响：通过CCK8实验得到各组细胞在12、24、48h和72h的吸光度值，结果显示Bel-7402敲低组细胞在24、48h和72h的吸光度值（0.31±0.01、0.52±0.01、0.78±0.01）较空白对照（0.42±0.04、0.61±0.07、1.33±0.08）及阴性对照（0.49±0.05、0.59±0.06、1.30±0.04）均明显降低（P值分别为0.0088、0.0166、0.0092及0.0198、0.0202、0.0021）。同样Huh7敲低组细胞在24、48和72h的吸光度值（0.33±0.01、0.54±0.06、0.81±0.07）较空白对照（0.44±0.04、0.63±0.07、1.35±0.08）及阴性对照（0.51±0.05、0.62±0.06、1.34±0.04）也明显降低（P值分别为0.0088、0.0166、0.0086及0.0198、0.0185、0.0016），差异均有统计学意义。而两种细胞的空白组及阴性对照组的吸光度值比较差异无统计学意义（图6）。提示抑制DEK的表达可以在一定程度上降低肝癌细胞Bel-7402、Huh7的增殖能力。

图6. DEK基因沉默对肝癌细胞增殖的影响.

注：A：Bel-7402肝癌细胞增殖曲线图；B：Huh7肝癌细胞增殖曲线图，^a:P＜0.05,^b:P＜0.01

6.DEK基因沉默对肝癌细胞凋亡的影响：流式结果显示Bel-7402、Huh7敲低组细胞凋亡率（13.53%±0.26%、13.36%±0.39%）明显高于空白对照组和阴性对照组（5.94%±0.40%、5.95%± 0.42%和6.36%±4.50%、6.45%±0.47%），（P值分别为0.00002、0.0003和0.00008、0.00009）差异均有统计学意义。而两种细胞空白对照与阴性对照组的凋亡率比较差异无统计学意义（图7）。提示抑制DEK的表达可以在一定程度上诱导肝癌细胞Bel-7402、Huh7的凋亡。

图7. DEK基因沉默对肝癌细胞凋亡的影响.

7.DEK基因沉默对肝癌细胞迁移的影响：划痕实验结果显示Bel-7402、Huh7空白对照组、阴性对照组及敲低组细胞0、24h的划痕图比较，24h的划痕间距均较0h的划痕间距缩小，敲低组细胞划痕间距缩小的程度较空白对照组及阴性对照组低（图8A）。进一步将各组细胞的划痕图进行划痕面积分析后计算划痕愈合率，结果显示Bel-7402、Huh7敲低组细胞划痕愈合率（13.88%±3.11%,12.81%±4.31%）明显低于空白对照组和阴性对照组（39.54%±3.43%、40.21%±5.88%和66.73%±4.26%、69.50%±6.63%），（P值分别为0.0014、0.0050和0.0002、0.0005）差异均有统计学意义。而两种细胞各自的空白对照组及阴性对照组细胞的划痕愈合率差异无统计学意义（图8B）。提示抑制DEK的表达可以在一定程度上抑制肝癌细胞Bel-7402、Huh7的迁移能力。

图8. DEK基因沉默对肝癌细胞划痕愈合能力的影响.

注：1：空白对照组；2：阴性对照组；3：敲低组；A:Bel-7402、Huh7细胞0h、24h的划痕实验结果；B：Bel-7402、Huh7细胞的划痕愈合率

讨论

恶性肿瘤的发生、发展是一个包含多个关键分子、多条信号通路的多步骤的生物学过程，致癌基因的激活和肿瘤抑制基因失活是恶性肿瘤起始和发展的关键步骤，肿瘤细胞在此过程中会经历一个多基因的变化过程，多种肿瘤的生物标志物在肿瘤中的作用受到了广泛关注^[12]。DEK作为染色质相关的结构蛋白，高度表达于大多数人类组织细胞中，参与调节分子的活性和多个信号转导途径，在癌症组织中DEK基因存在过表达，参与癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭转移等多种生物学行为，发挥促进癌细胞增殖和阻滞其分化的作用，进而促进癌症的发生和发展^[13,14]。

目前DEK在肝癌中的研究较少，为了探索DEK影响肝癌发生、发展的机制，本研究通过RNAi原理，设计3条针对DEK不同靶点的shRNA序列，化学合成3段shRNA片段，将其连接到慢病毒载体pLKO.1上构建重组pLKO.1-sh h DEK表达载体，将其转染到293T细胞包装成慢病毒后感染肝癌细胞株Bel-7402、Huh7，通过Western blot及Real-time PCR的方法筛选3个不同靶点的干扰效率，且Western blot和PCR的结果一致，成功筛选出5′-CCGGTGACTAAAGTAC CAGATTATACTCGAGTATAATCTGGTACTT TAGTCATTTTTG-3′；靶点序列的shRNA干扰效果最佳。将最佳干扰序列的重组质粒包装成慢病毒后感染肝癌细胞株Bel-7402、Huh7，通过CCK-8细胞增殖实验，发现DEK敲低能明显抑制Bel-7402、Huh7肝癌细胞的增殖能力，提示抑制DEK的表达可以在一定程度上降低肝癌细胞Bel-7402、Huh7的增殖能力。Xu等^[3]使用慢病毒干扰载体抑制人宫颈癌细胞系Si Ha中DEK的表达，CCK-8实验结果显示干扰DEK表达后细胞增殖能力明显降低。U251胶质母细胞瘤细胞中用siRNA沉默DEK基因后同样发现细胞增殖能力降低^[15]，这与本实验的研究结果相一致。流式检测细胞凋亡的结果表明DEK的表达降低后，细胞的凋亡率明显升高，这与Yamazaki等^[16]应用DEK特异性siRNA干扰4种犬移行细胞癌细胞系中DEK的表达，进行膜联蛋白V染色评估细胞凋亡数量明显增加，直肠癌SW-620、HCT116细胞系，U251胶质母细胞瘤细胞中下调DEK的表达后，检测发现细胞凋亡同样增加^[14]的研究相一致。划痕实验结果也表明DEK表达降低后细胞的迁移能力降低，在胃癌细胞系AGS和SGC-7901中抑制DEK的表达后，细胞的迁移能力同样降低^[17]。综上所述，肝癌细胞Bel-7402、Huh7中DEK敲低后增殖能力、迁移能力降低，而凋亡增加，为进一步的机制研究奠定了实验基础。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明

李术华：设计研究方案，进行实验，数据整理，分析数据，负责论文起草以及最终版本修订；陈哲、吴韦铷、吴传新：实验指导、技术支持；侯宇：实验指导，研究经费支持；孙航：提出研究思路，设计研究方案，实验指导，文章修改，获取研究经费

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（81871608,81670096）

Fund program: National Natural Science Foundation of China (81871608, 81670096)