Abstract
目的
通过小鼠动物模型探讨阳离子抗菌肽Cathelicidin-PY（PY）治疗急性肝衰竭的可行性。
方法
内毒素鲎试验（LAL assay）检测不同浓度抗菌肽PY体外中和内毒素/脂多糖（LPS）能力；CCK-8法检测不同浓度抗菌肽PY对小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）的毒性作用；体外溶血实验评价抗菌肽PY对健康人红细胞的溶血活性；构建D-氨基半乳糖联合LPS诱导的小鼠急性肝衰竭模型，观察抗菌肽PY对模型小鼠存活率的影响；通过HE染色观察肝脏病理学变化，并通过免疫组织化学、蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase-3的表达。组间比较采用t检验、方差分析，率的比较采用x2检验。
结果
体外实验显示极低剂量（0.01 μmol/L）可达到较高的内毒素中和率，中等剂量（10～40 μmol/L）中和率可超过70%，且不同浓度组间比较，差异有统计学意义（F= 569.22，P＜0.05）。中等剂量抗菌肽PY有较强的中和内毒素作用，较低的细胞毒性及溶血活性。进一步体内实验显示中等剂量抗菌肽PY可改善模型小鼠的肝脏损伤程度并显著提高存活率，且免疫组织化学检测结果显示中等剂量抗菌肽组较肝衰竭组肝组织内Caspase-3表达明显减少，与蛋白质印迹法检测结果一致。
结论
抗菌肽PY具有较强中和内毒素的能力且毒副作用小，特定剂量抗菌肽PY可以减轻肝细胞凋亡，并显著提高模型动物存活率，为肝衰竭治疗的研究提供了新思路。
Keywords: 急性肝衰竭, 内毒素/脂多糖, 抗菌肽, 阳离子抗菌肽, Cathelicidin-PY
Abstract
Objective
To investigate the feasibility of cationic antimicrobial peptide cathelicidin-PY(PY) therapy through a mouse model of acute liver failure.
Methods
The ability of different concentrations of antimicrobial peptide PY to neutralize endotoxin /lipopolysaccharide (LPS) in vitro was detected by Limulus Amebocyte Lysate (LAL) assay. Cell counting kit-8 (CCK-8) was used to detect the toxic effect of different concentrations of antimicrobial peptide PY on mouse monocyte macrophages (RAW264.7). An in vitro hemolysis experiment was used to evaluate the activity of antimicrobial peptide PY on healthy human erythrocytes. D-galactosamine combined with LPS- induced mouse model of acute liver failure was constructed. The antimicrobial peptide PY effect on survival rate of mouse model was observed. HE staining was used to observe the pathological changes of liver tissue. Immunohistochemistry and Western blotting were used to detect the expression of apoptosis-associated protein caspase-3. Intra-group comparisons were performed using t-test and analysis of variance. x2 test was used for the comparison of rates.
Results
An in vitro experiment showed that the endotoxin neutralization rate was higher at very low dose (0.01 μmol/L),and exceeded 70% at medium-dose (10-40 μmol/L), and the difference between groups with different concentration was statistically significant (F=569.22, P＜0.05). Medium-dose antimicrobial peptide PY had strong endotoxin neutralizing effect, low cytotoxicity and hemolytic activity. Moreover, in vivo experiments showed that the degree of liver injury and survival rate of mouse model was significantly improved with the medium-dose of antimicrobial peptide PY. Immunohistochemistry results showed that the expression of caspase-3 in the liver tissue was significantly depleted in the medium-dose group than that of the liver failure group, and the results were consistent with protein immunoblotting testing.
Conclusion
Antimicrobial peptide PY possesses a strong ability to neutralize endotoxin and few toxic side effects. A specific dose of antimicrobial peptide PY can attenuate hepatocyte apoptosis and significantly improve the survival rate of animal model, and thus provides a new idea for the liver failure treatment.
Keywords: Acute hepatic failure, Endotoxin/Lipopolysaccharide, Antimicrobial peptides, Cationic antimicrobial peptides, Cathelicidin-PY
肝衰竭是由多种因素引起的肝脏合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍，导致肝脏功能严重失代偿，出现以黄疸、凝血机制障碍、肝性脑病以及腹水等为主要表现的一组临床症候群[R1]。肝衰竭发病急、进展快、并发症多、预后差、死亡率高，寻找新的肝衰竭治疗手段势在必行。以肠源性内毒素血症为核心的继发性肝脏损伤是导致肝衰竭病情迅速进展的重要原因。因此，迅速控制感染对降低肝衰竭病死率起着至关重要的作用。抗生素应用伴随而来的细菌耐药性、抗生素相关肝肾等损伤及抗菌疗效等均是所面临的现实问题。抗菌肽是一类由生物免疫系统诱导产生的活性多肽，具有强抗菌活性、弱细胞毒性及低耐药性等特点[R2]。基于此，本研究通过体外实验及小鼠肝衰竭动物模型探讨抗菌肽PY治疗肝衰竭的可行性。
材料与方法
1.实验动物及细胞来源：采用BALB/C小鼠[常州卡文斯实验动物（许可证号：SCXK1苏12011-0003）]，8周龄，体质量（21.71±1.31）g，本动物实验已获得动物伦理批准[（2018）伦审批第177号]；RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞）为上海瑞金医院感染科赵刚德博士馈赠；红细胞为健康人红细胞。
2.主要试剂：Cathelicidin-PY[PY，吉尔生化（上海）有限公司合成]、LAL QCL-1000TM试剂盒购自Beyotime（碧云天）公司，CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒（Dojindo）购自同仁化学研究所，ALEXA FLUOR 488 ANNEXIN V/DEAD双染色流式法细胞凋亡检测试剂盒Annexin和PI购自美国invitrogen公司，D-氨基半乳糖、脂多糖（LPS，1mg/ml购自美国Sigma公司。
3.体外实验方法：采用LAL检测不同浓度抗菌肽PY（0.01 μmol/L、10 μmol/L、40 μmol/L、100 μmol/L）体外中和内毒素能力；用CCK-8法检测不同浓度抗菌肽PY（10 μmol/L、40 μmol/L、100 μmol/L）对小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）的毒性作用；用体外溶血实验评价不同浓度抗菌肽PY（10 μmol/L、40 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）对健康人红细胞的溶血活性。
4.抗菌肽PY对急性肝衰竭模型小鼠存活率的影响：将实验动物随机分为5组，每组7只，其中3组作为实验组，分别用不同浓度抗菌肽PY预处理，浓度分别为6mg/kg（PY6组）、3mg/kg（PY 3组）、1.5mg/kg（PY 1.5组）。另2组分别作为对照组（等渗盐水）和肝衰竭组。实验组从小鼠尾静脉注入不同浓度抗菌肽PY；肝衰竭组、对照组注射相应体积等渗盐水。实验组、肝衰竭组按700 mg/kg腹腔注射D-氨基半乳糖等渗盐水溶液、35 μg/kg腹腔注射脂多糖等渗盐水溶液；对照组腹腔注射同等量等渗盐水。每组中5只用于观察存活状况，每2h记录小鼠的死亡数量，总计观察48h。另每组2只于造模5h处死小鼠并取肝组织，分别置于4%福尔马林溶液及-80℃保存备用。采用HE染色检测各组小鼠肝脏的病理变化，并通过免疫组织化学及蛋白质印迹法（Western blot）检测各组小鼠肝组织中Caspace-3的表达。
5.统计学方法：用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（
±s）表示，组间比较采用t检验、方差分析，率的比较采用x2检验。P＜0.05为差异有有统计学意义。
结果
1.抗菌肽PY有很强的中和内毒素作用：极低剂量（0.01 μmol/L）可达到较高的中和率，中等剂量（10～40 μmol/L）中和率可超过70%，且不同浓度组间比较，差异有统计学意义（F= 569.22，P＜0.05）。抗菌肽PY对RAW 264.7毒性有明显的剂量依赖性，在较高剂量（100 μmol/L）时，有较强的细胞毒性，而在中等剂量细胞毒性明显下降，且组间比较，差异有统计学意义（F= 273.80，P＜0.05）。抗菌肽PY具有较低的溶血活性，在很高浓度（200 μmol/L）时表现较弱的溶血活性，而在中等剂量仅表现极轻微的溶血活性，且组间比较，差异有统计学意义（F=1489.68，P＜0.05），见表1，图1。
表1. 不同浓度抗菌肽PY中和作用、细胞毒性及溶血活性比较（±s）.
| PY浓度（μmol/L） | 中和率（%） | 细胞毒性（A450） | 溶血活性（A450） |
|---|---|---|---|
| 200 | 1.102±0.003 | ||
| 100 | 98.30±0.70 | 0.268±0.015 | 0.452±0.002 |
| 40 | 80.18±1.34 | 0.711±0.085 | 0.200±0.035 |
| 10 | 70.88±1.45 | 1.194±0.438 | 0.081±0.015 |
| 0.01 | 41.52±1.69 |
注：不同浓度抗菌肽PY在中和率及细胞毒性、溶血活性组间比较差异有统计学意义， P<0.05
图1. 不同浓度抗菌肽PY的中和率、细胞存活率和溶血活性比较.
注：中等剂量PY有很高的中和率、较高的细胞存活率及极低的溶血百分数（细胞中和率、细胞存活率、溶血百分数计算公式参照相关试剂盒说明书）
2.抗菌肽PY对模型小鼠存活率的影响：D-氨基半乳糖与LPS造模的肝衰竭小鼠，5h后小鼠开始出现活动减少，精神萎靡，厌食，部分出现抽搐现象，6h后开始出现死亡，肝衰竭组在10h全部死亡，而不同剂量抗菌肽PY预处理的小鼠，除了PY1.5组小鼠改善情况不明显，其余组病死率均有不同程度的改善，48h后评估中等剂量（3mg/kg）组小鼠存活率最高（图2）。
图2. 抗菌肽PY对肝衰竭模型小鼠保护作用.
3.肝组织HE染色结果：给药5h后取肝组织，HE染色结果示正常肝组织细胞质呈嗜酸性，细胞核被染成蓝色，大而圆，居中央。染色质丰富，核膜清楚。肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，中央静脉完整。而肝衰竭组肝细胞大片崩解坏死，肝索解离，小叶结构模糊不清，肝窦明显扩张充血并出血，小叶内及汇管区有炎细胞浸润，残存肝细胞水肿变性。肝组织破坏程度：PY 1.5组＞肝衰竭组＞PY 6组＞PY 3组；相较于肝衰竭组，PY 1.5组肝细胞坏死、肝小叶结构破坏及炎细胞浸润情况明显加重；其余组肝组织损害程度均有不同程度的改善。见图3。
图3. 小鼠肝脏大体图及HE染色结果.
注：A：对照组；B：肝衰竭组；C：PY 1.5；D：PY 3；E：PY 6
4.肝组织免疫组织化学检测结果：Caspase-3免疫组织化学检测结果显示其胞质表达，免疫反应阳性细胞内有棕黄色颗粒，位于胞质及胞膜处。正常对照组无或少量阳性表达，肝衰竭组阳性表达明显升高；阳性表达程度：PY 1.5组＞肝衰竭组＞PY 6组＞PY 3组＞对照组（图4）。
图4. 免疫组化法检测肝组织Caspase-3（激活型）表达DAB×高倍.
注：A：对照组；B：肝衰竭组；C：PY 1.5组；D：PY 3组；E：PY 6组
5.肝组织Western blot结果：以各条带的内源性β-actin为内参照，计算X胶片Caspase-3（激活型）/β-actin显影灰度比值。Western blot电泳结果如图5，对照组（面积灰度比值为0.14）、肝衰竭组（面积灰度比值为1.70）、PY 1.5组、PY 3组、PY 6组（面积灰度比值分别为2.37、0.24、0.26），灰度比值：PY 1.5组＞肝衰竭组＞PY 6组＞PY 3组＞对照组，与HE染色结果一致。进一步两两比较，对照组、PY 3组、PY 6组分别与肝衰竭组之间存在差异，且差异有统计学意义（t=5.493，P＜0.05；t=5.229，P＜0.05；t =5.203，P＜0.05）；PY 1.5组与PY 3组、PY 6组之间存在差异，且差异有统计学意义（t=6.372，P＜0.05；t=6.344，P＜0.05）。
图5. 蛋白质印迹法检测肝组织Caspase-3（激活型）表达.
讨论
抗菌肽是机体自然免疫系统的重要组成部分，具有较强的中和内毒素能力，它能直接中和LPS，抑制炎性细胞因子的过度产生释放从而控制炎症反应，亦可通过趋化白细胞、促进免疫细胞增殖等来影响获得性免疫，从而调节宿主免疫系统发挥保护作用[3，4，5]。研究发现，抗菌肽对哺乳类动物细胞损害很小，同时研究也发现抗菌肽主要通过影响细胞质膜来发挥作用，其杀菌机制不涉及受体机制，避免了多重耐药菌对其产生耐药性[6，7，8]。
迄今发现的抗菌肽已多达2500余种，国内外专家对其抗菌活性、耐药性等特性进行了多方面的研究[R9]。近年来，多肽药物在疾病治疗中越来越受到重视，美国食品药品监督管理局在过去的几年中批准了10余种多肽类药物[10，11]，其中一些已经或即将进入临床试验，如培西加南已完成了治疗糖尿病足坏疽的Ⅲ期临床试验[R12]。但是目前抗菌肽在临床研究仅限于少数疾病，且由于其来源少而相对不良反应多等问题，临床应用相对局限，而在肝脏相关疾病尤其是肝衰竭中更是鲜有研究。
Cathelicidin-PY是近几年发现的一种新型抗菌肽，目前国内外对其在肝衰竭领域研究尚少。本研究体外实验可知，极低剂量的PY就可具有较高的中和LPS作用，极高剂量的PY其溶血活性相对较低，而细胞毒性相对较高，中等剂量PY具有很高的中和内毒素作用，较高的抑制细胞凋亡能力，极低的溶血活性、细胞毒性，这与既往的研究一致[R13]。既往研究可知以肠源性内毒素血症为核心的继发性肝脏损伤是导致肝衰竭病情迅速进展的重要原因。本研究借助LPS与D-氨基半乳糖诱导小鼠急性肝衰竭模型，进一步研究阳离子抗菌肽对急性肝衰竭小鼠的保护作用。体内实验中抗菌肽PY预处理肝衰竭模型小鼠，结果显示中等剂量的抗菌肽PY可以显著提高肝衰竭模型小鼠的存活率，其同组小鼠的肝组织外观较正常肝组织无明显差异，肝细胞坏死、肝小叶结构及炎症浸润情况明显改善。其作用机制考虑为抗菌肽PY可以通过中和LPS作用从而显著抑制Toll样受体（TLR）4的表达，从而抑制TLR4/CD14介导LPS诱导的炎性反应的重要信号通路，进一步阻止肝细胞损伤，阻止并改善肝衰竭的发生及发展。既往体外研究亦有类似的报道，20 μg/ml cathelicidin-PY可显著抑制LPS-介导的肿瘤坏死因子α、白细胞介素-6，和单核细胞趋化蛋白1产生及TLR4的表达[13，14，15]。然而结果同时也表明较低或较高剂量抗菌肽处理组小鼠的存活率均较低，尤其PY 1.5组模型小鼠的病死率最高，其肝细胞坏死、肝小叶结构破坏及炎细胞浸润情况较肝衰竭组还要明显加重，这与以上体外研究是一致的，而究其原因考虑可能为低剂量的抗菌肽其中和作用不足以弥补其对细胞的毒性作用，反而加重了肝细胞凋亡有关，而具体的原因及作用机制需要进一步探索研究。
本研究结果显示，抗菌肽Cathelicidin-PY有很强的抗菌活性、中和LPS能力，同时具有较低的细胞毒性、溶血活性等特点，特定剂量PY对小鼠肝衰竭模型具有一定的保护作用，有望成为肝衰竭治疗的新选择。作为一种新发现抗菌肽，它具体的杀菌机制及调节免疫反应的信号通路还不是很明了，而且对它的改造及临床研究还任重道远，需要我们进一步深入研究和探讨。
作者贡献声明
王艳：研究设计、资料收集、撰写文章；黄小平：指导研究设计、审改文章；甘建和：指导研究设计，给予本研究经费支持
利益冲突
所有作者均声明不存在利益冲突
Funding Statement
基金项目：“十二五”国家科技部“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项子课题：免疫调节结合人工肝支持技术治疗重型乙型肝炎（肝衰竭）的应用研究（2012ZX10002004-008）
Fund program: Sub-topics of National Key Science and Technology Program for Infectious Diseases of AIDS and Viral Hepatitis during the 12th Five-Year Plan Period (2012ZX10002004-008)
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