单酰基甘油酯酶对MHCC97H肝癌细胞体内增殖的影响

Abstract

Objective

To investigate the effects of different expression of monoacylglycerol lipase (MAGL) in tumor-associated macrophages(TAMs) with the proliferation of MHCC97H human liver cancer cells in vivo and its mechanism.

Methods

H uman peripheral blood-derived monocyte was induced to differentiate into M2-type TAMs and was identified by flow cytometry. The co-culture model of TAMs and MHCC97H human liver cancer cells was established, and the expression of MAGL in TAMs cells was detected by qRT-PCR. The expression of MAGL in TAMs cells was detected by plasmid transfection. ELISA and qRT-PCR was used to detect the mRNA expression levels and secretion levels of inflammatory factors in TAMs cells. The subcutaneous tumor model of MHCC97H mice was constructed to observe the effect of different expression of MAGLin TAMs cells with the proliferation of MHCC97H human liver cancer cells in vivo. F-test was used for the measurement of homogeneity of variance between two independent samples. A t-test was used for homogeneity of variance,and the corrected t-test was used for non-homogeneity of variance.

Results

Human peripheral blood-derived monocytes were successfully induced to differentiate into M2-type TAMs. An in vitro co-culture model was established. qRT-PCR showed that MHCC97H human liver cancer cells significantly down-regulated the expressional level of MAGL in TAMs cells. The constructed subcutaneous tumor model of mice demonstrated that up-regulation up-regulation of MAGL expression in M2-type TAMs inhibited the proliferation of MHCC97H human liver cancer cells in vivo. Furthermore, the mechanistic study illustrated that the high expression of MAGL promoted the transcription and secretion of inflamm atory factors such as interleukin-1 beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha in M2-type TAMs cells.

Conclusion

The overexpression of MAGL inhibits the proliferation of MHCC97H hepatocellular carcinoma cells in vivo, and its mechanism may be associated to the release of inflammatory factors that from TAMs cells.

原发性肝癌是我国第2大常见肿瘤致死原因，其发病率居全球肿瘤第6位，死亡率居第2位^[1，2]。目前，肝癌防治研究的视角已聚焦于肿瘤微环境中肿瘤细胞与基质细胞之间的信息传递。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是肿瘤组织内浸润数目最多的免疫细胞，与肿瘤的进展及预后密切相关。目前认为TAMs倾向于巨噬细胞M2极化表型，分泌Th2细胞因子，促进肿瘤进展^[3]。因此，明确肿瘤微环境中肝癌细胞与TAMs相互作用机制将为突破肝癌防治瓶颈提供思路。

单酰基甘油酯酶（monoacylglycerol lipase，MAGL）属于丝氨酸水解酶超家族，是调控细胞内脂质信号网络和内源性大麻素系统的代谢中枢，影响肿瘤细胞的增殖和侵袭^[4]。我们在前期研究中发现MAGL通过影响肝癌细胞上皮-间质转换过程促进肿瘤进展^[5]。最新研究结果提示MAGL在巨噬细胞中表达异常对肿瘤微环境中巨噬细胞的活化及炎性因子分泌有重要调控作用^[6]。现有研究已明确肿瘤微环境中许多炎性细胞因子，如白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等，能影响肿瘤的增殖和侵袭转移^[7]，提示MAGL可能通过调控肿瘤微环境中巨噬细胞的炎性因子分泌影响肿瘤进展。本研究主要探讨MAGL在M2型TAMs中不同表达对MHCC97H肝癌细胞体内增殖能力的影响及其机制。

材料与方法

1.材料：收集健康志愿者外周静脉血并提取单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。人肝癌细胞株MHCC97H由复旦大学肝癌研究所赠送；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、高糖DMEM培养基、RPMI 1640培养液、磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）购自美国Gibco公司；重组人巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、重组人白细胞介素IL-4及IL-13购自美国Peprotech公司；流式抗体：异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）-CD14、CD206、CD163购自美国BD公司；Trizol试剂、实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative reverse-transcription，q RT-PCR）逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司；引物由上海英俊生物科技有限公司设计合成；IL-1β、IL-6和TNF-α酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。BALB/c裸小鼠，雄性，6周龄，平均体质量约18g，购自中国科学院上海药物研究所。

2.M2型TAMs诱导分化及鉴定：按照Tjiu等^[8]实验方法诱导M2型TAMs：收集健康志愿者外周静脉血并提取PBMC细胞，流式分选获得CD14⁺单核细胞。随后，将CD14⁺单核细胞予以M-CSF（100ng/ml）诱导7d，再继续IL-4（20ng/ml）和IL-13（20ng/ml）培养3d。收集诱导完成的M2型TAMs细胞进行流式鉴定。

3.实验分组：成功诱导M2型TAMs细胞后，根据不同处理方式将TAMs细胞分为3组：用RPMI1640培养液干预的TAMs称对照组（TAMs-Control组）；予以MHCC97H细胞上清液干预后的TAMs组称为TAMs/MHCC97H-CM组；与MHCC97H细胞共培养的TAMs组称为TAMs/MHCC97H-CO组。成功诱导M2型TAMs细胞后，依据MAGL在细胞中不同表达分为2组：未质粒转染的M2型TAMs细胞称为TAMs-WT组；质粒转染MAGL的M2型TAMs细胞称为TAMs-MAGL组。

4.qRT-PCR法：qRT-PCR法检测TAMs细胞中MAGL、IL-1β、IL-6和TNF-α基因转录表达，以β-肌动蛋白（actin）作为管家基因。操作过程依照说明书。各引物序列参照表1。

表1. 各引物的序列.

基因名称		引物序列 （5 ′ → . 3 ′ ）
MAGL	正义	ATGGTAGAGTTCGCGCCCTTGTTT
	反义	TCATCATAACTCCAAGTGCTGGTCA
IL-1β	正义	ATAAGCCCACTCTACACCT
	反义	ATTGGCCCTGAAAGGAGAGA
IL-6	正义	GAGGATACCACTCCCAACAGACC
	反义	AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA
TNF-α	正义	TGGAACTGGCAGAAGAGG
	反义	AGACAGAAGAGCGTGGTG
β-actin	正义	CTGAGGACAAGCCACAAGATTA
	反义	ATCCACCAGAGTGAAAAGAACG

注：MAGL：单酰基甘油酯酶；IL-1β：白细胞介素-1β；IL-6：白细胞介素-6；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；β-actin：β-肌动蛋白。

5.ELISA法检测M2型TAMs细胞培养上清液炎症因子分泌：将TAMs-WT组及TAMs-MAGL组的M2型TAMs调整细胞密度为2×10⁵个/ml，接种于96孔板，每孔100μl。置于37℃温箱培育24h后，用ELISA试剂盒检测上清液中细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α。

6.裸鼠皮下瘤模型的建立：将MHCC97H肝癌细胞浓度调整至2.5×10⁶个/ml，接种于裸鼠背部侧腹壁皮下。2周后，将细胞浓度为1×10⁶个/ml的各组M2型TAMs细胞小鼠尾静脉注射。4周后，用卡尺测量接种的裸小鼠皮下移植瘤大小。小鼠皮下瘤体积计算公式为：肿瘤体积（mm³）=最小直径2×最大直径/2（mm³）。

7.统计学方法：用GraphPad Prism 5软件进行数据分析。实验结果以均数±标准差（±s）表示。计量资料的方差齐性检验用F检验，两独立样本均数之间的比较，方差齐者用t检验，方差不齐者用校正t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.成功诱导人外周血单核细胞分化为M2型TAMs：筛选健康人外周血来源单核细胞，予以M-CSF+IL-4+IL-13成功诱导分化为M2型TAMs。利用流式细胞术对上述成功诱导分化的巨噬细胞亚型模型进行鉴定。结果显示与未诱导组相比较，诱导组中共表达CD163及CD206表面分子的M2型TAMs细胞比例显著增加（图1A），差异具有统计学意义（图1B；t=13.50，P＜0.001）。

图1. 诱导建立人外周血单核细胞来源的M2型TAMs细胞株.

注：A：流式细胞术检测显示诱导分化的M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）中CD163⁺CD206⁺比例较未诱导组显著升高；B：诱导组与未诱导组中CD163⁺CD206⁺M2型TAMs阳性细胞比例统计分析；^a:P＜0.001

2.MHCC97H肝癌细胞下调M2型TAMs的MAGL表达：分别用RPMI 1640培养液、MHCC97H细胞上清液处理M2型TAMs（TAMs-Control组；TAMs/MHCC97H-CM组），及建立与MHCC97H细胞共培养的M2型TAMs（TAMs/MHCC97H-CO组）。qRT-PCR检测各组MAGL转录表达，结果显示MAGL相对表达量由高到低为：TAMs-Control＞TAMs/MHCC97H-CM＞TAMs/MHCC97H-CO（图2）。3组独立样本中TAMs的MAGL表达统计方法用两独立样本t检验：TAMs-Control组MAGL转录表达高于TAMs/MHCC97H-CM组，差异具有统计学意义（t=3.010，P=0.0395）；TAMs/MHCC97H-CM组的MAGL表达高于TAMs/MHCC97H-CO组，差异具有统计学意义（t=2.952，P=0.0419）。提示MHCC97H肝癌细胞下调M2型TAMs中MAGL的表达。

图2. q RT-PCR检测M2型TAMs在不同处理条件下的MAGL表达.

注：MAGL：单酰基甘油酯酶；TAMs：肿瘤相关巨噬细胞；1：TAMs-Control；2：TAMs/MHCC97H-CM；3：TAMs/MHCC97H-CO；^a：P＜0.05

3.上调M AGL表达抑制M2型TAMs对MHCC97H肝癌细胞体内增殖的促进作用：质粒转染上调MAGL在M2型TAMs细胞中表达（TAMs-MAGL组）。建立MHCC97H肝癌细胞小鼠皮下成瘤模型，予以TAMs-WT及TAMs-MAGL细胞悬液进行小鼠尾静脉注射，4周后测量小鼠皮下成瘤体积。结果显示TAMs-MAGL组的小鼠皮下成瘤体积较TAMs-WT组明显缩小（图3A），差异具有统计学意义（图3B；t=3.515，P=0.0246），说明上调MAGL在M2型TAMs的表达后，可削弱TAMs对MHCC97H肝癌细胞体内生长的促进作用。

图3. MAGL表达上调抑制TAMs对MHCC97H肝癌细胞体内增殖的促进作用.

注：MAGL：单酰基甘油酯酶；TAMs：肿瘤相关巨噬细胞；1：TAMs-WT；2：TAMs-MAGL；A：建立MHCC97H肝癌细胞小鼠皮下成瘤模型，观察MAGL不同表达的小鼠皮下荷瘤体积大小；B：分析MAGL在TAMs中高低不同表达对MHCC97H小鼠皮下成瘤体积的统计学差异；^a：P＜0.05

4.MAGL高表达促进M2型TAMs细胞的炎症因子转录及分泌：利用qRT-PCR及ELISA检测分析MAGL高低不同表达（TAMs-MAGL组；TAMs-WT组）对M2型TAMs炎症因子转录及分泌的影响。qRT-PCR检测结果显示，炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平在MAGL高表达组（TAMs-MAGL组）比低表达组（TAMs-WT组）显著升高（图4A），差异有统计学意义（IL-1β：t=5.129，P=0.036；IL-6:t=5.405，P=0.0326；TNF-α:t=4.604，P=0.0441）。同时，ELISA检测发现在M2型TAMs的细胞培养上清液中，TAMs-MAGL组分泌的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α比TAMs-WT组也明显增高（图4B），差异有统计学意义（IL-1β：t=5.742，P=0.0046；IL-6:t=4.574，P=0.0102；TNF-α:t=6.717，P=0.0026）。

图4. MAGL表达上调促进M2型TAMs细胞炎症因子表达及分泌.

注：TAMs：肿瘤相关巨噬细胞；MAGL：单酰基甘油酯酶；WT：野生型；IL：白细胞介素；TNF：肿瘤坏死因子；1：TAMs-WT组；2：TAMs-MAGL组；A：qRT-PCR检测显示M2型TAMs细胞中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平在MAGL高表达组比低表达组显著升高；B：ELISA检测发现M2型TAMs细胞培养上清液中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量在MAGL高表达组较低表达组明显增多；^a：P＜0.05；^b：P＜0.01

讨论

目前，脂质代谢重编程在肿瘤进展中的作用已得到越来越深刻的认识。肿瘤细胞需要获得脂代谢通路的适应性改变以提供其能量储备、合成细胞膜及相应的生物信号分子，从而实现其快速增殖及侵袭的恶性生物学行为^[9]。但是，对于这种代谢通路改变所赋予的肿瘤微环境中基质细胞的功能状态改变目前仍然知之甚少^[10]。本研究结果提示脂代谢关键酶MAGL高表达抑制MHCC97H肝癌细胞体内的增殖，其原因与影响TAMs细胞的炎症因子释放有关。

MAGL是脂质代谢的限速酶，调控细胞内脂肪酸网络的代谢，同时还负责内源性大麻素系统2-花生四烯酸甘油（2-arachidonoylglycerol，2-AG）的降解转化^[11]。近期研究结果显示MAGL除了作为代谢控制的整合中心角色外，它还能间接地调控促炎或促肿瘤的脂质代谢产物，影响肿瘤细胞的增殖和侵袭转移^[12]。Nomura等^[4]报道MAGL在乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤等多种人类肿瘤中高表达，能通过调节富含脂质致癌信号的脂肪酸网络促进肿瘤的生长和远处转移。我们前期研究也发现，肝癌细胞中MAGL高表达可促进肿瘤进展^[5]。目前，越来越多的研究已相继确认了MAGL在肿瘤细胞中的促肿瘤作用。然而值得注意的是，最新研究提示MAGL是髓系来源免疫细胞促炎作用的重要调控分子，其表达水平与机体炎性细胞的激活及炎症介质的释放密切相关^[6]。在本项研究中，我们发现MAGL高表达能促进TAMs细胞中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的转录及分泌。IL-1β、IL-6和TNF-α是目前公认的促炎症因子，其表达失调能影响免疫细胞的活化状态及肿瘤细胞的增殖与侵袭转移^[7]。我们在实验中也发现，上调MAGL表达促进TAMs细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α炎症介质，抑制MHCC97H肝癌细胞的体内增殖。Xiang等^[13]在乳腺癌和结直肠癌中也发现了类似的现象，实验显示MAGL在TAMs中低表达引起脂质异常积聚，诱导巨噬细胞M2极化状态及促炎因子分泌抑制，导致肿瘤微环境中抗肿瘤的CD8⁺T细胞活化受限。我们的这些发现提示MAGL在肿瘤微环境TAMs中的表达水平与肝癌细胞相反，其在TAMs表达下降扮演着促肿瘤的角色。这些结果同时提示，目前单纯地依靠靶向阻断细胞内MAGL分子表达实现抗肿瘤的策略存在一定的缺陷。因而，MAGL在肿瘤微环境TAMs细胞和肿瘤细胞中异质性表达的调控机制还需进一步深入研究。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明

朱卫平、贺西淦、刘泽阳、朱洪旭：实验实施，数据采集，论文撰写；张宁、周嘉敏、王龙蓉、王苗：数据整理，统计学分析；赵一鸣，潘奇：文章修改；王鲁：研究设计，文章审阅、指导和经费支持

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81874182、81874056）；上海市卫计委面上项目（201840019）

Fund program: National Natural Science Foundation of China(81874056,81874182); The Public Health Bureau Foundation of Shanghai(201840019)