Abstract
目的
探讨脂质诱导的巨噬细胞M1/M2型极化对肝细胞脂质代谢的影响。
方法
分别以饱和脂肪酸——棕榈酸（PA）、单不饱和脂肪酸——油酸（OA）和多不饱和脂肪酸——二十二碳六烯酸（DHA）孵育巨噬细胞RAW264.7，并制备条件培养液（CM）。胶原酶原位灌注法分离C57BL/6小鼠肝细胞，体外巨噬细胞CM培养原代肝细胞。Real-time PCR检测巨噬细胞M1/M2型极化基因表达，以Real-time PCR和Western blot检测肝细胞脂质合成和分解代谢相关基因的m RNA和蛋白表达，油红O染色检测肝细胞内脂质沉积情况。多组样本数据间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。
结果
与对照组相比，PA诱导巨噬细胞M1型极化[肿瘤坏死因子α、白细胞介素（IL）-6m RNA表达水平显著升高，F≥22.68，P值均＜0.01]，OA诱导巨噬细胞M1/M2型混合极化[IL-6、甘露糖受体c2（Mrc2）和IL-10m RNA表达水平升高，F≥4.94，P值均＜0.05]，而DHA则诱导巨噬细胞M2型极化（Mrc2、IL-10m RNA表达水平增加，F≥4.94，P值均＜0.01）。CM-PA显著增加肝细胞脂质合成基因固醇调节元件结合蛋白1C（SREBP1C）、乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）m RNA表达（F≥5.66，P值均＜0.01）和脂肪酸合酶、ACC1蛋白表达（F≥38.34，P值均＜0.05），并降低脂质分解蛋白脂酰辅酶A氧化酶1（ACOX1）表达（F=154.48，P＜0.01），促进肝细胞内大量脂滴沉积；CM-OA影响肝细胞部分脂质代谢基因表达；而CM-DHA显著增加肝细胞脂质分解基因肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A）m RNA表达（F=10.30，P＜0.01）和ACOX1、CPT1A蛋白表达（P值均＜0.05），并降低脂质合成蛋白SREBP1C、ACC1的表达（F≥65.84，P值均＜0.05），CM-DHA孵育的肝细胞内见少量脂滴沉积。
结论
不同脂肪酸通过诱导巨噬细胞M1/M2型极化改变影响肝细胞和肝脏脂质代谢平衡，从而促进或延缓非酒精性脂肪性肝病的进展。
Keywords: 脂肪肝, 脂肪酸, 巨噬细胞极化, 脂质代谢
Abstract
Objective
This study aims to explore the effect of lipid-induced macrophage M1/M2 polarization on lipid metabolism in hepatocytes.
Methods
RAW264.7 macrophages were incubated with different kinds of fatty acids including saturated fatty acids-palmitic acid (PA), monounsaturated fatty acidsoleic acid (OA) and polyunsaturated fatty acids-docosahexaenoic acid (DHA), and cell culture supernatants were collected to prepare conditioned medium (CM). Hepatocytes were isolated by in situ perfusion of the liver with collagenase in mice, and a macrophage-hepatocyte CM co-culture system was established. Macrophage M1/M2 phenotype markers were detected by Real-time PCR. Lipid synthesis and decomposition related m RNA and protein expressions in hepatocytes were detected by Real-time PCR and Western Blot. Lipid depositions in hepatocytes were detected by oil red O staining. An analysis of variance was used for comparison of means between multiple groups.
Results
Compared with control groups, PA polarized macrophages to a M1 phenotype (expression of TNF-α and IL-6 significantly increased, F≥22.68, P＜0.01), OA polarized macrophages to a M1/M2 mixed phenotype (expression of IL-6, Mrc2 and IL-10 increased F≥4.94, P＜0.05) and DHA polarized macrophages to a M2 phenotype (expression of Mrc2 and IL-10 significantly increased, F≥4.94, P＜0.01). CM-PA significantly increased lipid synthesis related genes, including SREBP1C, ACC1 m RNA expression (F≥5.66, P＜0.01) and FASN, ACC1 protein expression (F≥38.34, P＜0.05) in hepatocytes, and decreased lipid decomposition gene ACOX1 protein expression (F=154.48, P＜0.01). CM-OA affected several lipid metabolism genes expression. CM-DHA significantly increased CPT1A m RNA expression (F=10.30, P＜0.01) and ACOX1, CPT1A protein expression (F≥47.06, P＜0.05), and decreased SREBP1C,ACC1 protein expression (F≥65.84, P＜0.05) in hepatocytes. Massive lipid droplets were deposited in hepatocytes in CM-PA treated hepatocytes, and a few amount of lipid droplets were deposited in CM-DHA treated hepatocytes.
Conclusion
Different fatty acids affect the balance of lipid metabolism in hepatocytes and liver by inducing macrophage M1/M2 polarization, thus promoting or delaying the progression of non-alcoholic fattyliver disease.
Keywords: Fatty liver, Fatty acid, Macrophage polarization, Lipid metabolism
非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）是一种除外乙醇摄入和其他明确的损肝因素所致的肝脏异常脂质沉积为主要特征的临床病理综合征，是与胰岛素抵抗、2型糖尿病、肥胖、代谢综合征和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤[1，2，3]。肝内炎症-免疫调节异常和脂质代谢紊乱在NAFLD的发展中具有重要地位。巨噬细胞是肝脏免疫调控的关键细胞，可调控肝内多种实质和非实质细胞，影响它们的分化、代谢、凋亡等。巨噬细胞在不同的微环境信号作用下分化为不同的表型，发挥不同的功能。近年研究结果显示，肝脏巨噬细胞的M1/M2型极化状态在NAFLD进展中发挥不同的促炎和抗炎作用[4]。然而，这种极化改变导致相关的肝内炎症状态变化对肝细胞脂代谢的直接影响尚不明确。本研究旨在通过建立体外巨噬细胞-肝细胞条件共培养体系研究不同脂质诱导的巨噬细胞M1/M2型极化对肝细胞脂代谢的影响。
材料与方法
1.主要试剂：脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）、棕榈酸（palmitic acid, PA）、油酸（oleic acid, OA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid, DHA）购自美国Sigma公司；白细胞介素（interleukin, IL）-4购自美国Peprotech公司；各兔抗鼠单克隆抗体购自美国Abcam公司和美国Cell Signaling Technology公司。PCR引物购自上海生工生物工程股份有限公司。
2.实验动物和细胞：10只健康雄性8周龄C57BL/6小鼠（无特殊病原级）购自上海交通大学仁济医院实验动物中心；小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞购自中国科学院细胞库。
3.RAW264.7细胞的培养及处理：RAW264.7细胞采用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。传代后调整细胞浓度至1×105个/ml，接种于6孔板，分别以含LPS（100ng/ml）、IL-4（5ng/ml）、PA（0.5mmol/L）、OA（0.5mmol/L）、DHA（50μmol/L）的DMEM培养液培养，并设阴性对照组，各组细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中培养6h和24h，收集培养24h后的细胞上清液，过滤得到相应的条件培养液（conditioned medium, CM）。
4.小鼠原代肝细胞的分离与培养：10只8周龄正常小鼠予4%水合氯醛0.01ml/g麻醉，打开胸腹腔，穿刺插管下腔静脉并固定；剪断门静脉，予D-Hanks液灌注，继以含0.025%Ⅰ型胶原酶和0.05%Ⅳ型胶原酶的DMEM灌注，至肝组织变软后，取下剪碎；37℃水浴消化，100μm无菌筛网过滤，得肝脏初步消化液。随后4℃ 500r/min离心7min，弃上清液，得沉淀细胞团，主要为肝细胞，清洗细胞2次。调节细胞密度至2×106个/ml，接种于铺有Ⅰ型鼠尾胶原的培养皿中，置于37℃、5% CO2的恒温培养箱中静置培养。
5.体外巨噬细胞CM培养原代肝细胞：用不同脂肪酸孵育RAW264.7细胞24h后得到的CM孵育小鼠原代肝细胞，分别置于37℃、5% CO2的培养箱中培养6h和24h，洗去培养液，收集细胞待测。
6.Real-time PCR检测基因表达：收集脂肪酸孵育6h后的巨噬细胞和CM孵育6h后的肝细胞，用Trizol法提取细胞m RNA，逆转录合成c DNA，分别行Real-time PCR检测M1型、M2型巨噬细胞极化基因及肝细胞脂质合成、分解代谢相关基因的m RNA表达，引物序列见表1。RT-PCR的反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，40个循环。以β-肌动蛋白（actin）作为内参照基因，用2-△△CT法计算目的基因m RNA的相对表达量。
表1. Real-time PCR引物序列表.
| 基因 | 引物序列 |
|---|---|
| iNOS2 | F：5'-GTGTTCCACCAGGAGATGTTG-3' |
| R：5'-CTCCTGCCCACTGAGTTCGTC-3' | |
| TNFα | F：5'-TCTTCTCATTCCTGCTTGTGG-3' |
| R：5'-GGTCTGGGCCATAGAACTGA-3' | |
| IL-6 | F：5'-GTTCTCTGGGAAATCGTGGA-3' |
| R：5'-GGAAATTGGGGTAGGAAGGA-3' | |
| Arg1 | F：5'-CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG-3' |
| R：5'-AGGAGCTGTCATTAGGGACATC-3' | |
| Mrc2 | F：5'-TACAGCTCCACGCTATGGATT-3' |
| R：5'-CACTCTCCCAGTTGAGGTACT-3' | |
| IL-10 | F：5'-GTTACTTGGGTTGCCAAG-3' |
| R：5'-TTGATCATCATGTATGCTTC-3' | |
| SREBP1C | F：5'-ACAGCAACCAGAAGCTCAAG-3' |
| R：5'-TGCCCTCCATAGACACATCT-3' | |
| FASN | F：5'-TTGGGTGCTGACTACAACCT-3' |
| R：5'-TGGATGATGTTGATGATGGA-3' | |
| ACC1 | F：5'-GTGCTGGGACTGTGGAATAC-3' |
| R：5'-AGATTGACATCAGCCACCAT-3' | |
| ACOX1 | F：5'-AACAGCCCAACTGTGACTTC-3' |
| R：5'-ACAAAGGCATGTAACCCGTA-3' | |
| CPT1A | F：5'-CTTCCCATTTGACACCTTTG-3' |
| R：5'-ATACGTGAGGCAGAACTTGC-3' | |
| β-actin | F：5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3' |
| R：5'-CTGGGTCATCTTTTCACGGT-3' |
注：iNOS2:诱生型一氧化氮合酶2；TNFα:肿瘤坏死因子α；IL-6：白细胞介素6；Arg1:精氨酸酶1；Mrc2:甘露糖受体c2；IL-10：白细胞介素10；SREBP1C：固醇调节元件结合蛋白1C；FASN：脂肪酸合酶；ACC1：乙酰辅酶A羧化酶1；ACOX1：脂酰辅酶A氧化酶1；CPT1A：肉碱棕榈酰转移酶1A；β-actin：β-肌动蛋白
7.Western blot检测蛋白含量：收集CM孵育24h后的肝细胞，以RIPA（购自中国碧云天公司）抽提细胞总蛋白，取蛋白样品行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿电转印至聚偏氟乙烯膜，5%脱脂牛奶封闭2h；加入兔抗鼠固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element binding protein,SREBP）1C单克隆抗体（1:1000）、兔抗鼠脂肪酸合酶（fatty acid synthase, FASN）单克隆抗体（1:800）、兔抗鼠乙酰辅酶A羧化酶1（acetyl-co A carboxylase 1, ACC1）单克隆抗体（1:500）、兔抗鼠脂酰辅酶A氧化酶1（fatty acyl Co A oxidase 1, ACOX1）单克隆抗体（1:500）、兔抗鼠肉碱棕榈酰转移酶1A（carnitine palmitoyltransferase 1A, CPTIA）单克隆抗体（1:400），4℃孵育过夜；洗膜，加入辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔第二抗体（1:10000），室温孵育1h；洗膜，用电化学发光剂显色，置暗盒X线曝光，常规显影、定影。
8.油红O染色检测肝细胞内脂质沉积：CM孵育肝细胞24h后，去上清液，磷酸盐缓冲液清洗细胞2次，4%多聚甲醛固定细胞15min，油红O避光染色。光学显微镜下观察细胞内脂质沉积情况。
9.统计学方法：样本数据用SPSS22.0进行分析，计量资料以均数±标准差（
±s）表示，组间差异采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
1.不同脂肪酸对巨噬细胞M1/M2型极化的影响：分别以LPS和IL-4作诱导巨噬细胞M1和M2型极化的阳性对照。Real-time PCR结果显示PA显著上调巨噬细胞M1型标志物肿瘤坏死因子α和IL-6（F≥22.68，P值均＜0.01）的m RNA表达；OA上调M1型标志物IL-6（F=22.68，P＜0.01）及M2型标志物甘露糖受体c2（mannose receptor c type 2，Mrc2）、IL-10（F≥4.94，P值均＜0.05）的m RNA表达；而DHA则显著上调M2型标志物Mrc2和IL-10（F≥4.94，P值均＜0.01）的m RNA表达（图1）。
图1. 不同脂肪酸对小鼠巨噬细胞M1/M2型极化标志物m RNA表达的影响.
注：A～C：M1型极化基因；D～F：M2型极化基因；NC：对照组；LPS：脂多糖；PA：棕榈酸；OA：油酸；DHA：二十二碳六烯酸；IL：白细胞介素；i NOS2：诱生型一氧化氮合酶2；TNFα：肿瘤坏死因子α；Arg1：精氨酸酶1；Mrc2：甘露糖受体c2；β-actin：β-肌动蛋白；与对照组比较，a P＜0.01；与对照组比较，b P＜0.05
2.不同脂肪酸诱导的巨噬细胞极化对肝细胞脂质合成和分解基因m RNA表达的影响：Real-time PCR结果显示，CM-PA增加肝细胞脂质合成相关基因SREBP1C、和ACC1的m RNA表达（F≥5.66，P值均＜0.01），而CM-DHA增加脂质分解相关基因CPT1A（F=10.30，P＜0.01）m RNA表达（图2）。
图2. 不同脂肪酸对肝细胞脂质合成和分解相关基因m RNA表达的影响.
注：1：CM-NC；2：CM-LPS；3：CM-IL-4；4：CM-PA；5：CM-OA；6：CM-DHA；CM-NC：对照组巨噬细胞条件培养液；CM-LPS：脂多糖诱导的巨噬细胞条件培养液；CM-IL-4：白细胞介素-4诱导的巨噬细胞条件培养液；CM-PA：棕榈酸诱导的巨噬细胞条件培养液；CM-OA：油酸诱导的巨噬细胞条件培养液；CM-DHA：二十二碳六烯酸诱导的巨噬细胞条件培养液；β-actin：β-肌动蛋白；ACOX1：脂酰辅酶A氧化酶1；CPT1A：肉碱棕榈酰转移酶1A；SREBP1C：固醇调节元件结合蛋白1C；FASN：脂肪酸合酶；ACC1：乙酰辅酶A羧化酶1；与1组比较，a P＜0.05；与1组比较，b P＜0.01
3.不同脂肪酸诱导的巨噬细胞极化对肝细胞脂质合成和分解蛋白表达的影响：Western blot检测结果显示，CM-PA增加脂质合成蛋白FASN（F= 38.34，P＜0.01）和ACC1（F=138.47，P＜0.05）表达，并降低脂质分解蛋白ACOX1（F= 154.48，P＜0.01）表达；CM-OA降低脂质合成蛋白SREBP1c（F=65.84，P＜0.05）、FASN（F= 38.34，P＜0.01）、ACC1（F=138.47，P＜0.01）和脂质分解蛋白ACOX1（F=154.47，P＜0.01）表达；CM-DHA降低脂质合成蛋白SREBP1c（F= 65.84，P＜0.05）和ACC1（F=138.47，P＜0.01）表达，并增加脂质分解蛋白CPT1A（F=47.06，P＜0.05）和ACOX1（F=154.47，P＜0.01）表达（图3）。
图3. 不同脂肪酸诱导的巨噬细胞极化对肝细胞脂质合成和分解蛋白表达的影响.
注：1：CM-NC；2：CM-LPS；3：CM-IL-4；4：CM-PA；5：CM-OA；6：CM-DHA；CM-NC：对照组巨噬细胞条件培养液；CM-LPS：脂多糖诱导的巨噬细胞条件培养液；CM-IL-4：白细胞介素4诱导的巨噬细胞条件培养液；CM-PA：棕榈酸诱导的巨噬细胞条件培养液；CM-OA：油酸诱导的巨噬细胞条件培养液；CM-DHA：二十二碳六烯酸诱导的巨噬细胞条件培养液；GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶；ACOX1：脂酰辅酶A氧化酶1；CPT1A：肉碱棕榈酰转移酶1A；SREBP1C：固醇调节元件结合蛋白1C；FASN：脂肪酸合酶；ACC1：乙酰辅酶A羧化酶1；与1组比较，a P＜0.01；与1组比较，b P＜0.05
4.不同脂肪酸诱导的巨噬细胞极化对肝细胞内脂滴沉积的影响：油红O染色检测显示，CM-LPS和CM-PA孵育后肝细胞内可见大量脂滴沉积，CM-OA孵育后肝细胞见中等量脂滴沉积，而CM-DHA处理组肝细胞见少量脂滴沉积（图4）。
图4. 不同脂肪酸诱导的巨噬细胞极化对肝细胞内脂滴沉积的影响油红O×400.
注：A：CM-NC；B：CM-LPS；C：CM-IL-4；D：CM-PA；E：CM-OA；F：CM-DHA；CM-NC：对照组巨噬细胞条件培养液；CM-LPS：脂多糖诱导的巨噬细胞条件培养液；CM-IL-4：白细胞介素4诱导的巨噬细胞条件培养液；CM-PA：棕榈酸诱导的巨噬细胞条件培养液；CM-OA：油酸诱导的巨噬细胞条件培养液；CM-DHA：二十二碳六烯酸诱导的巨噬细胞条件培养液
讨论
巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，在维持机体稳态和防御功能方面发挥重要作用。巨噬细胞具有高度异质性和可塑性，受不同微环境的影响可极化成不同的类型并发挥不同的功能。M1型巨噬细胞具有促炎作用，而M2型巨噬细胞具有抗炎、促进组织重塑作用[5]。近年研究结果表明，非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中常伴随着肝组织中M1/M2型巨噬细胞比例的增加[6]。也有学者发现M2型巨噬细胞可诱导M1型巨噬细胞凋亡，减轻炎症反应和细胞损伤[4]。这些结果提示肝脏巨噬细胞特有的M1/M2型极化状态在NAFLD的发生、发展中具有重要作用。
研究发现不同脂肪酸在NAFLD发生、发展中具有不同作用，饱和脂肪酸促进肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗，多不饱和脂肪酸则具有相反作用[7，8]。我们以不同种类脂肪酸模拟体内高脂环境处理巨噬细胞，观察其对巨噬细胞M1/M2型极化的影响。结果显示饱和脂肪酸诱导巨噬细胞M1型极化，单不饱和脂肪酸诱导巨噬细胞M1/M2混合型极化，而多不饱和脂肪酸诱导巨噬细胞M2型极化。为进一步明确不同脂肪酸诱导的巨噬细胞M1/M2型极化对肝细胞脂代谢的影响，我们建立了体外巨噬细胞CM培养原代肝细胞体系。结果显示饱和脂肪酸孵育巨噬细胞得到的CM可显著增强脂质合成基因m RNA和蛋白表达，并降低脂质分解基因表达，促进肝细胞内大量脂滴沉积。而多不饱和脂肪酸孵育巨噬细胞得到的CM可显著增加肝细胞脂质分解相关基因m RNA和蛋白表达，并降低脂质合成基因表达，并仅引起肝细胞内少量脂滴沉积。
在NAFLD组织病理学中，脂质以脂肪滴形式沉积于肝细胞胞质是肝脏脂肪变性的特征表型。肝脏脂质来源于饮食中的脂肪、体内脂肪组织分解后进入循环中的游离脂肪酸以及脂肪从头合成产生的脂质[9]。研究结果表明，NAFLD患者血清脂质代谢发生紊乱[10]；而在NAFLD肝脏脂质代谢紊乱中，氧化代谢不足、细胞内脂肪酸过剩导致脂质合成增多是肝细胞脂肪变性的主要原因。肝细胞线粒体能进行β氧化分解游离脂肪酸，这一过程的限速酶主要包括CPT1A和ACOX1。SREBP1C是参与调控脂肪酸、甘油三酯和胆固醇合成的转录因子，可以激活其下游靶基因，增强多种参与脂肪酸从头合成的基因表达，如FASN和ACC1[11]。NAFLD患者肝组织中SREBP1c及其下游靶基因FASN和ACC1表达水平高于正常人群。也有研究结果表明抑制SREBP1c基因表达可抑制甘油三酯的合成，减轻肝脏的脂肪变性[12]。因而脂质分解和合成代谢失调在NAFLD中发挥重要作用。本研究中，通过体外脂肪酸处理巨噬细胞模拟体内高脂环境，结果显示不同极化表型的巨噬细胞可直接影响肝细胞脂质代谢。我们推测饱和脂肪酸诱导的M1型巨噬细胞可能通过促进分泌炎性细胞因子以增强肝细胞脂质合成代谢并抑制其分解代谢，从而增加脂质沉积；而多不饱和脂肪酸诱导的M2型巨噬细胞可能通过促进分泌抗炎细胞因子以增强肝细胞脂质分解而抑制其合成代谢，减少脂质沉积。
总之，不同脂肪酸通过诱导巨噬细胞M1/M2型极化表型改变影响肝细胞和肝脏脂质代谢平衡，从而促进或延缓NAFLD的进展。本研究结果为基于饮食干预调控肝内的炎症-代谢轴防治NAFLD提供了理论依据。
利益冲突
无
作者贡献声明
王祺：数据分析，文章撰写，协助实验操作；许钦瑜：实验操作，数据采集；吴惠敏：协助实验操作；华静：审阅与定稿
Funding Statement
基金项目：国家自然科学基金（81170374、81470842）
Fund program: National Natural Science Foundation of China (81170374, 81470842)
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