Abstract
慢性乙型肝炎患者在抗病毒治疗过程中可出现持续低病毒载量血症的现象，但原因未明，耐药变异可能是其原因之一。共纳入15例有完整的随访资料，血清和肝组织样本（0周和104周）的患者，均使用替比夫定作为初始抗病毒治疗方案，根据病毒学应答继续单独使用替比夫定或加用阿德福韦酯。使用Sanger测序和Illumina二代测序检测核苷类似物相关耐药变异，结果提示8例持续低，病毒载量血症者均未发现核苷酸类似物相关耐药变异的存在。
Keywords: 肝炎，乙型，慢性, 测序, 核苷类似物, 耐药变异
核苷类似物（NAs）是慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗的重要方案之一，部分患者使用核苷类似物抗病毒治疗过程中可出现持续性低病毒载量血症，即血清HBV DNA未能完全阴转，具体原因未明。既往对该类患者NAs相关耐药变异情况的报道较少，本研究我们对单独使用替比夫定（LdT）抗病毒治疗或联合阿德福韦酯（ADV）优化治疗队列的患者进行研究，具体报道如下：
一、资料与方法
1.研究对象：广州市第八人民医院门诊随访使用LdT或LdT联合ADV抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者。入选条件：所有入选患者均符合中华医学会肝病学分会、中华医学会感染病学分会发布的《慢性乙型肝炎防治指南（2015更新版）》。慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗方案使用LdT优化治疗方案1]：0～24周均单独使用LdT抗病毒治疗，根据24周病毒学应答情况调整治疗方案，即HBV DNA＞103拷贝/ml（广州达安基因），则加用ADV联合治疗，如HBV DNA＜103拷贝/ml，则维持LDT单药抗病毒治疗。排除标准：排除合并肝硬化和肝细胞癌的患者、排除合并其他病毒性肝炎、酒精性肝病、脂肪肝、药物性肝炎和自身免疫性肝炎，排除既往曾使用抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者。
2.治疗方案和治疗过程检测的临床指标：本研究共纳入15例HBV HBeAg阳性，有完整的随访资料（0～164周）、每12周保留1次的血清样本、治疗前（0周）和治疗过程中肝组织样本的患者和签署知情同意书。本研究中7例联用ADV进行抗病毒治疗，8例单独使用LdT抗病毒治疗。临床常规检测治疗过程中丙氨酸转氨酶（ALT），总胆红素（TBil），HBeAg状态，HBV DNA，B超等检查，治疗前和治疗过程中104周进行肝穿活组织学检查了解肝脏炎症和纤维化程度，并记录患者治疗过程中依从性的情况。
3.抗病毒治疗过程中持续性低病毒载量的定义：考虑检测HBV DNA国产试剂灵敏度的问题，本研究中患者的血清样本均重新使用罗氏COBAS全自动病毒载量检测系统进行检测。因抗病毒治疗过程中留取的肝组织样本时间为104周，故持续性低病毒载量定义为104～164周外周血HBV DNA≥20IU/ml，病毒阴转组的定义为104～164周外周血HBV DNA＜20IU/ml。
4.抗HBV NAs耐药变异的检测：由于抗病毒治疗过程中血清低病毒载量者使用血清样本进行常规PCR难以检测NAs相关耐药变异，因此，我们选择治疗过程中104周肝组织样本进行NAs相关耐药变异的研究，并对治疗前患者血清样本和肝组织NAs相关耐药变异进行检测。（1）HBV DNA的提取：采用QIAGEN公司的QIAmp DNA Blood Mini试剂盒对治疗前的血清和肝组织样本及治疗过程中104周的肝组织样本进行提取，具体步骤按试剂盒说明书进行。（2）设计包含核苷类似物耐药位点的引物：因二代测序有效长度较短，故对包含耐药位点的序列分片段进行扩增，部分引物参考我们前期研究设计的引物2]。具体引物序列如下：第一轮引物HSM F1：5′-GCCTRTAT TTTCCTGCTGGTGGCTCCAG-3′（nt45～72）,HSM R1：5′-TCCAGACCKGCTGCGAGCAAAAC-3′（nt 1291～1313）。第二轮引物S1基因片段：PS385F5 5′-TAT CGCTGGATGTGTCTGC-3′（nt368～386）,P29 5′-AT ACCCAAAGACAAAAGAAAA-3′（nt807～827）；第二轮S2基因片段：F2 5′-GGCTTTCAGTTATATGGATGA T-3′（nt 726～747）,R2 5′-CATATCCCATGAAGTTAA GGGA-3′（nt 865～886）。各内引物5′加入已知的6个随机碱基，用于二代测序数据分离。（3）PCR扩增包含目的位点的基因片段：使用巢式PCR进行扩增，每次PCR实验均设立阴性对照。第一轮PCR反应条件如下：95℃预变性3min；95℃ 15s,55℃ 15s,72℃ 15s～1min（根据不同基因片段而定），共35个循环；72℃延伸2min。第二轮PCR反应条件如下：95℃预变性3min；95℃ 15s，55℃ 15s,72℃ 30s，共35个循环；72℃延伸2min。PCR扩增产物经琼脂糖电泳验证产物，Sanger测序送广州英潍捷基公司进行测序，测序引物为PS385F5和F2。二代测序使用ImageJ软件对琼脂糖凝胶的各样本的条带进行灰度值的计算，并根据灰度值进行混样。（4）二代测序错误率估计：由于PCR，测序过程中均可引物碱基错误，故需设立标准评估整个体系中的错误率。二代测序错误率估算使用已构建的HBV质粒，和样本使用相同的条件进行PCR和测序，用于评估二代测序的错误率。（5）DNA文库的构建和二代测序：混样的DNA样本送北京诺禾致源（Hiseq）进行测序，建库试剂盒为NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB），对于扩增子460bp的基因产物（HBV S1）使用Hiseq PE250进行测序，扩增子170 bp的基因产物（HBV S2）基因片段使用Hiseq PE150进行测序。（6）二代测序的数据分析：根据既往文献报道确定NAs相关耐药变异位点，具体如下：L180M、A181V/T/S、A194T、M204I/V、V207I、S213T、V214A、N236T[3，4，5，6]。HBV参考序列从NCBI Genbank序列数据库下载，具体为：HBV B2（D00330），C1（KM999990）和C2（FJ386575）。二代测序的原始数据首先使用FastX-toolkits软件进行数据过滤，剔除Q30小于80%的序列，各样本的序列根据内引物的barcode进行分离，使用Flash V1.2.9软件进行序列的拼接。序列拼接后使用Geneious R10.0.5软件进行数据分析，剔除大于或小于目的片段长度的序列。各样本的数据与HBV参考序列进行比对，并确定相关潜在耐药位点变异。HBV基因分型使用2种方法进行确定：①各样本的二代测序数据与各HBV基因型的参考序列进行比对，相似度最高的即为样本的基因型。②并使用Mega7.0 Neighbor-Joining法构建进化树分型再次确定各样本的基因型。
5.统计学方法：本研究计量资料采用中位数（四分位数间距，IQR）均数表示，计数资料采用例数表示，正态分布的计量资料使用Student's t检验，偏态分布的计量资料使用Mann-Whitney U检验，计数资料使用x2检验或Fisher's精确概率检验。使用SPSS13.0软件进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义，均取双侧检验。
二、结果
1.一般资料：本研究共纳入HBV感染者15例，其中男12例，女3例，平均年龄26.3（26.0～27.0）岁，所有患者均有0～164周的完整的随访记录。15例患者中8例为104～164周血清仍可检测到低载量病毒，其中5例患者HBV病毒载量为20IU/ml，1例患者HBV病毒载量波动在20～3.93×102IU/ml，1例患者HBV病毒载量波动在20～8.21×102IU/ml；7例患者血清HBV DNA阴性，见表1。
表1. HBV DNA低载量病毒与HBV DNA阴转组患者的一般资料.
| 临床资料 | HBV DNA持续低载量病毒组（n = 8） | HBV DNA阴转组（n = 7） | P值 |
|---|---|---|---|
| 年龄（IQR） | 26.0（23.5~27.0） | 26.0（23.0~33.0） | 0.953 |
| 性别（男/女） | 7/1 | 5/2 | 0.547 |
| HBV基因型（B/C） | 5/3 | 4/3 | 1.000 |
| 24周加用ADV（是/否） | 5/3 | 3/4 | 0.619 |
| 104周e抗原状态（+/-） | 4/4 | 5/2 | 0.608 |
| 104周ALT复常（是/否） | 7/1 | 7/0 | 1.000 |
2. HBV DNA低病毒载量的患者与HBV DNA阴转者依从性比较：为了排除依从性的问题，我们对患者0～164周的漏服药天数进行统计，结果提示在164周（1148 d）的随访周期中，HBV DNA低病毒载量组平均漏服药天数与HBV DNA阴转组无明显差异，见表2。
表2. HBV DNA低载量病毒与HBV DNA阴转组依从性比较（0~164周）.
| 项目 | HBV DNA低病毒载量组 | HBV DNA阴转组 | P值 |
|---|---|---|---|
| 漏服药天数 | 50（42～57） | 56（46～59） | |
| 漏服药率 | 3.0%～5.2% | 3.2%～5.3% | 0.384 |
3. PCR扩增效率和二代测序错误率估计：本研究纳入的15例0周的血清样本，0周和104周肝组织样本，PCR扩增效率为100%，阴性对照均未见扩增条带。另我们对HBV质粒测序数据进行分析，结果提示NAs相关耐药位点的正确率均为99%以上，另根据既往二代测序的研究，本研究二代测序的Cut-off值定义为1%。
4.患者0周血清样本NAs耐药位点分析：所有入组患者0周的血清样本NAs相关耐药位点均使用Sanger测序和二代测序进行检测，检测结果提示患者0周血清样本均未检测出NAs相关耐药变异的存在。见表3。
表3. HBV DNA低载量病毒与HBV DNA阴转组NAs相关耐药变异比较.
| 组别和检测的样本 | Sanger测序检测 | 二代测序检测 |
|---|---|---|
| HBV DNA低载量组（0周血清） | （-） | （-） |
| HBV DNA阴转组（0周血清） | （-） | （-） |
| HBV DNA低载量组（0周和104周肝组织） | （-） | （-） |
| HBV DNA阴转组（0周和104周肝组织） | （-） | （-） |
5.患者0周和104周肝组织样本NAs耐药位点分析：为了对治疗过程中持续低病毒载量存在的患者进行NAs耐药位点检测，我们使用104周肝组织进行检测（因血清病毒浓度太低，现有的常规实验方法无法检测出血清病毒的耐药变异），并同时对0周肝组织样本NAs相关耐药变异进行检测。研究结果提示无论使用Sanger测序和二代测序，在0周和治疗过程中104周肝组织样本中均未检测出NAs相关耐药变异的存在，见表3。
三、讨论
NAs是HBV抗病毒治疗的一线治疗药物，在临床广泛使用，HBV DNA阴转是评价HBV抗病毒疗效的重要指标之一。在临床实践中，常发现部分患者使用NAs抗病毒治疗但HBV DNA未能完全被抑制，即外周血仍可检测出HBV DNA的存在，具体的原因可能与HBV病毒NAs相关耐药变异、患者服药依从性、患者的疾病和免疫状态、是否合并其他病毒感染等因素有关7]。部分患者使用NAs抗病毒治疗过程中常出现持续性低病毒载量血症的存在，但具体的原因未明，抗病毒治疗过程中持续性低病毒载量血症的存在给临床医生合理选择抗病毒治疗方案带来困扰。
本研究纳入了LdT单药或联合ADV的患者，患者的基线资料无差异，入组患者依从性较好，治疗过程中漏服药物的比例较低。我们对持续性低病毒载量血症组和HBV DNA阴转组0周的血清和肝组织样本，使用Sanger测序（检测基因变异的灵敏度为20%[8，9]）和二代测序（灵敏度为1%10]）进行检测，结果提示0周的血清样本、0周和104周肝组织样本NAs相关耐药位点均无检测出耐药变异。
目前国内上市的NAs药物包括拉米夫定（LAM）、ADV、LdT、恩替卡韦（ETV）、替诺福韦（TDF）等药物，LdT具有相对较高的HBeAg血清转换率[11，12]，但耐药变异的发生高于ETV和TDF等高基因屏障的药物，LdT的耐药变异位点与LAM类似。临床研究的结果表明LdT治疗HBeAg阳性和阴性的患者52周的耐药率分别为3%和2%，而104周耐药率分别为17.8%和7.3%[13，14]。LdT联合ADV优化治疗具有协同的抗病毒作用，能提高抗病毒治疗的疗效和减少耐药的发生[1，15]。本研究的采用治疗方案为根据LdT 24周应答情况决定是否加用ADV的优化治疗方案。由于研究队列中抗病毒治疗过程中患者血清病毒载量低，通过外周血难以检测出HBV基因组中NAs相关耐药变异位点的信息，因此，我们选择治疗过程中104周肝组织样本进行NAs相关耐药变异的检测，并使用常规的Sanger测序和高灵敏度的二代测序进行检测，结果均未发现NAs相关的耐药变异的存在。因此，我们推断，LdT单药或联合ADV的CHB患者抗病毒治疗过程中存在持续性低病毒载量可能与NAs相关耐药变异的出现无明显关系。
既往研究表明免疫因素与抗病毒治疗疗效有密切关系16]，目前关于NAs抗病毒治疗过程中存在的持续性低病毒载量血症原因未明，在排除依从性和NAs相关耐药变异的因素后，其与患者免疫状态的关系有待进一步研究。本研究仅纳入LdT单独或联合ADV抗病毒治疗的患者进行研究，样本例数较少，下一步应扩大样本量并纳入不同抗病毒药物进行相关耐药位点的分析，进一步探讨NAs相关耐药变异与抗病毒过程中持续性低病毒载量血症存在的关系。
作者贡献声明
邓浩辉：负责本文起草、临床数据、实验操作和数据分析等；许敏、楼燕、高洪波：负责临床样本的收集；高洪波：承担本文经费和课题设计
利益冲突
所有作者均声明不存在利益冲突
Funding Statement
基金项目：广州市卫生健康科技项目（20191A011037），广东省科技计划项目（2015B020226004）
Fund program: Medical and Health Technology Program of Guangzhou City (20191A011037), Science and Technology Project of Guangdong Province (2015B020226004)
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