肝窦内皮细胞调节肝内适应性免疫耐受

Abstract

Liver sinusoidal endothelial cells are a major group of nonparenchymal cells in the liver and are involved in immunological surveillance of the liver through the expression of various scavenger receptors and pattern recognition receptors. However, in case of several physiological states, viral infections, and tumor environment, liver sinusoidal endothelial cells maintain immune tolerance in the liver through various mechanisms and cause persistent viral infection and tumor metastasis. This article reviews the mechanisms of immune tolerance of CD4+T cells and CD8+T cells in the liver induced by liver sinusoidal endothelial cells.

肝脏是一个独特的免疫器官，众多肝内细胞参与肝内免疫。肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells, LSEC）约占肝内非实质细胞的50%，对维持肝内免疫微环境的稳定发挥着重要作用。LSEC表达多种清道夫受体（SR），模式识别受体（PRRs）以及与抗原递呈相关的一系列协同刺激分子，以非特异性方式清除病原体参与肝脏的免疫监视^[1]；并通过抗原递呈作用连接适应性免疫应答。但是在这种天然免疫活化状态下，LSEC在生理情况下或某些病毒或肿瘤环境下对特定抗原仍发生特异性无应答。本篇综述将简要介绍LSEC调节肝内适应性免疫耐受的机制进展。

一、LSEC诱导CD4⁺T淋巴细胞耐受

目前关于LSEC递呈抗原给CD4⁺T淋巴细胞（T细胞）导致的最终结局及其具体分子机制仍不清楚，但大概的机制主要有以下三种（图1）。

图1. 肝窦内皮细胞提呈抗原及其和制示意图.

注：MHC：主要组织相容性复合物；TCR：T细胞受体；IL：白细胞介素；CTL：细胞毒性T淋巴细胞；Treg：调节性T淋巴细胞；TGF：转化生长因子；PD：死亡蛋白；LSEC：肝窦内皮细胞；LSEC递呈外源性抗原给CD4⁺T细胞，由于LSEC仅表达较低水平的MHCⅡ类分子而且缺乏向Th1细胞分化所需的IL-12和IL-2，因此其促进Th0向Th1细胞分化的能力很弱，更多的使Th0分化为Th2和Treg，Treg分泌负性细胞因子（TGFβ、IL-10）进一步抑制Th1、Th2及LSEC的活化和功能；另一方面，LSEC交叉递呈外源性抗原给CD8⁺T细胞，导致其短暂活化为CTL，但是LSEC表面的B7H1与CD8⁺T细胞表面的PD1分子结合，形成B7H1-PD1轴，导致CD8⁺T细胞迅速处于静默状态；另外，LSEC表面的LSECtin与CTL上的CD44结合，或通过Fas/FasL途径导致CTL的凋亡，共同导致了CD8⁺T细胞的耐受；然而，在病原体相关分子模式和外源性补充IL-2等条件下又可以诱导LSEC促进CD8⁺T细胞的活化

1.LSEC诱导Th1细胞分化缺陷：LSEC能够激活幼稚的CD4⁺T细胞分化为表达干扰素（interferon,IFN）γ，白细胞介素（interleukin,IL）-4,IL-10的Th0细胞，但是即使补充外源性IL-1β、IL-12，LSEC并没有诱导活化的幼稚CD4⁺T细胞向Th1分化。在高浓度抗原条件下，LSEC虽可以启动幼稚的CD4⁺T细胞，但最终未导致Th细胞的分化，相反导致幼稚CD4⁺T细胞分化为（FOXP3）调节性T淋巴细胞[Treg细胞（BOX3）]^[2]。事实上，LSEC仅表达较低水平的主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex,MHC）Ⅱ类分子以及辅助分子CD80和CD86，作为抗原提呈细胞（APC）将可溶性抗原递呈给CD4⁺T细胞并导致其活化的效率很低，而且缺乏向Th1细胞分化所需的IL-12和IL-2，因此，其促进Th0向Th1细胞分化的能力很弱^[3]。

2.Treg细胞负性调节机制：LSEC通过MHC Ⅱ类分子途径递呈外源性抗原给CD4⁺T细胞，更多的是刺激幼稚CD4⁺T细胞分化为具有调节功能的Treg细胞^[4]。LSEC诱导的Treg细胞不一定表达转录因子Foxp3，Foxp3-CD25^low CD4⁺Treg细胞可以在体外抑制T细胞的增殖，并在自身免疫性肝炎的模型有抑制疾病活动功能^[5]。而典型的Treg细胞是表达CD25和CTLA4的Foxp3⁺ Treg细胞，这类细胞释放免疫抑制性细胞因子IL-10和转化生长因子（translation growth factor, TGF）β^[6]，或通过以接触依赖的方式诱导T细胞的特定抑制性基因程序来参与免疫耐受。Treg细胞分泌的IL-10和TGFβ抑制Th0细胞向Th1、Th2、Th17细胞分化，维持肝内免疫耐受^[7]。另外，Treg细胞还能够干扰肝脏甚至全身其他器官正在进行的免疫应答。Carambia等^[8]研究发现，将基于纳米颗粒的自身抗原提呈给LSEC，能够诱导抗原特异性Treg细胞增殖，并能有效治疗自身免疫疾病。LSEC诱导Treg细胞的效率主要依赖于TGFβ信号^[4]或Notch信号通路，在锚定分子GARP的辅助下，LSEC有效地将TGF β结合到其细胞膜上，促进了抗原特异性Treg细胞的诱导增殖。

3.抑制或清除效应CD4⁺T细胞：Carambia等^[9]的实验研究表明，LSEC可以在体外抑制Th1和Th17细胞分泌细胞因子IFN γ和IL-17等，而该抑制效应主要由IL-10和PD-1介导。IL-10减弱LSEC上甘露糖受体的活性，从而降低抗原摄取的能力，以此下调CD4⁺T细胞活化。LSECs通过Notch信号通路诱导Th1细胞表达IL-10，从而抑制了Th1细胞诱导的迟发型超敏反应^[10，11]。IL-10也降低LSEC上MHC Ⅱ类分子以及辅助分子CD80和CD86的表达，进一步抑制其活化。

4.LSEC诱导的CD4⁺T细胞的耐受可以被打破：细胞因子制瘤素M（OSM）是IL-6家族的一员，OSM可以诱导LSEC表达IL-33，从而促进ST2⁺CD4⁺T细胞的增殖^[12]。Neumann等^[13]的研究证明，在体外刀豆素A诱导的肝炎小鼠模型中，LSEC表达的促炎性趋化因子CXCR9、CXCL10表达增加而维持自我平衡的CXCL12表达明显下降，进而导致表达CXCR4⁺的总CD4⁺T细胞和表达CXCR3⁺效应/记忆CD4⁺T细胞迁移入肝。因此，可考虑给予添加相应的细胞因子或趋化因子来打破LSEC诱导的CD4⁺T细胞的耐受。

二、LSEC诱导CD8⁺T细胞耐受

LSEC能够通过表面黏附分子和抗原肽-MHC分子复合物与T细胞上的相应分子和T细胞受体（TCR）结合，从而俘获T细胞并滞留于肝窦。LSEC以较强的交叉递呈可溶性抗原的能力，诱导了幼稚CD8⁺T细胞的短暂活化，并通过多种机制迅速使其恢复到静默状态，从而实现CD8⁺T细胞耐受。这种静默状态需要一定的条件维持，打破其维持耐受的条件则导致CD8⁺T分化为效应T细胞，发挥相应的效应作用。

1.LSEC交叉递呈可溶性抗原给CD8⁺T细胞：不同于树突状细胞（dendritic cell, DC）主要依靠甘露糖受体摄取抗原，LSEC还可通过其他胞吞受体如清道夫受体等内吞外源性可溶性抗原以MHC I分子途径递呈给特异性CD8⁺T细胞，而且LSEC只需较低剂量的抗原（≤1nmol/L）即可达到高效的抗原递呈^[14]。在非炎症状态下，LSEC交叉递呈可溶性抗原后，导致幼稚的CD8⁺T细胞以抗原特异性的方式黏附到LSEC上，形成MHC I-TCR相互作用轴，而从停留在肝窦内，这是T细胞对循环抗原耐受的第一步。

2.CD8⁺T细胞早期活化及随后抑制的机制：由于低水平MHC Ⅱ类分子以及辅助分子CD80和CD86，LSEC以MHC Ⅱ类分子递呈抗原的效率很低，因而LSEC启动T细胞导致局部记忆性CD4⁺T细胞的活化主要依靠枯否细胞（kupffer cell, KC）或DC辅助，从而进一步辅助CD8⁺T细胞的分化。研究^[15，16]表明，LSEC交叉递呈可溶性抗原初始刺激幼稚CD8⁺T细胞后，可检测到短暂的T细胞的增殖活化标志，并且在18h内可检测到细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）活性，CTL表达颗粒酶（BGZMB）来杀伤靶细胞。且Böttcher等^[15]进一步证实T细胞内IL-6的反式信号引起早期GZMB的表达。

然而，最后LSEC并没有导致幼稚CD8⁺T细胞分化为效应T细胞，原因是复杂多样的。首先，一旦T细胞移行到肝内，它就暴露于耐受性介质，如IL-10、TGF β和前列腺素等中；更重要的是，LSEC诱导CD8⁺T细胞耐受是由于其共抑制信号B7H1的表达强于共刺激分子CD80/CD86的表达^[17]。LSEC表面的B7H1与CD8⁺T细胞表面的PD1分子结合，形成B7H1-PD1轴，导致起始活化的幼稚CD8⁺T细胞迅速处于静默状态。此时CD8⁺T细胞既不能发挥效应功能，也不能分泌细胞因子，对肿瘤细胞也不能发挥出细胞毒性效应功能^[17，18]。为实现这种静默状态，要求LSEC与CD8⁺T细胞之间的相互作用和CD8⁺T细胞上TCR与PD1信号都达到适度平衡的状态^[19]。LSEC上的共抑制因子B7-H1信号还可以调节CD8⁺T细胞分泌IL-2来控制CTL活性，如果B7H1-PD1共抑制信号占主导作用超过36h，即使添加外源性的共刺激分子CD28，也不能逆转CD8⁺T细胞免疫耐受状态^[20]。此外，如图1所示，LSEC还表达死亡配体CD95L（Fas L）、TNF SF10和膜结合型TNF α，其与CD8⁺T细胞上相应受体结合，导致活化的CD8⁺T细胞凋亡^[21]。

3.LSEC诱导的CD8⁺T细胞的耐受可以被打破：LSEC诱导的免疫耐受进程取决于共刺激和抑制信号之间的平衡。通过CD28增强共刺激信号或克服B7-H1介导的抑制信号可干扰LSEC对CD8⁺T细胞的免疫耐受，同样通过增强MHC I分子表达及增强TCR信号强度同样可以打破耐受^[16]。在早期LSEC交叉递呈的耐受信号可被CD8⁺T细胞自身表达的IL-2打破^[17]。外源性加入IL-2可以克服B7-H1介导的抑制信号，促进LSEC诱导的CTL的分化。此外，高浓度的抗原和大量载肽的MHC Ⅰ类分子表达导致T细胞受体（TCR）信号不再被LSEC上的共抑制分子B7-H1控制^[20]。

Liu等^[22]证明，用P3C（TLR1/2配体）刺激后的LSEC，使LSEC从抑制特性中恢复过来，从而来诱导T细胞免疫应答，增强了病毒特异性CD8⁺T细胞应答。另外某些病毒刺激的情况下，也能打破LSEC的耐受状态，如小鼠LSEC感染巨细胞病毒（CMV）是从免疫耐受状态向免疫原型表型转换的开关。另外，给予LSEC各种类型HCV刺激，能体外诱导其产生Ⅰ型或Ⅲ型干扰素，进而促使LSEC释放具有抗病毒活性的外体。

三、LSEC与其他APC作用参与肝内适应性免疫耐受

DC是抗原递呈能力最强的专职APC。Schildberg等^[23]研究发现，LSEC通过与DC物理接触的方式抑制DC的抗原递呈功能，两者接触后使DC上的共刺激分子CD80/86表达下调，DC失去了活化幼稚CD8⁺T细胞的功能。两者的物理接触解除后，抑制效应也解除。

KC也可以通过多种机制诱导肝脏免疫耐受。如高表达Fas L（CD95L），和B7-H1（PD-L1），与活化的T细胞上的相应受体结合，导致T细胞克隆耗竭，此外，KC还分泌负性调节细胞因子IL-10和TGF β，参与肝内免疫耐受。KC也表达PD-1，Mc Donald等^[24]研究发现，在脓毒症时，KC上的PD-1与LSEC上的PD-L1相互作用增强，导致LSEC损伤，其血管内皮细胞功能下降。

四、LSEC通过其他形式参与肝内适应性免疫耐受

1.LSECtin负性调节T细胞应答：LSEC上表达LSECtin，其是C型凝集素家族一员。随着研究的深入，逐步确定LSECtin是CD44的一个配体，因而LSEC可借助LSECtin与表达在活化T细胞上的CD44以蛋白-糖依赖的方式相互作用，从而抑制T细胞活化和增殖或诱导其凋亡。LSECtin还可以下调细胞外信号调节激酶（ERK）和氨基末端激酶（JNK）以及IκB的磷酸化，导致相应的信号通路受阻。Tang等^[25]研究表明，在LSECtin缺乏的条件下，T细胞介导的免疫损伤增加，而且自身免疫性肝病也发生恶化，进一步证明了两者间的相互作用。

2.LSEC分泌因子参与肝内免疫耐受：Kaczmarek等^[20]利用从正常人肝组织分离出LSECs发现，人LSECs可以诱导丝裂原如刀豆蛋白A和凝集素诱导的活化T细胞凋亡，参与免疫耐受。其诱导凋亡机制与LSECs产生TGF β有关，用抗体中和TGF β可以减少T细胞凋亡。此外，也有研究表明LSEC分泌的巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）及骨形态生成蛋白4（BMP4）分别通过促进转移癌细胞迁移和增殖及促进HCV复制参与肿瘤和病毒的免疫逃逸^[26，27]。

五、总结及展望

肝窦内皮细胞是非实质细胞的主要群体，其通过多种机制诱导CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞耐受，并通过LSECtin，分泌的各种因子，或与其他APC相互作用，参与肝内耐受性调节，造成病毒的持续性感染，也可能促进肿瘤的转移。但是在高浓度抗原刺激、细胞因子IL-2、IL-28和模式识别受体刺激或病毒感染状态等情况下，可以打破LSEC诱导T细胞的耐受，导致其增殖和活化。因此，对于LSEC在肝内适应性耐受的机制深入研究，有助于我们了解肝脏局部微环境免疫耐受形成的条件，并根据机体的疾病状态和自身需求，寻找进一步维持耐受的条件，或从突破口打破耐受，促进对病毒感染或肿瘤的特异性免疫清除。

利益冲突

无

作者贡献声明

杜艳芹、孙潺、黄顺梅：综述；杨东亮、吴珺：审校

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（81672022、81461130019、81001313）

Fund program: National Natural Science Foundation of China(81672022、81461130019、81001313)