儿童期感染乙型肝炎病毒（HBV），病情更易慢性化发展为慢性乙型肝炎（CHB），成人期进展为肝硬化、肝癌等终末期肝病的危险度可高达9%～24%[1]。CHB患者肝组织内共价闭合环状DNA（ccc DNA），是乙型肝炎慢性化及停药后复发的重要原因，抑制或清除它是治疗CHB的关键[2]；它可作为监测抗病毒疗效和决定治疗终点的一个重要指标，但目前HBV ccc DNA检测还没有在临床上广泛应用，其主要原因是以往常规方法均不能排除整合的HBV DNA、松弛环状DNA对检测的影响，检测方法的特异度和灵敏度不够高；且常规检测方法所需新鲜的肝组织标本来源也受到一定限制。因此，探讨一种能够反映肝组织HBV ccc DNA水平的新的非侵入性替代标志物具有重要临床价值。
HBV ccc DNA是HBs Ag产生的模板，是HBV感染的重要标志物，有研究者认为血清HBs Ag水平可以反映肝组织内HBV ccc DNA水平，可用于监测患者抗病毒疗效，且可作为一种替代HBV ccc DNA检测的潜在标志物[3,4]。然而也有研究者认为血清HBs Ag水平能否真实反映肝组织内HBV ccc DNA实际水平应依据患者e抗原的状态、HBV的感染状态及抗病毒治疗情况等综合因素考虑[5]。有关肝组织HBV ccc DNA定量与血清HBs Ag定量在评价HBe Ag阳性CHB患儿抗病毒疗效中的应用价值在国内外还鲜见报道。本研究应用本课题组建立的不降解质粒的依赖ATP的DNA聚合酶（PSAD）消化加滚环扩增（RCA）加跨缺口实时荧光定量PCR方法（专利号：ZL201010237281.4）检测肝细胞内HBV ccc DNA的含量，用电化学发光免疫分析法检测HBs Ag含量，以探讨肝组织HBV ccc DNA水平与血清HBs Ag含量的相关性，评估二者对抗病毒治疗48周后HBs Ag发生血清学转换的预测价值，探索血清HBs Ag水平能否真实反映HBV ccc DNA在肝细胞内的复制情况，为制订儿童CHB抗病毒治疗的最佳方案提供参考依据。
一、. 资料与方法
1.研究对象：随机纳入解放军第302医院2014年1月至2016年2月住院诊断为HBe Ag阳性CHB患儿，诊断均符合我国《慢性乙型肝炎防治指南（2015更新版）》[6]中的诊断标准。收集患儿临床数据的同时留取患儿常规病理学检查后剩余的石蜡包埋组织，并收集同一时间的血清样本，-80℃保存。
2.主要试剂：石蜡包埋组织DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；PSAD酶购自美国Epicentre公司；Phi29DNA聚合酶购自美国NEB公司；Taq DNA聚合酶及d NTP Mixture购自日本Ta Ka Ra公司。血清HBs Ag定量检测试剂盒购自德国Roche公司；HBV ccc DNA及β-肌动蛋白引物与探针由上海生工生物工程公司合成。
3.肝组织HBV ccc DNA定量检测：（1）将石蜡包埋肝组织切8片（5μm/片）并放置于高压过的EP管中，严格按照DNA提取试剂盒说明书提取肝组织HBV DNA。（2）取6.8μl HBV DNA提取液，经PSAD酶消化及RCA处理。（3）以RCA产物为模板介导跨缺口实时荧光定量PCR法测定。（4）以β-肌动蛋白基因为内参照，基于每个细胞中含有人类基因组6.667pg进行肝细胞数的计算，具体计算方法参照文献[7]进行。
4.血清HBs Ag定量及HBV标志物的检测：应用罗氏Cobas e 602仪器，采用电化学发光免疫分析法进行测定。
5.分组依据：给予患儿重组人干扰素α-2b，按说明书皮下注射，抗病毒治疗48周后依据HBs Ag血清学转换（HBs Ag＜0.05IU/ml和抗-HBs≥10IU/L）结果，将研究对象分为HBs Ag血清学转换组和HBs Ag血清学未转换组。
6.统计学方法：用SPSS19.0对数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（
±s）表示，多因素分析采用logistic回归方法；采用pearson检验进行相关性分析；用受试者工作特征曲线（ROC）评价血清HBs Ag及肝组织HBV ccc DNA定量对抗病毒疗效的预测价值，用x2检验分析二者对抗病毒疗效的预测价值是否存在差异性，以P＜0.05为差异有统计学意义。
二、. 结果
1.影响抗病毒疗效的多因素分析：共收集患儿63例，其中男性34例，女性29例，年龄1.67～12.00（5.48±2.64）岁。对单因素分析筛选有意义的变量：年龄、血清AST水平、HBs Ag水平、肝组织HBV ccc DNA水平及肝细胞HBs Ag表达强度进一步进行多因素logistic回归分析，结果显示肝组织HBV ccc DNA、血清HBs Ag水平及年龄三个变量对抗病毒疗效的差异有统计学意义（表1）。
表1. 影响HBs Ag发生血清学转换的多因素logistic回归分析.
| 入选因素 | B | S.E | Wald | P值 | OR | 95% CI |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 肝组织HBV cccDNA | -1.757 | 0.795 | 4.885 | 0.047 | 0.173 | 0.036~0.820 |
| 血清HBsAg | -1.528 | 0.783 | 3.811 | 0.051 | 0.217 | 0.047~1.006 |
| 年龄 | -1.145 | 0.460 | 6.199 | 0.013 | 0.318 | 0.129~0.784 |
注：cccDNA：共价闭合环状DNA
2.肝组织HBV ccc DNA与血清HBs Ag水平的相关性分析：HBe Ag阳性的CHB患儿肝组织HBV ccc DNA与血清HBs Ag水平呈正相关性（r=0.464,P＜0.01），见图1。
图1. 肝组织HBV共价闭合环状DNA水平与血清HBs Ag水平的关系.
3.肝组织HBV ccc DNA、血清HBs Ag定量对HBs Ag血清学转换的诊断价值：应用ROC曲线评价肝组织HBV ccc DNA和血清HBs Ag定量对HBe Ag阳性的CHB患儿接受抗病毒治疗48周后获得HBs Ag血清学转换的可能性，肝组织HBV ccc DNA和血清HBs Ag水平的曲线下面积（AUC）分别为0.826（95%CI：0.71～0.95）和0.768（95%CI：0.61～0.92），肝组织HBV ccc DNA水平以0.08log10拷贝/细胞为最佳临界值的灵敏度、特异度、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）分别为92.0%、46.2%、86.8%和60.0%；血清HBs Ag水平以3.681og10IU/ml为临界值的灵敏度、特异度、PPV和NPV分别为86.0%、69.2%、91.25%和56.3%，见图2。
图2. 肝组织HBV ccc DNA、血清HBs Ag诊断HBs Ag血清学转换的受试者工作特征曲线.
注：ccc DNA：共价闭合环状DNA
4.肝组织HBV ccc DNA和血清HBs Ag定量对抗病毒疗效预测价值比较：比较二者对抗病毒治疗48周后HBs Ag发生血清学转换的预测价值是否一样，x2=2.083,P= 0.146，差异无统计学意义，见表2。
表2. 肝组织HBV共价闭合环状DNA和血清HBs Ag定量对抗病毒疗效的预测价值比较（例）.
| 组别 | HBV共价闭合环状DNA定量 | HBsAg定量 | 总计 |
|---|---|---|---|
| HBsAg血清学转换 | 7 | 9 | 16 |
| HBsAg血清学未转换 | 3 | 44 | 47 |
| 总计 | 10 | 53 | 63 |
三、. 讨论
我国90%以上成人CHB患者源自儿童期感染，CHB患儿通过有效的抗病毒治疗，可降低儿童进入成人期后肝硬化及终末期肝病的发生率[8]。因此，探寻能够早期评估及动态监测抗病毒疗效指标，预测患儿抗病毒治疗应答情况，及时调整治疗方案十分重要。
HBs Ag阴转伴或不伴有HBs Ag血清学转换是抗病毒治疗的理想终点[9]；有效地抗病毒是治疗CHB的关键，但仍有部分患儿不能获得病毒学应答或停药后复发，其原因之一是HBV ccc DNA稳定地存在于肝细胞内，其含量虽少，但其不易受药物因素的影响。抗病毒疗效与HBV基因型、宿主免疫状态及患儿接受的抗病毒药物等多种因素密切相关，本研究纳入的63例HBe Ag阳性CHB患儿，经多因素分析表明患儿肝组织HBV ccc DNA、血清HBs Ag水平及年龄与患儿抗病毒治疗应答情况密切相关，较低肝组织HBV ccc DNA及血清HBs Ag水平的患儿抗病毒治疗效果好，年龄越小，抗病毒治疗效果越好。
血清HBs Ag水平与具有转录活性的ccc DNA水平密切相关，反映了HBV ccc DNA在肝细胞的复制情况，可作为替代肝组织HBV ccc DNA检测的潜在指标[10]。本研究结果也显示，基线血清HBs Ag和肝组织HBV ccc DNA水平呈正相关性。因而，血清HBs Ag在一定程度上可作为HBV ccc DNA检测的替代指标，但有关HBs Ag的转录、调控及清除机制目前还没有完全阐明；尤其融合在宿主基因组的HBV DNA转录生成的HBs Ag的调控机制还有待进一步深入研究。
目前，有关肝组织HBV ccc DNA对CHB患者抗病毒疗效预测价值的研究较少。Ruan等[4]研究结果表明，肝组织HBV ccc DNA对CHB患者的抗病毒疗效有潜在的预测价值。HBs Ag清除是CHB患者抗病毒治疗的理想终点，最近Takkenberg等[11]研究结果表明，在HBe Ag阳性的HBV感染者中，基线低水平HBs Ag是预测干扰素抗病毒疗效的有效因子。本研究结果显示，二者对评价HBe Ag阳性CHB患儿抗病毒疗效均有较好的预测价值，进一步说明了血清HBs Ag在一定意义上可作为肝组织HBV ccc DNA检测的替代指标，对于确定CHB患儿抗病毒治疗的最佳治疗方案、治疗终点等具有重要意义。
利益冲突
无
作者贡献声明
史艳敏、陈大为、甘雨、王福川、徐志强：收集病例；史艳敏、储芳、史策、赫兢：采集样本；史艳敏、史策、钟彦伟、张秀昌、张敏：实施研究；史艳敏、钟彦伟、张秀昌、张敏：分析、解释数据；史艳敏、钟彦伟：起草文章，统计学分析；钟彦伟、张秀昌、张敏：酝酿和设计实验，对文章的知识性内容作批评性审阅
Funding Statement
基金项目：北京市科技计划（Z171100001017182）
Fund program: Beijing Municipal Science and Technology Plan (Z171100001017182)
参考文献
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