程序性死亡蛋白1及其配体抑制剂在晚期肝癌治疗中的研究进展

Abstract

The treatment of late stage hepatocellular carcinoma (HCC) presently remains a great challenge. A very few drugs have been recently approved for clinical use except sorafenib and lenvatinib. After decades of failure and experience with molecular targeted and immunosuppressive therapy, immune checkpoint inhibitors are becoming one of the potentially effective therapies for patients with HCC, whose tumor is in the middle and late stages. Moreover,immune checkpoint is one of the main mechanisms of tumor immune evasion;of which programmed cell death protein 1 and its ligand (PD1/PD-L1) are important immune checkpoint targets, and its related pathway has shown to have an antitumor effect in a variety of solid or hematologic tumors and its inhibitors can effectively exert antitumor immunosuppressive effects. This review summarizes the current role of PD1/PD-L1 inhibitors in the treatment of late stage HCC, and explores the forecasting value of combined therapy strategy for HCC.

根据巴塞罗那（BCLC）分期，晚期肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是指定义为BCLC分期为C期的HC C^[1]。研究证实，免疫逃逸是晚期HCC肿瘤进展的重要机制^[2]。免疫微环境异常在免疫逃逸中发挥重要作用^[3]。HCC抑制性免疫微环境的建立是由免疫相关细胞、体液因子、免疫检查点分子（immune checkpoint）等共同作用的结果^[4]。免疫检查点分子包括各种免疫细胞中表达的表面糖蛋白。在生理条件下，这些分子发挥免疫抑制功能，防止T细胞过度活化，避免组织损伤。肿瘤细胞利用免疫系统这一特性，过度表达免疫检查点分子逃脱人体免疫，从而促进肿瘤生长。相反，免疫检查点抑制剂可以有效避免肿瘤细胞的免疫逃逸，重新激活T细胞对肿瘤的免疫反应，达到抑制肿瘤生长的作用。目前，研究最充分的免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞蛋白-4（CTLA-4）和程序性死亡蛋白-1（programmed cell death protein 1, PD-1）。本文重点介绍PD-1及程序性死亡蛋白配体-1（programmed death ligan, PD-L）1等相关免疫抑制剂在中晚期HCC治疗中的研究进展，以及探讨联合治疗策略在未来HCC治疗中的价值。

一、PD-1/PD-L1通路及其作用机制

正常T细胞的活化需要两个信号，第一信号来自T细胞受体和肿瘤相关抗原（TAA）的特异性结合，第二信号来自协同刺激分子，即抗原呈递细胞的CD80/B7-1和CD86/B7-2与未分化T细胞的CD28结合。两个信号的共同刺激使T细胞分化为CD8^＋效应T细胞，运动到特定部位发生免疫应答。为避免免疫应答过度活跃导致炎症反应过度和自身免疫性疾病，T细胞还受免疫检查点分子负性调节，主要有CTLA4-B7通路、PD-1/PD-L1通路以及TIM-3通路等^[5]。

PD-1属于CD28家族成员，是由268个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白。PD-1与PD-L1在激活的T细胞结合后，促使PD-1的ITSM结构域中的酪氨酸发生磷酸化，进而引起下游蛋白激酶Syk和PI3K的去磷酸化，抑制下游Akt、ERK等通路的活化，最终抑制T细胞活化所需基因及细胞因子的转录和翻译，发挥负向调控T细胞活性的作用^[5]。PD-1主要表达于活化的T细胞表面，也在胸腺的双阴性（CD4^-CD8^-）T细胞、活化的自然杀伤细胞、单核细胞以及未成熟的朗格汉斯细胞上低表达。

免疫检查点分子表达上调是HCC免疫逃逸的重要机制，其中以PD-1/PD-L1最受关注。研究发现，HCC患者体内（包括肝脏外周血循环）PD-1在CD8^＋T细胞中表达上升，PD-L1在瘤旁基质细胞（肝窦状内皮细胞，枯否细胞和单核细胞）及癌细胞中均表达增加，并诱导和促进效应性T细胞的凋亡^[6]。上述机制为PD-1/PD-L1免疫抑制剂治疗HCC提供了理论依据。

二、PD-1/PD-L1抑制剂

目前上市的PD-1抑制剂包括Nivolumab、Pembrolizumab、Camrelizumab、BGB-A317、PDR001等产品。PD-L1抑制剂主要有Atezolizumab、Avelumab、Durvalumab等产品。

1. Nivolumab: Nivolumab（商品名Opdivo）于2017年9月被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于晚期HCC的Ⅱ线治疗。该药研发过程中，Checkmate-040试验（NCT01658878）发挥了关键性作用（表1）。这是一项利用Nivolumab单药治疗晚期HCC的临床试验（Ⅰ/Ⅱ期）。值得注意的是，该实验首次在HCC的免疫治疗试验中引入了病毒性肝炎患者（以往我们认为免疫治疗可能导致病毒激活使患者出现肝衰竭）^[7]。在Ⅱ期试验中，3～4级不良反应发生率为23.5%，不良事件主要为丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶浓度升高，无严重临床表现，部分患者表现为肾上腺功能低下，皮疹，腹泻等，上述症状均较轻^[8]。该项早期临床研究给我们带来了振奋人心的初步结果，Nivolumab单药治疗在晚期HCC患者治疗中是安全可控的，部分患者甚至出现早期、持续应答。病毒性肝炎患者同样获益。目前，比较Nivolumab和Sorafenib作为一线治疗效果的CheckMate-459试验（NCT02576509）结果未完全公布。

表1. 肝细胞癌患者接受程序性死亡蛋白-1及其配体抑制剂联合治疗的部分临床试验结果^a.

联合方案	PD-1/PD-L1药物	联合药物	作用靶点	临床试验阶段（期）	临床试验编号
联合小分子靶向药物	Nivolumab	Galunisertib	肿瘤坏死因子-βR，	I~II	NCT02423343
	Nivolumab	Lenvatinib	多靶点	I	NCT03418922
	Nivolumab	Sorafenib	多靶点	I~II	NCT03439891
	Nivolumab	Cabozantinib	c-MET、VEGFR双靶点	I	NCT03299946
	Pembrolizumab	Regorafenib	多靶点	I	NCT03347292
	Pembrolizumab	XL888	热休克蛋白90	I	NCT03095781
	Pembrolizumab	Lenvatinib	多靶点	I	NCT03006926
	SHR-1210	Apatinib	VEGFR	I~II	NCT02942329
	PDR001	Capmatinib	c-MET	I~II	NCT02795429
	PDR001	FGF401	FGFR4	I~II	NCT02325739
	Avelumab	Axitinib	VEGFR	I	NCT03289533
	Durvalumab	Ramucirumab	VEGFR	I	NCT02572687
	Atezolizumab	Bevacizumab	VEGFA	III	NCT03434379
联合免疫治疗	Nivolumab	Ipilimumab	抗CTLA4	I/II	NCT01658878
	Durvalumab	Tremelimumab	抗CTLA4	I/II	NCT02519348
	Nivolumab	Pexavec	GMCSF-armed oncolytic virus	I	NCT03071094
联合局部治疗	Nivolumab	TACE	局部缺血	I	NCT03143270
	Nivolumab	Y90	辐射	I	NCT03033446
	Nivolumab	Y90	辐射	I	NCT02837029
	Nivolumab	Y90	辐射	I	NCT02837029
	Pembrolizumab	Y90	辐射	I	NCT03099564

注：VEGFR：血管内皮生长因子受体；FGFR4：成纤维细胞生长因子4；CTLA-4：细胞毒性T淋巴细胞蛋白-4；^a详细实验内容参见NIH官方网站

与此同时，HCC的术后复发率很高，索拉非尼并不是切除或消融治疗后有效的干预措施^[9]。Bristol-Myers Squibb公司开展了一项双盲试验（NCT03383458），用于比较评估Nivolumab作为HCC患者手术或局部消融后辅助治疗的疗效和安全性。

2. Pembrolizumab: Pembrolizumab是第2种被批准用于多种肿瘤治疗的PD-1抑制剂（商品名Keytruda）。治疗晚期HCC的Ⅱ期临床试验（NCT02702414）部分结果已经发表^[10]。另外两项评估Pembrolizumab治疗晚期HCCⅡ线治疗的Ⅲ期试验已在进行中，其中一项NCT02702401试验已完成患者招募，另一项用于评估亚洲HCC患者的NCT03062358试验仍在招募患者中，两组的对照组均设置为安慰剂组。

3.其他PD-L1抑制剂：用于治疗晚期HCC的Atezolizumab、Durvalumab、Avelumab及BGB-A317目前均已进行临床试验。其中，BGB-A317单药治疗（NCT03412773）、Atezolizumab联合Bevacizumab（NCT03434379）、Durvalumab联合CTLA-4抑制剂Tremelimumab（NCT03298451），均已顺利进入Ⅲ期试验阶段，三项试验均以索拉菲尼治疗作为对照研究。Avelumab试验目前处于临床Ⅱ期阶段，分别评估单药治疗索拉菲尼治疗失败后患者的治疗效果（NCT03389126）以及与Axitinib联合治疗的疗效（NCT03289533）。

三、联合治疗

基于多种肿瘤免疫机制^[11]，免疫联合治疗策略应运而生^[12]。包括多种免疫联合治疗临床试验陆续展开。

1.双免疫检查点抑制剂联合治疗：双免疫检查点抑制剂联合是指CTLA-4免疫检查点抑制剂和PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂的联合。抗PD-1作用于肿瘤浸润耗竭样CD8^＋的T细胞，而抗CTLA-4同时作用于耗竭样CD8^＋和CD4^＋的T细胞。通过对CTLA-4和PD-1的双重抑制在时间和空间上可对肿瘤产生更强的抗肿瘤免疫反应^[13]。目前进入临床研究的CTLA-4抑制剂主要有Tremelimumab和Ipilimumab。其中Nivolumab联合Ipilimumab已经被证明可以显著提高黑色素瘤患者的生存率^[14]。另外，HCC患者联合治疗方案已进入临床试验阶段^[15]。Kelly教授报道的Durvalumab联合Tremelimumab的Ⅰ/Ⅱ期试验数据显示：40例HCC患者中，客观缓解率为25%，而在未感染乙型肝炎病毒的20例患者中，客观缓解率达到了40%，且不良反应可控^[16]。相关Ⅲ期临床试验已在进行中（NCT03298451），对照组为索拉非尼单药和Durvalumab单药治疗。

2.免疫检查点抑制剂联合分子靶向药物治疗：如前所述，分子靶向药物与免疫药物的联合有助于改变免疫抑制环境^[17]，联合疗法对于PD-1/PD-L1耐药的患者来说尤为适用。Kato等^[18]的研究证实，Lenvatinib降低了转化生长因子-β、白细胞介素-10、PD-1的表达和Tim-3（T细胞免疫球蛋白黏蛋白3）的抑制作用，从而通过IL-12等细胞因子等引发了抗癌免疫，增强Pembrolizumab疗效^[19]。在一项涉及非HCC恶性肿瘤患者的Lenvatinib和Pembrolizumab联合用药研究中，肾细胞癌患者的总反应率达到了63%^[20]，且与单独用药时相比，没有新的不良反应发生。表1中归纳整理了目前正在进行临床试验的免疫检查点抑制剂联合不同分子靶向药物的治疗组合。

越来越多的证据表明，血管异常和免疫系统的抑制密切相关。抗血管生成治疗使T淋巴细胞的转运增加、浸润增强，促使免疫抑制性肿瘤微环境转化为免疫增强性肿瘤微环境^[21]。这为抗血管生成药物治疗（抗VEGF和抗促血管生成素-2等）联用（PD-1/PD-L1）抑制剂展现了广阔的前景。其中，评估Bevacizumab（抗VEGFA）联合Atezolizumab用于晚期HCC的一线治疗已进入Ⅲ期临床试验（NCT03434379）（23例患者，客观缓解率为65%），该联合疗法已经获得了FDA突破性疗法认证^[22]。评估Ramucirumab（抗VEGFR2）与Durvalumab联合治疗HCC的早期临床试验也在进行中（NCT02572687）。

3.免疫检查点抑制剂联合HCC局部治疗：放射治疗、介入栓塞（TACE等）和射频消融可以充分暴露肿瘤抗原，激活固有免疫，使免疫检查点抑制剂的抗肿瘤免疫反应增强。Kim等^[23]在HCC小鼠模型中证实，辐射通过干扰素γ/信号传导和转录激活因子3信号传导上调肿瘤细胞中的PD-L1表达，并增加CD8^＋T细胞在HCC的浸润，从而促进抗PD-L1的治疗作用。Wehrenberg-Klee等^[24]报道了一例Y-90放射性栓塞与Nivolumab联合用于治疗血管侵袭性HCC的病例：患者为34岁男性，右叶巨块型低分化HCC（17 cm×10 cm），伴门静脉右支，肝右静脉癌栓。经过联合治疗后患者右肝肿瘤范围明显缩小，癌栓消退，最终成功接受了右肝肿瘤局部切除手术。相关临床试验仍在进行当中（表1）。

HCC患者外科手术或消融治疗后复发率较高，寻找有效的辅助治疗手段是临床难点。目前，Nivolumab已被批准用于黑色素瘤患者术后辅助治疗，用于HCC辅助治疗的研究还在进行当中。

4.其他联合治疗策略：目前正在探索的联合治疗策略还包括：（1）接种癌症疫苗启动机体对肿瘤的适应性免疫^[25]；（2）通过瘤内给予溶瘤病毒或RNA佐剂来增强抗原提呈，增加对T细胞的刺激^[26]；（3）通过CD134的激动性抗体，从肿瘤微环境中除去免疫抑制性细胞，如Th细胞^[27]；（4）通过共刺激分子如CD40或CD137激动抗体激活T淋巴细胞^[28]。为了充分利用免疫疗法，甚至考虑使用三联疗法。抗B7-H1（PD-L1）单克隆抗体可以阻断T细胞中的关键抑制途径，而抗CD137和OX40单克隆抗体提供T细胞共刺激。Morales-Kastresana等^[29]在HCC的转基因小鼠模型测试了这种三联疗法，结果显著延长了小鼠的存活时间。

四、不良反应管理

通过阻断免疫检查点增强肿瘤特异性免疫反应的同时，会非特异性地激活免疫系统，破坏免疫稳态，出现治疗相关的不良反应，即免疫相关不良反应（immune-related adverse events, ir AEs）。ir AEs的特点是广谱性和滞后性。目前的临床试验显示单独阻断PD-1通路3/4级毒性发生率为10%～20%，低于传统肿瘤治疗方式，而由ir AEs引起的治疗相关性死亡事件更是低于2%，且在不同肿瘤类型中差异无统计学意义^[30-31]。但是由于滞后性，长期生存的患者中仍然可能延迟出现严重ir AEs。此外，联合治疗的不良反应可能比单独的免疫治疗更为严重。在Nivolmab-Ipilimumab联合治疗黑色瘤的临床试验中，已有致命性心肌炎的报道^[32]。因此，规律的随访和患者教育十分重要，美国FDA已经制定了相应管理策略，推荐随访至治疗终止后1年^[33]。针对可预测不良反应的生物标志物和高风险基因的研究也在进行当中。

五、展望

PD-1/PD-L1对部分晚期HCC患者治疗有效，但部分患者在治疗中发生了严重的免疫性不良事件^[34]，因此我们精准医疗，探索其他相关的生物标志物格外重要。近年来，有学者提出肿瘤免疫分组学说。Sia等^[35]研究956例患者的肿瘤样本后发现，25%的样本存在显著的免疫活动，PD-1和PD-L1、CD8^＋T细胞标志物、免疫相关基因（T细胞表面抗原、趋化因子）、炎性相关基因（转化生长因子-β等）等均高表达，被定义为肿瘤免疫组。肿瘤免疫组患者癌细胞和肿瘤微环境的交叉反应引发免疫反应通过提供生长因子来支持癌症的发展维持增殖并促进上皮间质过渡、入侵和转移^[36]。同时，大约25%的HCC标本表现为CTNNB1突变，低免疫细胞浸润以及PTK2（与低T细胞浸润相关的致癌途径）的过表达，被定义为非免疫组。这与在黑色素瘤中的研究结果相符，肿瘤细胞CTNNB1通路的过度激活会导致T细胞排斥和对免疫治疗的抵抗^[37]。这似乎预示着免疫治疗对于非免疫组HCC患者并非首选，上述理论尚待临床试验来证明。

作者贡献声明

肖子龙、王芃：负责文章撰写；周华邦：负责审校；胡和平：负责审校定稿

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

基金项目：国家十二五重大专项（2012YQ220113）;国家自然科学基金（81502093、81672371）;上海市科学技术委员会基金（14411960200）

Fund programs: National Science and Technology Major Project (2012YQ220113);Shanghai Science and Technology fund, China (14411960200);National Natural Science Foundation of China (81372672, 81672371)