焦亡在酒精性肝病发病机制中的作用

Abstract

Long-term intake of large amounts of ethanolleads to enterogenous endotoxemia. Reactive oxygen species, high concentrations of adenosine triphosphate and uric acid activate the pyroptosis system, which then cleaves the pore formation mechanism of gasdermin-D, leading to the death of liver cells, accompanied by the release of interleukin-1 β, interleukin-18, and other inflammatory factors. This series of processes activates the immune system, mediates a cascade of inflammation, and promotes the development of alcoholic liver disease from steatosis to inflammation and fibrosis.

酒精性肝病（alcoholic liver disease, ALD）是因长期过量饮酒引起的慢性肝脏疾病，包括轻症ALD、酒精性脂肪性肝病、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化及肝细胞癌等多种类型。研究结果显示内毒素血症、氧化应激、线粒体损伤及硝化应激是酒精性肝病脂肪变性、炎症及纤维化的主要发病机制^[1]。同时肠源性内毒素血症、活性氧（reactive oxygen species, ROS）、线粒体损伤释放的三磷酸腺苷（ATP）及尿酸又可激活焦亡系统，导致白细胞介素（IL）-1β、IL-18等炎症介质的释放诱发级联炎症反应。现就焦亡可能在酒精性肝病发病机制中的作用进行综述。

一、焦亡的概述

细胞焦亡是由细菌、病毒的DNA或RNA等病原体相关分子和高浓度的ATP、尿酸、胆固醇结晶及ROS等损伤信号分子引发的胱天蛋白酶（caspase）-1，caspase-11（小鼠）和caspase-4/5（人类）活化，切割Gasdermin-D（GSDMD）且释放IL-1β、IL-18等炎症介质的一种死亡形式，表现为细胞肿胀、破裂，胞内容物释放伴随强烈的炎症反应^[2]。焦亡作为一种程序性死亡形式，与细胞凋亡的不同之处在于凋亡是由凋亡相关caspase-2/3/6/7/8/9介导的细胞非炎症性死亡。细胞凋亡时细胞核固缩、碎裂，但细胞膜保持良好的完整性，最后形成“凋亡小体”由巨噬细胞吞噬而不引发炎症反应。在酒精性肝病中，焦亡系统激活通路包括以内毒素和ATP、尿酸及ROS等协同作用所导致的caspase-1活化的经典通路和以内毒素所诱导的caspase-4/5/11活化的非经典通路。

二、ALD中焦亡系统的激活

正常人肠道菌群由厌氧菌、需氧菌及兼性厌氧菌等500余种菌群组成。在Tsukamoto-French的ALD模型中，研究人员发现几乎整个胃肠道都可以观察到细菌的过度生长，但是益生菌的比例降低，证实ALD患者菌群失调的存在^[3]。长期大量饮酒致使肠道菌群失调、肠黏膜屏障受损以及肠壁通透性的增加，大量的内毒素进入门静脉系统；加上肝脏枯否细胞（kupffer cells, KCs）对内毒素的清除能力降低，二者共同形成乙醇作用下的内毒素血症^[4]，而内毒素血症是激活焦亡经典与非经典通路的最初信号。

1.乙醇所致的内毒素血症与共同激活焦亡的经典通路：焦亡经典通路的激活是指含caspase-1炎症小体的活化。当机体受内毒素及刺激后炎性半胱天冬氨酸蛋白酶-1前体蛋白二聚体化，自剪切形成催化活性的caspase-1，切割IL-1原蛋白和IL-18原蛋白，释放活性IL-1β和IL-18。Petrasek等^[5]在喂养乙醇和同等热量饮食的C57BL/6小鼠的研究结果显示，乙醇喂养的小鼠肝脏中IL-1β、caspase-1、凋亡相关斑点样蛋白的mRNA表达明显增强；敲除caspase-1可阻止F4/80阳性的KCs及CD3阳性的淋巴细胞的聚集，同时阻止IL-β1、肿瘤坏死因子-α、IL-6等水平增加而减轻肝脏炎症反应；应用IL-1受体阻滞剂后会减轻肝脏的炎症、脂肪变性，由此推断乙醇导致caspase-1的活化，释放IL-β1促进ALD的进展。大量研究结果显示在ALD焦亡经典通路中发挥重要作用的主要是核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NACHT-LRR-PYD-containing proteins 3, NLRP3）炎症小体，又称NALP3炎症小体。NLRP3炎症小体是由NLRP3受体经由凋亡相关斑点样蛋白与半胱天冬氨酸蛋白酶-1前体蛋白结合形成的含caspase-1多蛋白复合物，其活化需要内毒素与ATP、尿酸、ROS等共同参与。细菌细胞壁的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）是内毒素的重要组成成分，其提供NLRP3小体活化的第一信号。LPS通过脂多糖结合蛋白与KCs表面的CD14结合来激活Toll样受体4，依靠核因子-κB信号上调NLRP3炎性小体及pro-IL-1表达来增加肝脏细胞中NLRP3炎性小体及pro-IL-1的浓度，提供NLRP3炎性小体活化的物质基础^[4]。但NLRP3炎性小体的活化尚需要ROS、ATP及尿酸提供第二信号。研究结果显示，ROS通过与硫氧还蛋白相互作用的蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）的相互作用激活NLRP3炎性小体。Zhou等^[1]用乙醇灌胃模拟ALD模型中发现肝组织匀浆中甘油三酯及氧自由基含量随造模时间的延长逐渐增加，肝组织的脂肪变性、炎症及纤维化程度逐渐加重，证实氧化应激参与ALD的致病过程。此外，乙醇暴露通过抑制叉头盒蛋白O1表达而下调mi R-148a表达，最终促进TXNIP过表达^[6]。氧化应激致使ROS大量积聚，其促使硫氧还蛋白-1与TXNIP解离，ROS与TXNIP结合激活NLRP3；同时TXNIP也可与线粒体中的TRX2结合，损伤线粒体释放线粒体DNA，直接激活NLRP3^[7]。乙醇促使肠道转铁蛋白的增加，肠道铁吸收增加而堆积于肝脏，肝脏中的铁负荷超载，诱导氧化反应产生ROS激活NLRP3^[8]。为了探究ALD患者中是否存在高浓度ATP与尿酸，Petrasek等^[9]测定摄入0.8mg/kg乙醇后志愿者血清中的ATP与尿酸水平，与对照组相比，其血清中ATP与尿酸水平明显升高，证实了ALD患者中高浓度ATP与尿酸的存在。在进一步研究中，Petrasek等^[9]利用梯度离心法分离C57BL/6小鼠肝细胞和肝脏单核细胞，发现应用LPS处理的肝脏单核细胞可检测到有限的IL-β1水平；添加乙醇损伤的肝细胞时，IL-β1水平明显增加；加入三磷酸腺苷双磷酸酶或尿酸酶后IL-β1升高的水平降低，证实了ALD患者体内高浓度的ATP和尿酸由损伤的肝细胞释放，并且ATP与尿酸提供IL-β1的成熟的第二信号。研究者们还发现，与野生型小鼠相比，缺乏NLRP3炎症小体小鼠的肝脏和血清中caspase-1的裂解片段p10以及IL-β1水平明显降低^[9]]。以上研究证明ALD患者体内高浓度ATP与尿酸由受损肝细胞释放，并且ATP与尿酸提供NLRP3炎性小体活化的第二信号。大量的ATP与KCs表面的P2X7受体结合，致使K⁺外流来激活NLRP3炎症小体^[10]；可溶性尿酸被KCs内吞后损伤溶酶体致蛋白酶的释放来激活NLRP3炎症小体。在ALD患者，LPS促进NLRP3炎症小体及pro-IL-1表达，提供NLRP3炎性小体的活化第一信号；高浓度的ROS、ATP、尿酸则分别通过ROS模式、钾离子外流模式以及溶酶体损伤模式来提供NLRP3活化的第二信号，二者共同作用激活焦亡的经典通路。

2.内毒素血症导致焦亡非经典通路的激活：焦亡非经典通路的激活是指caspase-4/5（人类）和caspase-11（小鼠）的活化。肠道来源的LPS通过膜外泡内吞入KCs，其直接结合caspase-4/5/11来激活GSDMD，破坏细胞膜的完整性导致肝细胞裂解死亡并释放大量的IL-1β等炎症介质^[11]。致死量的LPS诱导的急性败血症模型中显示，caspase-11缺乏的小鼠相对于caspase-1缺乏的小鼠中IL-1α水平明显降低，炎症反应更轻，提示LPS可直接结合caspase-11释放IL-1α促进炎症发生^[12]。为了进一步探究非经典通路活化过程，Kayagaki等^[13]应用转染大肠杆菌的LPS或者单磷脂酰脂质A处理GSDMD缺乏的骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow-derived macrophage, BMDMs）时，BMDMs未发生焦亡且未检测出活性的IL-1β，证实GSDMD是caspase-11信号通路中的必需蛋白。研究者们还发现缺乏NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白或者caspase-1的BMDMs，当受到LPS的刺激时并不影响GSDMD活化^[13]，提示出GSDMD可能是NLRP3炎性小体活化的上游信号。关于GSDMD如何诱导NLRP3炎性小体的活化问题，Kayagaki等^[13]应用LPS分别刺激IL-1b与caspase-11敲除的BMDMs，缺乏的IL-1b的BMDMs表现出正常的焦亡过程，而caspase-11缺乏未诱导出IL-1β分泌，由此推断caspase-11的成熟会激活NLRP3依赖caspase-1的细胞内信号通路。活化的caspase-11可裂解pannexin-1受体，促进肝细胞释放ATP作用于P2X7受体，导致钾离子外流而激活NLRP3^[14]，诱导炎性因子IL-1β、IL-18等的释放。在乙醇诱导的肠源性内毒素血症基础上，通过多因子通路诱导ALD患者体内炎性caspase的活化，激活焦亡的经典与非经典通路进而促进ALD的脂肪变性、炎症及纤维化进展。

三、焦亡促进ALD的脂肪变性、炎症及纤维化

焦亡系统激活后主要依靠执行蛋白与炎症因子促进ALD的进展。炎性小体识别病原体相关分子与后将活化信号传递至执行蛋白—GSDMD，GSDMD是Gasdermin家族中的一种打孔蛋白，正常情况下其处于自抑状态，经活化后可在细胞膜上形成孔道从而破坏细胞膜的完整性，导致细胞死亡同时伴有大量的炎症因子释放以促进肝脏脂肪变性、炎症及纤维化。

1.GSDMD-N促进细胞裂解死亡：Kayagaki等^[13]发现转染LPS的BMDMs细胞中GSDMD-N片段明显升高并且导致NEK293T细胞的死亡，而GSDMD或GSDMD-C并未出现细胞死亡，提示GSDMD-N是细胞焦亡的直接执行者。为了进一步证实这一结论，Sborgi等^[15]发现受到caspase刺激后，GSDMD裂解成亲脂性GSDMD-N端嵌于细胞膜，亲水性GSDMD-C端溶于细胞质；体外实验时GSDMD-N与人工生物膜紧密结合形成平均直径为21nm的孔道，证实GSDMD-N端通过破坏生物膜的完整性执行细胞焦亡。另有研究者发现Gasdermin家族中的同源序列可占45%，Gasdermin-N域是最保守区域，对GSDMA3与GSDMA的生化分析显示，其脂质结合与膜破坏活性与GSDMD类似，因此又可将焦亡称为“Gasdermin介导的程序性死亡”^[16]。而GSDMB-N端与Gasdermin家族中的其他蛋白作用不同，其可直接与caspase-4结合增强其活性，加速GSDMD-N端的释放^[17]。caspase-11/4-GSDMD信号通路在酒精性肝炎中的作用被Khanova等证实^[18]。GSDMD活化后，解除自抑作用释放出活性N端与质膜结合形成非选择性孔道，降低细胞离子梯度使细胞吸水肿胀，最终发生渗透性溶解导致肝细胞裂解死亡；同时释放出大量的ATP、尿酸等进一步激活NLRP3依赖的caspase-1，释放IL-1β、IL-18等炎症介质加速疾病进展。

2.炎症因子促进肝脏的脂肪变性、炎症及纤维化：在乙醇刺激NLRP3敲除小鼠的实验中，Petrasek等^[9]应用HE染色对肝脏组织学研究，由于IL-1β及肿瘤坏死因子（TNF）-α水平的降低，肝脏脂质沉积明显减少、血清丙氨酸转氨酶水平明显降低，并且与caspase-1缺乏的小鼠肝脏受保护的程度类似；在缺乏蛋氨酸-胆碱饮食诱导非酒精性脂肪性肝炎模型中，给予棕榈酸刺激后，NLRP3缺乏抑制caspase-1的活化，并减少KCs中IL-1和IL-18的活化与分泌^[19]，以上实验证实了NLRP3炎性小体的缺乏可降低IL-1β水平从而减轻肝脏的炎症及脂肪变性。NLRP3小体广泛存在于肝脏细胞，受到与病原体相关分子刺激后，肝脏的免疫细胞释放IL-1β、IL-18、TNF、转化生长因子（TGF）-β1；肝星状细胞释放IL-1β、IL-18、TGF-β1；肝细胞释放IL-1β、IL-18^[20]。大量的研究显示IL-1β是参与酒精性肝病的脂肪变性、炎症及纤维化关键细胞因子。应用10ng/ml IL-1β处理野生型、IL受体敲除的小鼠，对比IL受体敲除的小鼠，野生型组二酰基甘油酰基转移酶2 mRNA水平明显升高，证实IL-1上调组二酰基甘油酰基转移酶2表达促进甘油三酯合成，导致脂质积累；脂化的肝细胞中IL-1受体的负调控因子增加致使肝细胞对IL-1敏感性增加而加速细胞死亡^[21]。在乙醇诱导的肝损伤模型中，肝细胞和KCs细胞中单核细胞趋化蛋白1^[5]显著增加，其促进炎症因子的表达并且下调过氧化物酶体增生激活受体表达来抑制脂肪酸氧化导致脂肪变性。此外，在脓毒症模型中，LPS可通过线粒体解耦蛋白2上调脂肪酸合酶表达促进脂肪酸的合成而加重脂肪变性；并且利用AKT信号通路上调NLRP3的表达，通过p38MAPK信号通路调节NLRP3及IL-1β的转录促使IL-1增多而形成恶性循坏。IL-1通过多因子通路促进肝细胞的脂肪变性，而脂变的肝细胞募集中性粒细胞浸润，进一步促进炎症反应的发生。在高浓度IL-1β背景下，研究者在肝脏单核细胞的上清液中可检测到高浓度的TNF-α，并且IL-1β与TNF-α呈剂量依赖的关系；当添加IL-1β特异性中和抗体后，TNF-α水平较基线无明显变化^[9]。注射D-半乳糖胺和LPS4h后，在敲除IL-1受体小鼠的肝组织中，研究者发现多形核细胞数量明显减少且血清中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、乳酸脱氢酶水平明显降低，肝脏损伤程度更轻微。这一系列的实验证实了IL-1可募集中性粒细胞向肝脏的聚集，促进TNF-α、IL-1α/β、IL-6等炎症因子及CCL2、CXCL1/2趋化因子的释放参与炎症反应，同时IL-1与TNF协同作用而明显放大炎症。此外，IL-1β还可导致局部微环境的改变促进缺氧诱导因子1的活化，增强诱导性一氧化氮合酶表达而加重硝化应激^[1]。长期炎症反应的存在，IL-1可招募免疫细胞如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等到达肝脏，与肝脏的星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）相互作用促进纤维化的进展。炎性小体一方面通过NLRP3小体激活剂直接诱导纤维化，例如尿酸结晶不仅使HSC发生形态转变而且上调TGF-β1表达，诱导胶原蛋白及细胞外基质沉积；另一方面依靠活性IL-1β和TNF-α等炎症因子与HSC表面的受体结合激活HSC。同时IL-1β缺乏可明显抑制胶原蛋白Ⅰ/Ⅳ、TGF-β、金属蛋白酶组织抑制剂1的mRNA水平，改善肝组织的纤维化程度^[21]。

图1. 酒精性肝病过程中焦亡经典与非经典通路的活化过程.

注：canonical pathway：经典通路；noncanonical pathway：非经典通路；alcohol：乙醇；GUT：肠道；dysbacterosis：菌群失调；increased permeability：通透性增加；LPS：脂多糖；TLR4：Toll样受体4；nucleus：细胞核；NF-κB：核因子κB；pro-IL-1：白细胞介素-1原蛋白；IL-1：白细胞介素-1；mitochondria：线粒体；ROS：活性氧；TXNIP：硫氧还蛋白相互作用蛋白；uric acid：尿酸；lysosome：溶酶体；ATP：三磷酸腺苷；P2X7：配体门控离子通道7；NLRP3：核苷酸结合寡聚化结构域样受体3；ASC：凋亡相关斑点样蛋白；pro-Casp-1：半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1前体；Casp-1：半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1；caspase-11：半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-11；damaged hepatocyte：损伤肝细胞；kupffer cell：枯否细胞；steatosis：脂肪变性；inflammation：炎症；fibrosis：纤维化；cell death：细胞死亡

四、展望

目前关于焦亡系统在肝脏疾病（非酒精性脂肪性肝病、肝纤维化、肝衰竭等）发病机制中的研究取得了较大的进展。因此，调控焦亡通路中的各组分水平可能成为未来肝脏疾病的治疗的靶点。理论上抑制焦亡通路药理作用主要包括NLRP3炎性小体抑制剂、NLRP3信号通路抑制剂（caspase-1抑制剂及IL-1受体阻滞剂）和GSDMD抑制剂。焦亡作为一种新型的程序性死亡形式，其参与了多种肝脏疾病的发病机制，但其活化过程尚未完全明确，需要我们进一步研究明确焦亡信号通路来指导临床治疗，为多种肝脏疾病提供药物治疗的新策略。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明

邓玉婷：论文的主要撰写者；魏峰：论文辅助修改者；周俊英：指导研究选题与设计及指导论文的撰写

Funding Statement

基金项目：河北省自然科学基金（H2017206304）；政府资助临床医学优秀人才培养项目基金（2017）

Fund Program: Hebei Province Natural Science Fund (H2017206304); Government-funded clinical medical talent training project fund (2017)