基于角蛋白18的回归模型对乙型肝炎肝衰竭预后的意义

Abstract

Objective

To investigate the association between serum keratin 18 (K18) level and prognosis in patients with HBV-related acute-on-chronic liver failure (ACLF).

Methods

A total of 120 patients who visited Department of Hepatology in Fuzhou Infectious Disease Hospital and were diagnosed with HBV-related ACLF from December 2012 to March 2014 were enrolled and followed up for 3 months. The patients were divided into death group and survival group. The serum levels of K18 fragments (M30 and M65) were measured and related laboratory data were collected to analyze the differences in M30, M65, M30/M65, and other laboratory markers. Binary logistic regression analysis was performed to screen out independent risk factors for death in patients with HBV-related ACLF, and the corresponding logistic regression model (LRM) was established. Another 51 patients with HBV-related ACLF from April to October, 2014 were enrolled; M30 and M65 were measured and related clinical data were collected to calculate LRM value and validate the diagnostic value of LRM.

Results

The 120 patients with HBV-related ACLF were followed up for 3 months, and 40 of them died, resulting in a mortality rate of 33.3%. Compared with the survival group, the death group had significantly higher age, percentage of neutrophils, blood ammonia, international normalized ratio, Model for End-Stage Liver Disease (MELD) score, and M65, as well as significantly lower prothrombin time activity and alpha-fetoprotein level. The death group also had significantly higher incidence rates of underlying diseases and complications such as diabetes, liver cirrhosis, hepatic encephalopathy (HE), pulmonary infection, upper gastrointestinal bleeding, and hepatorenal syndrome than the survival group. Age, HE, upper gastrointestinal bleeding, direct bilirubin (DBil), and M30/M65 were independent risk factors for the prognosis of patients with HBV-related ACLF. The model established was LRM=0.061 × age + 0.69 × HE + 4.11 × upper gastrointestinal bleeding + 3.201 × ln(DBil) - 3.875 × ln(M30/M65) - 24.248. The 51 patients with HBV-related ACLF were followed up for 3 months, and the LRM value and MELD score were calculated. The areas under the ROC curve for the LRM model and MELD score were 0.889 and 0.858, respectively, and there was no significant difference between them (Z=0.417, P>0.05).

Conclusion

M30/M65 ratio has a high value in the diagnosis of HBV-related ACLF, and the LRM model containing M30/M65 ratio can well predict the short-term outcome of patients with HBV-related ACLF.

肝衰竭患者病死率高达60%～80%^[1]，目前有效的治疗方法是肝移植，但因为肝源来源匮乏，临床应有效的评价肝衰竭患者肝功能状态，预测患者生存情况，尽早进行积极治疗和肝移植治疗，提高肝源有效利用率和降低肝衰竭患者死亡率。近年来，国内外学者对肝衰竭的预后评估进行了积极的探索，试图寻找早期、敏感而特异的指标。角蛋白18（keratin 18，K18）是构成肝细胞骨架的主要中间丝蛋白之一，具有调节细胞周期、细胞凋亡的重要作用，肝细胞凋亡时，角蛋白被半胱氨酸天冬酶切割成片段，M30能够识别肝细胞凋亡时被切割的角蛋白片段，M65能够识别细胞坏死时释放出的完整角蛋白18以及角蛋白复合体。通过测量血清中角蛋白片段水平不仅可以了解肝细胞损伤的程度，也可以明确肝细胞死亡的模式，因此角蛋白血清表达水平可作为肝病变发生、发展的指标。Bechmann等^[2]检测了68例急性肝衰竭患者的血清K18/M65水平，并将其纳入终末期肝病（MELD）模型，以K18/M65值取代MELD模型中的总胆红素（TBil）值，建立M-MELD模型，发现较MELD模型能更准确地判断急性肝衰竭患者的预后^[3]。该模型将基础研究数据与临床数据相结合，极大地提高了模型的预测能力，但遗憾的是M-MELD模型只是简单地将K18/M65值取代TBil值，并未重新计算系数，重新构建模型。因此本研究通过检测乙型肝炎慢加急性肝衰竭患者血清的K18/M65、M30水平，同时收集这些患者基线时的临床特征，重新构建新的乙型肝炎慢加急性肝衰竭患者预后评估模型，旨在疾病早期即可对病情做出准确的评估，更好地指导临床治疗。

资料与方法

1．研究对象：选取2012年12月至2014年10月来福州市传染病医院就诊并被确诊为HBV相关慢加急性肝衰竭患者171例，HBV相关慢加急性肝衰竭的诊断标准采用中华医学会感染病学分会制定的《肝衰竭诊疗指南（2012年版）》^[4]，肝衰竭患者均在内科综合及抗病毒治疗的基础上，加或不加人工肝单纯血浆置换术治疗。排除标准：(1)由其他肝炎病毒感染、乙醇、药物、中毒等其他原因或合并该类疾病导致的肝衰竭；(2)伴有弥漫性血管内凝血；(3)伴有循环功能衰竭；(4)心脑梗塞非稳定期；(5)伴有肾脏基础疾病、肾前性或肾后性引起的肾功能不全；(6)妊娠晚期；(7)由于其他疾病而需要长期抗凝治疗的患者；(8)肝癌或其他恶性肿瘤有肝脏转移。

2．方法：收集所有研究对象入组基线时的血清，应用安图斯酶标仪（购自美国宝特仪器有限公司），试剂采用瑞典PEVIVA公司的M30 Apoptosense ELISA试剂盒，M65 EpiDeathELISA试剂盒，检测血清中的M30、M65含量。生物化学指标采用美国Beckman全自动生物化学分析仪检测；凝血功能采用STA-R evolution及配套试剂；HBV DNA采用泰普生物有限公司PCR试剂盒检测。所有患者随访3个月，记录3个月内肝衰竭患者的生存情况。并计算每个入组患者的MELD值，MELD评分公式依据：MELD值=3.8×ln[总胆红素（mg/dl）]+ 11.20×ln[INR（国际标准化比值）]+ 9.6×ln[肌酐（mg/dl）]+ 6.4×（病因：胆汁性或酒精性为0；其他为1）。

3．统计学方法：用SPSS 19.0软件进行统计学处理，正态分布的计量资料用均数±标准差（$\overline{x}$±s）表示，非正态分布的计量资料采用中位数（四分位数间距）表示，即M（QR）描述，计数资料用数量及百分数表示。计量资料组间均值比较采用两独立样本的t检验或单向方差分析，计数资料采用χ²检验，应用ROC曲线分析两种方法的预测价值，参数相关采用Pearson相关分析，模型构建采用多因素二分类logistic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．一般情况：本研究共收录HBV相关慢加急性肝衰竭患者171例（包含51例验证预测模型的病例），171例HBV相关慢加急性肝衰竭患者年龄19～60岁，平均年龄（42.12±10.77）岁,住院时间1～164 d，中位住院时间45 d。HBV相关慢加急性肝衰竭早期11例，中期112例，晚期48例。所有患者入院后治疗均在内科综合治疗基础上加或不加人工肝治疗。

2．120例慢加（亚）急性乙型肝炎肝衰竭患者实验室资料：纳入HBV相关慢加急性肝衰竭患者120例（含上述与健康对照组及慢性乙型肝炎组比较的40例），其中男性∶女性98∶22，平均（42.98±10.63）岁，其中HBV相关慢加急性肝衰竭早期7例、中期79例、晚期34例。经过3个月的随访观察，死亡40例，病死率33.3%，其中HBV慢加急性肝衰竭早期死亡0例，中期死亡13例，晚期死亡27例。120例肝衰竭患者生存组与死亡组分析结果如表1所示，死亡组年龄、血氨、国际标准化比值、MELD评分、M65值高于生存组，PTA、甲胎蛋白水平低于生存组；糖尿病、肝硬化、肝性脑病（HE）、肺部感染、上消化道出血、肝肾综合征等基础病及并发症在死亡组中的发生率高于生存组。

表1. 慢加（亚）急性乙型肝炎肝衰竭患者死亡组与生存组资料比较.

组别	例数	性别（男∶女）	年龄（岁）	白细胞(×10 9/L)	血小板(×10 12/L)	白蛋白(g/L)	总胆红素(mmol/L)	直接胆素(mmol/L)	谷丙转氨酶(U/L)	肌酐(mmol/L)	血氨(mmol/L)	国际标准化比值	凝血酶原活动度(%)	甲胎蛋白（ng/ml）	MELD评分	M30（U/L）	M65（U/L）	M30/M65	糖尿病	肝硬化[例（%）]	上消化道出血[例（%）]	肝性脑病[例（%）]	原发性腹膜炎[例（%）]	肺部感染[例（%）]	真菌感染[例（%）]	肝肾综合征[例（%）]
生存组	80	65 ∶ 15	40.44±9.89	7.44±3.45	118.25±43.09	28.38±4.59	319.19±103.46	319.19±103.46	629.5（920.50）	62.00（18.75）	64.68±26.76	2.28（0.53）	34.81±6.85	88.49（192.63）	23.04（3.54）	1247.11（1567.31）	2095.95（2996.58）	0.55±0.16	5（6.3%）	29（36.3）	1（1.3）	12（15.0）	49（61.3）	40（50.0）	10（12.5）	1（1.3）
死亡组	40	33 ∶ 7	48.05±10.36	8.21±3.06	114.05±44.02	28.23±4.62	346.74±102.05	181.54±58.68	658.00（798.25）	65.00（21.75）	82.63±32.25	2.41（1.86）	29.68±11.87	40.82（164.62）	25.23（8.21）	1314.92（2361.52）	4454.38（7207.66）	0.35±0.11	8（20.0%）	21（52.5）	14（35.0）	28（70.0）	30（75.0）	33（82.5）	6（15.0）	9（22.5）
统计量		χ2 =0.028	t=-3.914	t=-1.202	t=0.500	t=0.168	t=-1.381	t=-1.028	Z=-0.259	Z=-1.103	t=-3.013	Z=-1.751	t=2.535	Z=-2.000	Z=-2.989	Z=-0.676	Z=-3.051	t=8.088	χ2 =5.219	χ2 =2.897	χ2 =27.771	χ2 =42.891	χ2 =2.241	χ2 =14.845	χ2 =0.144	χ2 =15.764
P值		0.868	< 0.001	0.232	0.618	0.867	0.170	0.306	0.796	0.270	0.003	0.028	0.014	0.045	0.003	0.499	0.002	< 0.001	0.022	0.036	< 0.001	< 0.001	0.134	0.001	0.704	< 0.001

3．多因素logistic回归分析及回归模型（LRM）的建立：将患者临床基本资料及实验室检查结果引入logistic模型，采用逐步回归中的偏最大似然估计前进法进行分析，筛选出5个影响预后的独立危险因素（表2），分别是年龄（OR：1.063；95% CI：1.002～1.127；P=0.043）、肝性脑病（OR：1.994；95% CI：1.202～3.307；P<0.001）、上消化道出血（OR：60.949；95% CI：1.409～2636.86；P=0.032）、lnDBil（OR：24.563；95% CI：2.534～238.064；P=0.006）、lnM30/M65（OR:0.021；95% CI：0.002～0.211；P<0.001）。根据表4结果可得LRM=0.061×年龄+0.69×HE+4.11×上消化道出血+ 3.201×ln（DBil）-3.875×ln（M30/M65）-24.248。模型判别效果为86.7%。逐步回归模型检验结果P<0.001，Hosmer-Lemeshow模型拟合指数P=0.192。

表2. 乙型肝炎肝衰竭患者预后评估的多因素Logistic回归分析结果.

变量	B	Wald	Exp（B）	95% CI	P值
年龄	0.061	4.112	1.063	1.002~1.127	0.043
肝性脑病	0.690	7.152	1.994	1.202~3.307	< 0.001
上消化道出血	4.110	4.572	60.949	1.409~2636.86	0.032
Ln（直接胆红素）	3.201	7.631	24.563	2.534~238.064	0.006
Ln（M30/M65）	-3.875	10.706	0.021	0.002~0.211	< 0.001
Constant	-24.248	12.757	0.000	/	< 0.001

注：B：偏回归系数；Wald：统计量；Exp（B）：优势比或比数比；95% CI：95%可信区间；Constant：常数项；P < 0.05为差异有统计学意义

4．LRM模型的诊断及用51例独立样本验证logistic回归模型的预测能力：用新构建的模型分别计算120例患者的LRM值，同时与MELD模型进行ROC曲线分析（图1），其中LRM（AUC 0.912；95% CI：0.856～0.968；P<0.001），MELD评分（AUC 0.668；95%：0.555～0.780；P=0.003）；Z检验（双侧）分析得Z=3.815，P<0.001（表3）,差异具有统计学意义，表明LRM模型对HBV相关慢加急性肝衰竭3个月内的预后判断具有更好的诊断价值。再选取福州市传染病医院2014年4月至2014年10月入组HBV相关慢加急性肝衰竭的患者51例，其中男∶女为46∶5，平均年龄（40.10±10.92）岁，HBV相关慢加急性肝衰竭早期4例（7.8%），中期33例（64.7%），晚期14例（27.5%）。随访3个月，死亡20例，病死率39.2%，其中早期死亡0例，中期死亡9例，晚期死亡11例。分别计算51例肝衰患者的LRM值及MELD评分，并将两者进行ROC曲线分析，其中LRM模型（AUC：0.889；95%CI：0.791～0.986），MELD评分（AUC：0.858；95%CI：0.751～0.965）。两者进行统计学分析，Z=0.417，P>0.5,两者比较，差异无统计学意义。说明LRM模型对HBV慢加急性肝衰竭患者3个月内的预后判断具有良好的诊断价值。

图1. Logistic回归模型、终末期肝病评分模型对乙肝肝衰竭预后评估的受试者工作特征曲线.

表3. Logistic回归模型与终末期肝病评分模型对预后判断的价值比较.

变量	灵敏度	特异度	诊断界点	AUC	P值
Logistic回归模型	0.900	0.800	-1.673	0.912	< 0.001
终末期肝病评分模型	0.600	0.612	23.460	0.668	0.003

注：AUC：受试者工作特征曲线下面积

讨论

目前反应肝细胞损伤的指标主要有TBil、ALT、AST、PTA等，但这些指标对于轻微的肝细胞损伤敏感性不够，尤其是在细胞凋亡水平的评估上。肝细胞死亡与肝脏疾病严重程度密切相关，寻找一个能够反应肝脏死亡程度的指标能够很好的判定肝病的病情程度。在成人肝细胞中只表达K8和K18，由于其角蛋白种类较为单一，因此肝细胞对角蛋白结构的改变较为敏感^[5,6]。凡能引起肝细胞膜完整性改变的任何细胞损伤都可以引起完整K18或其片段释放至外周血。大量研究表明，在HBV、HCV感染的肝脏疾病中，随着疾病的进展K18表达增加^[7,8,9]，本研究亦发现死亡组的M65水平明显高于生存组，M30/M65比值明显低于生存组，说明死亡组的肝细胞坏死更为严重。我们进一步对M30/M65的ROC曲线进行分析，证实M30/M65对肝衰竭患者的预后的诊断价值优于MELD评分，当M30/M65诊断界点取值0.4524时灵敏度为0.95，特异度0.75。但单纯的M30、M65含量测定很难反应出机体整体凋亡及坏死的相对程度。肝衰竭发病机制复杂，任何单一的指标均无法准确的预测其预后，只有结合患者的临床基本资料和实验室指标进行综合分析，才能最大限度地提升对患者的预后的评估能力。Bechmann等^[3]以K18/MD65值取代MELD模型中的TBil值，建立M-MELD模型，极大地提高了模型的预测能力。Rutherford等^[10]通过对更大样本急性肝衰竭的患者进行研究，通过测定基线M30、M65并收集临床基本资料和其他实验室指标，构建了全新的模型—急性肝衰竭研究组（ALFSG）指数。该模型纳入了昏迷等级、总胆红素、INR、磷水平和LgM30五个指标，在预测急性肝衰竭患者死亡可能性及肝移植需求方面的灵敏度和特异度分别为85.6%和64.7%，其ROC曲线下面积为0.822，高于MELD评分（0.704）和KCC评分（0.654）。

本研究筛选出5个影响预后的独立危险因素，分别是年龄、HE、上消化道出血、lnDBIL、lnM30/M65，构建新的回归模型（LRM），模型判别效果为86.7%。该模型5个独立危险因素中肝性脑病为肝衰竭的并发症，其作为独立危险因素已有报道。年龄作为本研究的一个独立危险因素，提示年龄大、免疫功能降低，易并发各种感染，且年龄较大的人基础疾病较多，住院时间相应较长，也增加院内感染风险。上消化道出血一般是由肝硬化所致的食管胃底静脉曲张或者凝血因子的合成减少引起，可以诱发肝性脑病，导致患者死亡。直接胆红素作为独立危险因素鲜有报道，报道较多的是总胆红素水平，本研究纳入直接胆红素作为独立危险因素可能与胆汁淤积，胆红素排出障碍，造成严重的肝细胞毒性，肝细胞的功能障碍也进一步阻碍了胆红素的代谢排出，形成恶性循环。本研究将M30/M65作为独立危险因素纳入logisitic回归模型，M30/M65能够充分反应出细胞的凋亡及坏死水平，其值越低，坏死程度越严重，预后也越差。

利益冲突

无

作者贡献声明

甘巧蓉：提出研究思路，设计研究方案，论文起草；江晓燕：负责病例收集及实验；张鑫：负责实验及数据分析；陈明胜：负责病例收集及数据分析；潘晨：指导研究方案及论文修改

Funding Statement

“十二五”国家科技重大专项(2012ZX10002004);福建省卫生厅青年科研基金(2013-2-80);福州市科技计划项目(2013-S-125-5);福建省卫生系统中青年骨干人才培养项目(2015-ZQN-ZD-30)

Fund program: National Science and Technology Major Project(2012ZX10002004); Fujian Provincial Health Department Youth Research Fund(2013-2-81); Fuzhou Science and Technology Project(2013-S-125-5); Training Project of Young Talents in Health System of Fujian Province(2015-ZQN-ZD-30)