端粒酶逆转录酶组分与肝癌研究

Abstract

Telomeres are DNA tandem repeats at the ends of chromosomes in eukaryotic cells and play important roles in maintaining the stability and integrity of chromosomes. Telomeres are gradually shortened with cell proliferation, and when they are shortened to a certain length, the cells experience senescence and apoptosis. However, a small number of cells can maintain the length of telomeres and restore their function through related mechanisms (activation of telomerase or other mechanisms), and some cells may even be immortalized. Therefore, telomere and telomerase are thought to be closely associated with tumor development and progression. It has been confirmed that telomerase activation is an early event in the development of primary liver cancer, especially the important component of telomerase telomerase reverse transcriptase (TERT), which plays an important role in this process. Here this article reviews the latest research advances in the function and regulation mechanisms of telomerase and the role of TERT in the development, progression, and treatment of primary liver cancer, especially hepatocellular carcinoma, so as to provide a molecular genetic basis for intervention of liver cancer and related targeted therapy.

端粒是真核细胞染色体末端的一段富含G的DNA重复序列，在维持染色体稳定，防止末端融合等方面起重要作用。由于DNA复制时5'末端消失，细胞增殖将导致端粒逐渐缩短，当缩短至一定程度，细胞周期检查点便可激活P53和Rb基因使端粒结构异常的细胞出现衰老和凋亡。若此时P53和Rb发生突变或失活，端粒将继续缩短，染色体出现末端融合，断裂和重组等异常形态，引起大部分细胞死亡。但少数细胞能通过端粒长度维持机制（端粒酶重新激活或其他机制）使端粒恢复功能，细胞出现永生化。因此端粒酶激活被认为是细胞恶变的重要机制。

端粒酶是以自身RNA为模板，以端粒DNA为引物通过逆转录来维持端粒长度的核糖核酸蛋白酶，由3部分组成：逆转录酶组分(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)、RNA组分(human telomere RNA，hTERC)以及端粒酶相关蛋白(telomerase associated protein，TP1)，hTERT是调节端粒酶活性的关键组分和限速因子。大量研究结果显示，在85%～90%的肿瘤中端粒酶活性增强，而肝癌作为全球发病率第5，死亡率第3的恶性肿瘤^[1]，已证实端粒酶激活是其发生的早期事件，肝癌组织中端粒酶活性越高，其术后复发的可能性越大^[2]。现就近年端粒酶的功能和调节及其在肝癌发生发展中的作用的相关进展进行综述。

一、端粒酶的功能及调节

1．端粒延长：目前公认细胞内存在两种端粒长度维持机制：（1）依赖端粒酶的活性，端粒酶以hTERC为模版, hTERT为逆转录酶合成端粒重复序列，延长端粒。生殖细胞、造血干细胞及胚胎干细胞中端粒酶活性较高，同时在大约85%以上的肿瘤中存在端粒酶过度激活的现象。（2）端粒延长替代机制(alternative lengthening of telomeres，ALT)，ALT为依赖于端粒序列特异性同源重组的端粒维持机制，分为端粒内部的重组、以环状ECTR DNA为模板的重组、以线性ECTR为模板的重组以及以T-loop为模板的重组^[3]。曾思聪等^[4]认为在人类胚胎发育早期主要以ALT来维持端粒长度，后期则以激活端粒酶的方式来维持基因组的稳定；另一方面，约15%的肿瘤可在缺乏端粒酶的情况下启动ALT来维持端粒的长度，但这两种机制及相互关系目前尚未彻底研究清楚。

2．独立于端粒的功能：许多研究结果显示端粒酶除了通过延长端粒，防止细胞复制性衰老以外,还具有独立于端粒的其他功能^[5]：（1）激活干细胞：已证实hTERT能促进毛囊干细胞的增殖及迁移，过程中无TERC的参与，端粒也未被延长。（2）抗细胞凋亡：端粒酶可能通过修复DNA损伤，抑制内源性细胞凋亡反应的启动，阻断线粒体功能障碍及caspase激活等凋亡信号通路来实现。（3）抗氧化应激：在氧化应激的情况下，端粒酶从细胞核移位至线粒体，通过提高线粒体的膜电位、增加钙离子储存、减少氧自由基形成从而保护线粒体^[6]。

3．端粒酶功能的调节：hTERT作为端粒酶的核心催化亚基，定位于5P15.33，包含16个外显子和15个内含子，长35 kb。与一般基因不同的是，hTERT转录起始区富含GC，但却缺乏TATA box或类似序列，而位于转录起始点上游181 bp，长约59 bp的区域为核心启动子区(core hTERT promoter)，是调节hTERT转录的关键位点。该区域拥有多个转录因子结合位点，如Sp1、c-Myc、P53、E2F1、Mad1等，这些因子单一或共同作用于hTERT启动子，不同程度地对hTERT进行调节。目前对端粒酶活性调节机制的研究仍处于探索阶段，推测是一个多因子参与的多水平调节过程，将涉及转录及翻译水平，还包括两个主要亚基hTERT和hTERC的运输过程，以及翻译后蛋白磷酸化的调节^[7]。

二、端粒酶TERT与肝癌的发生

1．TERT与肝癌发生相关基因突变研究：（1）P53：在细胞增殖过程中，抑癌基因P53充当"分子警察"，保护着基因组的稳定性。在大约50%的肿瘤细胞中可检测到P53的失活，30%～60%的肝癌患者存在P53突变或下调^[8]，有研究结果显示正常肝细胞的P53表达量较低，炎症期升高，而肝硬化期急剧下降，到肝癌期几乎检测不到^[9]。炎症期P53表达上调可使端粒异常的细胞衰老或凋亡，维持正常肝细胞的功能和数量；而肝硬化及肝癌期P53失活则丧失了其抑癌基因的作用，同时可激活某些原癌基因，导致基因组不稳定性增加，从而促进肝癌的发展。研究结果显示内源性表达的野生型P53可抑制hTERT转录从而阻止端粒酶的激活，但并非由P53与hTERT直接作用导致^[10]，而是通过以下3条途径实现：①hTERT的核心启动子区缺乏P53的结合位点，但含有5个Sp1转录因子结合位点，野生型P53可导致Sp1空间构象改变，使其无法与hTERT结合，不能启动hTERT转录；②hTERT含有非典型延长因子2(enlongation factor 2，E2F)的结合位点，P53将直接抑制E2F家族成员对hTERT的转录促进作用；③P53可通过P21的作用使成视网膜细胞瘤蛋白(retinobiastoma protein，pRb)家族成员的低磷酸化活性形式增加，这些低磷酸化蛋白将降低E2F家族成员与hTERT启动子的结合。有学者提出，P53表达降低不影响hTERT表达；但P53表达增加可抑制hTERT的转录；Yao等^[11]认为P53及其家族成员均参与hTERT的转录调控，在人和老鼠体内分别通过c-Myc及E-box/E2F发挥作用，P63TA通过SP1，P63TAy通过E2F，P73则通过NF-YB2分别调节hTERT的转录。（2）第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（PTEN）：PTEN位于10q23.3，是继P53之后的另一最常突变的抑癌基因，也是目前发现的首个具有磷酸酶活性的抑癌基因^[12]，已在多种肿瘤中发现PTEN的突变和缺失^[13]，近年发现肝癌10 q杂合性缺失频率高达33%，常有肝癌细胞中PTEN表达降低或缺失，以及降解PTEN的miRNA的表达上调等报道，由此可推断PTEN与肝癌发生关系密切。PTEN最重要的底物是磷脂酰肌醇三磷酸[phosphatidylinositol（3，4，5）-trisphosphate，PIP3]，PIP3为磷酯酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）的产物并介导AKT（又称PKB，protein kinase B）的活化。PTEN通过使PIP3脱磷酸来维持PIP3的低水平，从而抑制PI3K/AKT通路，PTEN失活将导致PI3K/AKT活化^[14]，而活化的AKT可催化一系列蛋白质磷酸化来抑制肿瘤细胞凋亡、促进增殖和转移。hTERT包含两个AKT磷酸化位点，提示AKT可使hTERT转录增加，PTEN通过抑制AKT活化，下调hTERT水平来降低端粒酶活性。目前有学者对肿瘤细胞中端粒酶和PTEN的相关性进行了研究，发现转染外源性PTEN后可抑制肿瘤细胞增殖，肿瘤细胞内端粒酶活性显著下降。但目前国内外有关PTEN和端粒酶相关性的研究较少，故要明确两者作用的具体机制仍需大量分子生物学实验及临床研究。（3）c-Myc：c-Myc作为研究最多的原癌基因之一，属于转录调节因子，参与细胞增殖及凋亡调控，其表达与肿瘤的发生发展有关。文献报道肝癌组织的c-Myc阳性检出率为40%～90%^[15]，c-Myc的表达水平与甲胎蛋白正相关，与癌组织分化程度负相关，c-Myc高表达的肝癌易复发，提示c-Myc基因可能参与肝癌的发生并影响其转移及复发^[16]。c-Myc主要通过与DNA特异结合位点CACGTG（E-box）的结合来实现对转录的调节，c-Myc只有与Max形成二聚体后，才能与DNA结合发挥其转录调节作用。研究结果显示肿瘤细胞中c-Myc与hTERT的表达相平行，c-Myc可能通过与hTERT启动子上的E-box结合，上调hTERT的表达而导致肿瘤发生。有学者发现c-Myc转染可激活人乳腺上皮细胞及成纤维细胞中的端粒酶；Wahlstrom等^[17]在非洲爪蟾卵母细胞内也证实，c-Myc/Max复合物通过激活乙酰化酶，诱导组蛋白H3K9和H4K16的乙酰化，改变染色体结构，增加hTERT核心启动子区域的DNA结合力而对hTERT的表达进行调节。但在某些肿瘤中并未发现c-Myc与hTERT的相关性，说明二者的表达可能存在一定的肿瘤特异性，不同肿瘤中c-Myc参与hTERT转录调控的程度可能不同，可能受到sp1、K-ras等其他转录因子的影响。

2．TERT与HBV感染在肝癌中的研究：HBV是肝癌的首要危险因素，全球超过50%的肝癌患者曾感染过HBV。HBV基因组为环状双链DNA，含有4个开放读码框，分别为S、P、C和X。其中X基因编码的HBx蛋白，与病毒感染和肝癌发生密切相关。HBV诱发肝癌主要通过2个主要机制^[18]：（1）病毒基因组片段整合到人类基因组中引起原癌基因激活或抑癌基因受抑制。在大多数HBV相关的肝癌组织中都发现HBV DNA整合。克隆鉴定hTERT启动子时证实HBV基因可整合到hTERT核心启动子上游并顺式激活hTERT转录。在端粒酶阳性的肝癌细胞中发现，hTERT启动子区域66 bp（-372～307 bp）是HBV基因组的整合位点，HBV整合将导致宿主基因组不稳定和重组，激活hTERT转录^[19]。（2）病毒蛋白导致基因或通路的反式激活及反式抑制，诱发肝癌。HBx和preS2作为HBV基因的两种比较重要的反式激活蛋白，在HBV相关肝癌的发生发展中起着重要作用。一般认为，HBx通过蛋白相互作用间接诱导宿主及病毒基因的转录。HBx通过诱导PIP3及转化生长因子β(TGFβ)而使AKT活化，同时HBx可激活c-Myc和c-fos/c-jun，并阻止P53进入细胞核，使细胞癌变。Luan等^[20]认为preS2则通过作用于hTERT启动子的PRR区域(位于hTERT转录起始点上游-349～-329 bp)而激活hTERT，增加端粒酶活性，促进肝癌的发生发展。虽然有研究证实将HBx基因转染肝癌细胞可上调端粒酶活性，但HBx调节端粒酶活性的机制仍存在争议。部分研究认为HBx蛋白可通过c-Myc而上调hTERT的表达，增强端粒酶的活性。但Kew^[21]却认为HBx蛋白会降低端粒酶活性，他们推测HBx蛋白的不同亚型可能对端粒酶的活性产生相反的作用，HBx蛋白可能作为Myc相关锌指蛋白(myc-associated zinc-finger protein，MAZ)的一种共同的转录抑制因子作用于hTERT来抑制端粒酶的活性，同时指出HBx不同亚型相互作用在肝癌的早期阶段下调端粒酶的活性，但随着肝癌的发展不断上调端粒酶的活性。Liu等^[22]却认为HBx通过Sp1激活hTERT启动子区的转录活性，并非通过c-Myc。

3．TERT与HCV感染与肝癌发生：在我国，HCV是仅次于HBV引起慢性肝炎的因素，20%～30%的丙型肝炎患者在感染HCV 20～30年后会发展为肝硬化及肝癌。目前已证实肝癌细胞中的HCV核心蛋白与端粒酶活性增高有关，可能导致肝癌的发生。早期研究结果显示，HCV核心蛋白可直接上调c-Myc的表达从而激活端粒酶，近年的学者则提出^[23]，HCV核心蛋白编码序列在翻译时发生核糖体读码框移位而产生的一种新型C蛋白，可激活c-Myc的表达。此外有学者提出，HCV感染者可能由于hTERT基因启动子的遗传变异或CpG岛的甲基化而激活端粒酶，导致肝癌的发生。Zhu等^[24]发现在Huh7细胞中，HCV核心蛋白可上调hTERT的表达，增强端粒酶的核内定位，激活端粒酶。但有研究指出在HepG2细胞中，HCV核心蛋白并未激活端粒酶，存在差异的原因可能是因为Huh7和HepG2两种细胞对HCV病毒的复制及蛋白表达的敏感性不同。Biron-Shental等^[25]发现，与健康人群相比，HCV感染活动期的患者的hTERT显著降低，恢复期的患者的hTERT轻微降低，同时两组患者的端粒也较短，但这项研究的样本量较小，其结果有待证实。

4．TERT与上皮-间质转化及其在肝癌发生中的作用：上皮-间质转化(epithelial–mesenchymal transition，EMT)是由紧密连接的上皮细胞转化为连接疏松、具有迁移活动的间质细胞的过程。EMT使黏附分子表达下降，间质细胞标志物表达上调，产生基质金属蛋白酶使肿瘤细胞运动能力增强，突破基底膜，进入淋巴管或血管到达远处脏器，再通过间质上皮转化(mesenchymal-epithelial transition，MET)使肿瘤定植。目前研究结果表明正常肝组织发展到肝癌，肝癌细胞脱落并获得迁移和侵袭能力时均发生了EMT^[26]。在肝癌细胞内发现的EMT相关基因和蛋白高表达，可能与肝癌细胞侵袭力增强有关。同时Kim等^[27]发现，与上皮特异性黏附分子(EpCAM)表达阴性的肝癌细胞相比，EpCAM阳性的肝癌细胞端粒较长，端粒酶活性也较高。Ko和Jung^[28]证实端粒长度与肝癌细胞的侵袭力正相关。Liu等^[29]发现胃癌细胞内hTERT的水平和EMT相关标志物的表达呈正相关，同时小鼠体内试验也证实hTERT的表达能促进肿瘤细胞的定植。Qiao等^[30]认为EMT和MET可使端粒酶阳性的口腔上皮细胞获得干细胞特性，Yu等^[31]证实端粒酶阳性的骨肉瘤细胞高表达EMT的启动基因和间质细胞的标志物。以上研究均证明，hTERT表达增高可诱导EMT，导致肿瘤的转移和复发。

5．TERT与氧化应激在肝癌发生中的研究：氧化应激在肝硬化发展到肝癌的过程中起重要作用，在大约80%的肝癌组织中发现高水平的氧化应激，尽管有证据证实氧化应激可导致端粒结构异常，上调hTERT转录，激活端粒酶而诱发肝癌，但具体机制尚不清楚。在外源性应激状态下，hTERT由细胞核转位至线粒体，线粒体TERT能够与线粒体RNA内切核糖核酸酶的RNA组份结合，转化为一种类似于RNA依赖的RNA多聚酶的复合物而发挥基因沉默作用^[32]；同时，线粒体TERT能够以线粒体tRNA为模板继续发挥逆转录酶作用^[33]；更重要的是线粒体hTERT能够增强线粒体的膜电位，降低活性氧水平，减轻线粒体DNA损伤，抑制氧化应激所诱导的凋亡^[34]。Cardin等^[35]也证实线粒体TERT和mtDNA相互作用可改善电子传递链的活性，保护细胞免受活性氧诱导的氧化损伤，降低线粒体膜的渗透性，避免促凋亡因子的泄漏，促进致瘤性转化。Nishikawa等^[36]认为在肝癌组织中，随着氧化应激程度的不断增高，PTEN表达降低，AKT被激活，hTERT转录增强，促进肝癌的恶化，早期文献中则有推测氧化应激可能通过介导不同位置G的氧化来间接调节端粒酶的活性。同时，肥胖和吸烟等肝癌危险因素也可诱发体内高氧化应激状态，加速肝癌的发展^[37]。

三、靶向端粒酶的肝癌治疗

通过抑制端粒酶活性使肿瘤细胞发生复制性衰老并死亡，可达到治疗肿瘤的目的。而且在肿瘤细胞和正常细胞之间，端粒长度，端粒酶活性和细胞动力学存在明显差异，提示靶向端粒酶的抗肿瘤疗法可能比较安全。近年来，以端粒酶为靶点的抗肿瘤研究非常活跃，主要途径包括以下几种。

1．端粒酶直接抑制剂：端粒酶全酶复合物都可作为抑制剂靶点，包括阻断hTERC的模板作用、抑制hTERT转录活性及以TP1为作用靶点。可通过反义寡核苷酸、siRNA和特异性锤头状核酶等技术直接抑制端粒酶活性，也可针对端粒酶全酶组装的关键步骤如引物锚定位点和端粒酶被招募至端粒的过程进行抑制。虽然大多数研究结果显示端粒酶抑制剂，如齐多夫定^[38]、硼替佐米、雷帕霉素^[39]等在抑制肿瘤细胞生长方面效果显著，但可能由于设计的靶mRNA序列、样本量、细胞株以及检测方法的不同，也有学者提出了相反的结果^[11]。在众多以端粒酶为靶点的抗肿瘤药物中，德克萨斯大学和生物技术公司Geron合作开发的长度为13-mer的寡核苷酸GRN163L (Imetelstat)最具发展前景，GRN163L能与hTERC互补结合从而抑制端粒酶的活性，目前已进入临床研究阶段^[40]。

2．端粒酶主动免疫治疗：由于端粒酶在肿瘤细胞特异表达，端粒酶降解产生的多肽和蛋白质碎片可作为抗原表达于肿瘤细胞表面，从而诱发杀伤性T淋巴细胞的特异性杀伤作用，直接快速地消灭肿瘤细胞^[41]。目前已有多种端粒酶肽段，如hTERT I540，hTERT R865等被应用于实验室及临床研究，但端粒酶在肿瘤细胞中的表达量差异及端粒酶抗原的免疫耐受仍是此种疗法亟待解决的问题^[42]。

3．其他：（1）hTERT启动子+自杀基因转染肿瘤细胞：hTERT启动子可调控外源自杀基因仅在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达，而不影响正常细胞的功能。（2）其他可影响hTERT表达的抑制剂：有文献报道三氧化二砷、丹参酮ⅡA、汉黄芩素以及紫杉醇、β榄香烯、苦参碱等中药可抑制端粒酶活性，实现抗肿瘤的目的^[43]。此外可通过作用于某些可影响hTERT表达的基因，如上调P53，PTEN或下调c-Myc的表达来抑制端粒酶活性。虽然端粒酶抑制剂的研究取得了令人满意的结果，但单一的端粒酶靶向药物也存在一些缺陷^[44]：（1）肿瘤细胞可能激活端粒延长替代机制而使端粒酶抑制剂失效；（2）单一的端粒酶抑制剂需要足够的时间才能抑制肿瘤细胞的生长；（3）端粒酶抑制剂可能影响端粒酶阳性的正常细胞的功能；（4）治疗过程中肿瘤细胞可能发生遗传变异而对端粒酶抑制剂产生耐药。因此，联合不同类型的端粒酶抑制剂，或者端粒酶抑制疗法与原有抗肿瘤疗法同时使用疗效会更加显著^[45]。

四、展望

尽管端粒酶在肿瘤研究领域备受重视，但针对肝癌的研究多停留于表面现象的检测，端粒酶在肝癌发生过程中的作用及其活性调节机制，包括端粒酶如何影响肝癌耐药性等问题尚未彻底研究清楚。因此，仍需大量的基础与临床试验来明确二者的关系，最终找到防治肝癌的有效方法。

利益冲突

无

作者贡献声明

蔡嘉镜：综述；郭晓兰：审校