血色病肝脏铁沉积的病理特点分析

Abstract

Objective

To identify the type of iron deposition and describe its amount, distribution and associated lesions, in order to support an etiologic diagnosis for hemochromatosis.

Methods

Hematoxylineosin (HE) stain, reticular fiber stain, Masson's stain and Perl's iron stain were used to assess liver biopsies from 31 patients with hemochromatosis. The Ishak scoring system and Deugnier scoring system were used to assess the histological change in liver and to semi-quantify the excess of hepatic iron. Genetic testing results were received from a portion of the patients and used in analysis.

Results

One patient had hereditary (HFE) hemochromatosis complicated with Gilbert's syndrome, for which the pattern of iron deposition was similar to that of the four patients with Gilbert's syndrome. Iron accumulation appeared as fine granules predominating at the biliary pole of cells and was distributed throughout the lobule with a decreasing gradient spanning from the periportal to centrolobular areas. Mild chronic inflammation was found to be commonly associated with low stage fibrosis. One patient had HFE hemochromatosis complicated with hepatitis B virus infection, and the pattern of iron deposition resembled that in the eight patients with viral hepatitis, wherein the deposition was mainly in the sinusoidal cells and/or portal macrophages. Histological grading and fibrosis staging differed among patients. The five patients with blood disordered showed iron accumulation mainly in the periportal hepatocytes, but mesenchymal iron deposits were also present. The grade of inflammation, as well as of fibrosis, was mild. The five patients with alcoholic disease and the five patients with drug-induced hepatitis showed hepatic iron deposition in swollen or ballooned hepatocytes. The two patients with excessive iron supply showed iron deposition localized within the parenchymal and mesenchymal cells.

Conclusion

Etiologic diagnosis of hemochromatosis relies on both the type of iron deposition and the nature of associated lesions. Liver biopsy is necessary for both diagnosis and prognosis.

血色病（hemochromatosis, HC）指肝脏、胰腺、心脏和其他器官大量铁沉积，导致器官功能损害和结构破坏的疾病，按病因分为原发性和继发性两大类^[1]。原发性血色病（hereditary HC，HHC，又称遗传性或特发性血色病）是常染色体隐性遗传性铁贮积病，由先天性铁代谢障碍所致，在白种人中常见^[1]。其诊断主要通过基因筛查，检测基因突变来确诊。继发性血色病常见于铁利用障碍所致贫血、溶血性贫血、多次大量输血后以及摄入过量铁等情况。过量铁以含铁血黄素颗粒形式在肝、胰腺、心、肾、皮肤及脾等部位广泛沉积，造成靶器官实质细胞破坏，广泛纤维化，导致脏器功能损害。肝是最早和最严重的铁沉积部位。目前对原发性及继发性血色病时肝脏病理改变尚未有系统认识，在实际病理诊断中存在争议。现对2009-2014年我院及外院会诊的31例血色病病例进行回顾性分析，所有肝活体组织标本均进行Ishak及铁沉积评分，并对部分病例进行基因检测，以探讨不同原因造成的血色病铁沉积程度、分布特点及其与组织学改变的关系。

资料与方法

1．研究对象：2009-2014年北京地坛医院收治及会诊的血色病病例31例，均具有完整临床及组织学资料。

2．研究方法：肝脏活体组织标本均行HE、网状纤维、胶原纤维及普鲁士蓝染色，试剂购自国药集团化学试剂有限公司。肝组织炎症活动度及纤维化程度采用Ishak评分系统^[2]进行评价，炎症活动度从汇管区周围界面炎、小叶内融合性坏死、小叶内点灶状坏死炎症、汇管区炎症四个方面进行评价，最大可能分值为18分；纤维化程度从无纤维化到肝硬化分别记为0～6分。肝组织铁沉积程度及分布采用Deugnier评分系统^[3]进行评价，对肝腺泡三个区的肝细胞、肝窦内铁沉积分别进行评分，肝细胞及肝窦内铁沉积程度分为四级，肝细胞最高为12分，三个区相加最高为36分，肝窦最高为4分，三个区相加最高为12分；汇管区铁沉积从结缔组织、胆管细胞、血管壁三个方面评分，分为四级，最高分为12分，所以整个肝脏铁沉积评分为0～60分。同时留取患者外周血用吸光度定值法作HBV、HCV标志物检测，并详细询问相关病史，尤其是饮酒史及药物应用史。

3．基因突变检测：所有临床怀疑遗传性疾病患者取外周血10ml，提取外周血全基因组DNA，并进行PCR扩增，PCR产物进行DNA测序。将Gen Bank中Ⅰ型遗传性血色病基因（hemochromatosis gene，HFE）第2、3、4、5外显子序列，ⅡA型遗传性血色病基因（HJV, hemojuvelin）第3、4外显子序列，ⅡB型遗传性血色病基因（HAMP, hepcidin antimicrobial peptide）第1、2、3外显子序列，Ⅲ型遗传性血色病基因（TFR2,transferring receptor 2）第2、4、6、7、9、10、11、14、16、17、18外显子序列，Ⅳ型遗传性血色病基因（SLC40A1）第3、5、6、7外显子序列分别与所测序列结果对比分析，查找有无突变碱基。如有碱基突变，进一步通讨密码子表查实该核酸突变是否会导致蛋白质氨基酸编码改变。Gilbert综合征患者DNA测序结果与基因文库中UGT1A1基因序列进行对照，查找有无突变位点。各外显子引物由北京华大基因提供。

4．统计学分析：统计处理均用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，用t检验比较两组数据之间的差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1．临床资料：31例血色病患者中，男性26例，女性5例，年龄12～64岁。如表1，31例血色病患者中包括原发性血色病2例（血色病基因检测异常），其中1例合并Gilbert综合征，1例伴有乙型肝炎病毒感染病史；继发性血色病29例，其中Gilbert综合征4例，血液系统疾病5例，有乙型肝炎病史6例，有丙型肝炎病史2例，脂肪性肝病5例，有药物应用史5例，食物中铁摄入过多2例。

表1. 31例血色病肝组织Deugnier及Ishak评分结果.

诊断	肝细胞内铁沉积	肝窦细胞及汇管区铁沉积	炎症活动度	纤维化程度
原发性血色病
合并Gilbert综合征（n=1）	12.00	1.00	2.00	0
合并乙肝病史（n=1）	15.00	12.00	5.00	1.00
继发性血色病
Gilbert综合征（n=4）	10.5±3.0	0.8±0.8	2.00±0.82	1.00±0.00
血液系统疾病（n=5）	13.8±6.6	5.8±2.6	2.40±0.89	1.00±0.00
病毒性肝炎（n=8）	14.6±6.1	13.5±5.8	6.63±4.34	2.75±1.58
脂肪性肝炎（n=5）	9.60±3.29	2.60±2.60	7.00±3.54	2.80±1.48
药物性肝炎（n=5）	2.40±3.28	5.00±3.00	10.80±3.03	2.20±0.84
含铁剂摄入（n=2）	19.50±2.12	14.50±2.12	11.00±5.66	3.50±2.12

2．基因突变检测结果：2例原发性血色病患者均为Ⅰ型遗传性血色病基因HFE突变（图1），其中1例合并UGT1A1基因突变（图2），此突变可导致Gilbert综合征；此外，有2例患者只存在UGT1A1基因突变。

图1. Ⅰ型遗传性血色病HFE基因第2外显子C/G杂合突变，CAT-GAT.

图2. UGT1A1基因第1外显子G/A杂合突变，GGA-AGA.

3．肝脏组织学及铁沉积情况：2例原发性血色病患者肝脏炎症活动及纤维化程度均较轻，Ishak评分炎症活动度分别为2分和5分，纤维化程度分别为0分和1分；合并Gilbert综合征患者肝脏内铁沉积主要位于Ⅰ区肝细胞内，围绕汇管区，Ⅰ区至Ⅲ区铁沉积递减（图3），高倍镜下铁颗粒较细，在肝细胞内弥漫分布（图4），部分铁颗粒分布偏于向肝细胞胆管极，可勾勒出毛细胆管；合并乙型肝炎患者肝脏内铁沉积无明确规律，除肝细胞内有铁沉积外，肝窦细胞及汇管区组织细胞内亦有铁沉积，见表1。

图3. 原发性血色病合并Gilbert综合征患者铁沉积主要位于Ⅰ区肝细胞内，围绕汇管区，Ⅰ区至Ⅲ区铁沉积递减普鲁士蓝染色×200.

图4. 原发性血色病合并Gilbert综合征患者铁颗粒较细，在肝细胞内弥漫分布普鲁士蓝染色×400.

Gilbert综合征患者炎症及纤维化程度均较轻，炎症活动度最高为3分，纤维化程度均为1分；肝内铁沉积主要位于Ⅰ区周围肝细胞内，围绕汇管区，有向Ⅲ区递减的趋势，铁颗粒较细（图5）。铁颗粒在肝细胞内弥漫分布，部分位于肝细胞毛细胆管极，可勾勒出毛细胆管（图6）。

图5. Gilbert综合征患者肝内铁沉积主要位于Ⅰ区周围肝细胞内，围绕汇管区，有向Ⅲ区递减的趋势，铁颗粒较细普鲁士蓝染色×200.

图6. Gilbert综合征患者肝内铁颗粒部分位于肝细胞胆管极，可勾勒出毛细胆管（箭头所示）普鲁士蓝染色×200.

血液系统疾病患者包括2例遗传性球形红细胞增多症，3例地中海贫血。5例患者炎症及纤维化程度均较轻，炎症活动度最高为4分，纤维化程度均为1分；肝内铁沉积也有区域性分布，主要位于汇管区周围，但除了肝细胞内铁沉积，肝窦细胞及汇管区组织细胞也有较明显的铁沉积。铁在肝细胞内弥漫分布，颗粒较粗（图7）。

图7. 血液性疾病患者肝内铁沉积主要位于汇管区周围，肝细胞、肝窦细胞及汇管区组织细胞均有铁沉积，颗粒较粗普鲁士蓝染色×200.

病毒性肝炎肝组织炎症活动度及纤维化程度不一，但与铁沉积的程度无一致性，炎症较轻时也可以有较严重的铁沉积。铁在肝小叶内弥漫分布，除了肝细胞内铁沉积外，均有明显的肝窦细胞及汇管区细胞的铁沉积，高倍镜下铁颗粒较粗，有大块状铁颗粒（图8）。

图8. 病毒性肝炎患者肝内明显的肝窦及汇管区细胞铁沉积，有大块状铁颗粒 普鲁士蓝染色×400.

脂肪性肝病及药物性肝损伤引起的铁沉积，数量较少，呈灶状分布，主要位于肿胀或气球样变的肝细胞内，颗粒粗细不等，部分病例可在肝窦或汇管区细胞内见少量铁沉积。

另有2例含铁食物摄入过多患者，血色病基因检测未发现异常，铁染色显示肝细胞、肝窦细胞及汇管区均有较明显的铁沉积，无明显区域性分布。

4．不同病因铁沉积情况及组织学改变比较：31例血色病病例中，有遗传性疾病的11例，包括原发性血色病2例，Gilbert综合征4例，血液系统遗传性疾病5例，这些病例的铁沉积主要在肝细胞内，非肝细胞（肝窦细胞及汇管区）铁沉积较少，其非肝细胞铁沉积评分低于无遗传性疾病的患者（t=-2.45,P＜0.05），差异有统计学意义。有遗传性疾病患者肝脏炎症活动度（t=-5.81,P＜0.01）及纤维化程度（t=-5.57,P＜0.01）也明显低于无遗传性疾病患者，见表2。

表2. 有及无遗传性疾病患者Deugnier评分及Ishak评分比较（■±s）.

组别	例数	肝细胞内铁沉积	肝窦细胞及汇管区铁沉积	炎症活动度	纤维化程度
有遗传性疾病患者	11	12.55±4.80	4.09±4.01	2.45±1.13	0.91±0.30
无遗传性疾病患者	20	10.80±7.18	8.75±6.54	8.20±4.15	2.70±1.38
t值		0.72	-2.45	-5.81	-5.57
P值		0.48	0.02	0.00	0.00

讨论

血色病时，铁在肝脏中蓄积，可导致肝硬化、肝细胞癌等一系列后果。血色病患者通常没有特异性的临床症状，一般多因肝功能异常进行肝活体组织检查才发现肝内铁沉积。有症状的血色病患者多见于男性，女性月经的存在推迟了铁的沉积，因此症状多出现在绝经、子宫切除术或长期连续使用口服避孕药之后^[4]。本组31例患者中仅有5例为女性，其中3例年龄较大。

铁沉积可能影响实质细胞（主要为肝细胞）和间质细胞（包括汇管区的吞噬细胞和纤维间隔，肝窦的枯否细胞和贮脂细胞等），它在小叶内的密集程度和分布经常有区域间的差异，肝脏内铁沉积分为3种模式，实质铁沉积、间质铁沉积和混合铁沉积^[5]。不同原因造成的血色病铁沉积模式也不同。

遗传性血色病在西方国家常见，铁多沉积于汇管区周围，以Ⅰ区肝细胞为主，而枯否细胞内沉积较少。随着HFE基因、HJV基因、转铁蛋白受体2、膜铁转运蛋白和铁调素的相继发现，遗传性血色病的相关研究获得突破性进展^[6]。根据不同类型基因的突变，遗传性血色病包括有四个不同的类型^[7]。但本组中两例原发性血色病患者，均为HFE基因异常。

在早期HFE血色病，铁位于肝细胞胆管极，分布从汇管区周围向小叶中心区域梯度递减，这是典型的实质铁沉积模式。本组有1例原发性血色病合并Gilbert综合征患者符合这种典型的铁沉积模式。令人奇怪的是，4例Gilbert综合征患者铁沉积也符合这一模式。Gilbert综合征是一种遗传性非结合胆红素血症，它的发病原因是位于染色体2q37位点的UGT1A1基因发生缺陷，导致胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶表达下降。Wallner等^[8]报道38例Gilbert综合征患者血清游离铁比正常对照组明显升高，但此基因突变与肝内铁沉积的关系尚罕有过报道，肝内铁沉积及模式是否与UGT1A1基因有关，是否存在尚未发现的突变位点尚有待进一步研究。但此现象提示Gilbert综合征患者肝细胞中如果有色素沉积，应做铁染色除外铁沉积。此外，如果首先发现肝细胞内铁沉积模式为典型的HFE血色病模式，应该注意患者血清胆红素的变化以除外Gilbert综合征，必要时做基因检测。而另一例合并病毒性肝炎的原发性血色病患者铁沉积并不符合这种模式，其铁沉积与继发性血色病中病毒性肝炎铁沉积模式类似。这说明病毒感染会干扰原发性血色病时铁的沉积及分布。

继发性血色病铁多沉积于小叶中心区，较弥漫。以枯否细胞内为主，或肝细胞和枯否细胞同等量。显著的间质铁沉积或混合性铁沉积多继发于其他一些疾病。遗传性球形红细胞增多症是一种红细胞膜异常的遗传性溶血性贫血，地中海贫血是由于珠蛋白生成障碍引起的遗传性溶血性贫血，因为铁进入红系前体细胞受损，肠道铁吸收增加。随着时间进展，会出现类似于血色病的严重肝铁过载。如果输血，铁就会沉积在实质和间质细胞中^[9]。本组中5例溶血性贫血患者铁沉积模式与原发性血色病类似，但不同于原发性血色病，两者铁沉积均主要位于汇管区周围，但前者除了肝细胞内铁沉积，还有肝窦细胞内的铁沉积，且颗粒较粗。而且相对于遗传性血色病，前者在汇管区、间隔、肝窦内有较多的淋巴细胞浸润^[5]。这提示我们，如果铁沉积主要位于汇管区周围，除了原发性血色病，还需要注意有无溶血性疾病的可能。

在病毒性肝炎，肝脏铁沉积存在于35%～56%的病例，特别是在慢性丙型肝炎患者^[10]。Giannini等^[9]对53例不伴有HFE基因突变的慢性丙型肝炎患者的研究结果显示，其中19例（36%）有肝内铁蓄积，而肝内铁蓄积与肝脏的炎症及进展的肝硬化相关。组织学特点通常是间质性的，铁经常沉积在内皮细胞。本组乙型及丙型肝炎患者铁沉积不仅见于肝细胞，而且在肝窦细胞及汇管区吞噬细胞和内皮细胞中也较多见。病毒性肝炎引起铁沉积的机制尚不明确，铁代谢异常可能是病毒性肝炎肝损伤的结果。Thorburn等^[11]报道164例进行肝活检的慢性丙型肝炎患者，其中67例（41%）有HFE突变，但HFE突变与患者临床、生物化学、病理及肝铁浓度不相关。本组研究中仅有一例乙型肝炎合并HFE突变者，此患者病理形态、铁沉积量及模式与其他不伴HFE突变的乙型肝炎患者亦无明显差异。Van Vlierberghe等^[12]研究显示利巴韦林治疗慢性丙型肝炎会引起肝内铁沉积，可能与该药导致的溶血性贫血有关。

慢性酗酒者有间质或混合型的轻度肝铁沉积^[5]。本研究中酒精性脂肪性肝病患者肝内铁沉积主要位于肿胀或气球样变的肝细胞内，灶状分布。铁沉积的原因至少部分与酒精对铁调素合成的负作用有关，铁调素是肝脏特异性表达的一种小分子抗菌肽，是铁代谢的负调节激素。有证据显示，铁调素直接抑制肠上皮细胞铁吸收和诱导单核巨噬细胞铁滞留^[13]。药物性肝损伤引起的铁沉积模式与酒精相似，可能与药物中含有的铁有关。此外，本组研究中还有2例因含铁食物摄入过多的肝铁沉积患者，血色病基因检测未发现明确异常，铁染色显示肝细胞、肝窦细胞及汇管区均有较明显的铁沉积。而且铁沉积模式与文献中报道的铁沉积模式相同，铁首先积聚在枯否细胞和汇管区巨噬细胞。随着时间进展，铁重新向周围的实质细胞分布，导致混合模式，分布混杂不均^[5]。

组织学铁沉积的模式和肝脏损伤之间的关系仍然不清楚。原发性血色病时炎症细胞浸润不明显，纤维化程度较轻。Turlin等^[14]研究显示，单纯实质铁过载的铁过载代谢紊乱综合征患者比混合或间质模式患者，不易发生脂肪变性和纤维化。这与本组的研究相似，我们的1例原发性血色病及4例Gilbert综合征患者铁沉积均主要是肝细胞内，炎症活动度及纤维化程度均较轻。同时，血液系统疾病造成的铁沉积肝组织炎症及纤维化程度也较轻。

本研究中只要是由于遗传性疾病因素造成的铁沉积，炎症活动度及纤维化程度均明显低于无遗传性疾病病例，这一点可作为辅助诊断。而病毒性肝炎、酒精及药物造成的铁沉积炎症活动度及纤维化程度均相对较重。与实质或混合模式的铁沉积相比，间质铁沉积患者更容易有纤维化、汇管区炎症、肝细胞气球样变。相反的是，Valenti等^[15]发现实质铁沉积与更严重的肝损伤相关。

随着影像技术及分子技术的发展，无创性技术在血色病诊断中得到了越来越多的应用，但是，肝脏活体组织检查组织学分析仍然是必不可少的，在诊断明确的遗传性血色病中评估相关的肝脏损伤，在未分类的遗传性或继发性血色病指导病因诊断，判断预后仍然需要组织学评估。病理医生的目的应该是鉴别不同的铁沉积类型，明确铁在肝小叶内的分布情况，评估肝脏炎症及纤维化程度。

Funding Statement

基金项目：首都医科大学附属北京地坛医院院内科研基金“育苗计划”（DTYM201401）