Abstract
目的
探究肝癌和胱硫醚β-合成酶（cystathionine β-synthase，CBS）基因及胱硫醚γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CTH）基因的关系。
方法
通过挖掘GEO（gene expression omnibus）与TCGA（the cancer genome atlas）数据库，对肝癌的临床特征与CBS及CTH基因表达进行了相关性分析。并通过对肝癌细胞系进行免疫印迹验证。
结果
CBS及CTH在肿瘤中的表达较非肿瘤明显降低（P＜0.05）。Cox回归结果显示CBS是肝细胞癌不良预后的独立危险因素（HR = 0.65，P = 0.02）。针对CBS基因对不同肿瘤分期进行单因素logistics回归分析，发现肝癌TNM分期II期比I期（P =0.01，OR=0.50）、III期比I期（P =0.03，OR=0.56）、T分期T2期比T1期（P＜0.01，OR=0.43）、T3期比T1期（P=0.02，OR=0.54）CBS基因显著降低。肝癌TNM分期III期比I期（P=0.01，OR=0.50），Edmondson分期II期比I期（P =0.03，OR=0.48），III期比I期（P＜0.01，OR=0.30），IV期比I期（P=0.03，OR=0.22）CTH基因表达显著降低。GSEA富集分析结果显示，与肝癌细胞CTH与CBS基因表达相关性最高的信号通路为细胞色素P450（FDR Q＜0.01，FWER P＜0.01）。免疫印迹结果显示，与人肝永生化细胞系HL-7702相比，HLE和Hep3B细胞等肝细胞癌细胞系中CTH下游蛋白CSE表达降低。
结论
肿瘤组织中的CBS及CTH基因表达低于正常组织。CBS基因是肝细胞癌不良预后的独立危险因素。与CBS及CTH基因关系最为密切的是信号通路为细胞色素P450通路。
Keywords: 肝癌, 生物信息学, 数据挖掘, 胱硫醚β-合成酶, 胱硫醚γ-裂解酶
Abstract
Objective
To study the relationship between cystathionine β-synthase（CBS）and cystathionine γ-lyase（CTH）genes-related signaling pathways in liver cancer cells.
Methods
We conducted a correlation analysis between the clinical features of CBS and CTH gene expression by mining the GEO（Gene Expression Omnibus）and TCGA（The Cancer Genome Atlas）databases of liver cancer. Additionally, liver cancer cell lines were verified by immunoblotting.
Results
CBS and CTH expressions were significantly lower in tumors than in non-tumors（P<0.05）. COX regression result showed that CBS was an independent risk factor for the poor prognosis of liver cancer cells（HR=0.65, P=0.02）. A univariate logistic regression analysis was performed on the different tumor stages focusing on the CBS gene, which showed that TNM stage II verses I（P=0.01, OR=0.50）, stage III verses I（P=0.03, OR=0.56）, T stage T2 verses T1（P<0.01, OR=0.43）, and T3 stage verses T1（P=0.02, OR=0.54）were significantly lower in liver cancer. TNM stage III verses I（P=0.01, OR=0.50）, Edmondson stage II verses I（P=0.03, OR=0.48）, stage III verses stage I（P<0.01, OR=0.30）, stage IV verses I（P=0.03, OR=0.22）, and T stage T3 verses T1（P=0.03, OR=0.22）of the CTH gene expressions were significantly lower in liver cancer. GSEA enrichment analysis result revealed that the signaling pathway most correlated with the expression of CTH and CBS genes in liver cancer cells was cytochrome P450（CYP450）（FDR Q<0.01, FWER P<0.01）. Western blot results showed that the expression of the CTH downstream protein CSE was reduced in HCC cell lines such as HLE and Hep3B cells compared with the human immortalized liver cell line HL-7702.
Conclusion
CBS and CTH gene expressions are lower in tumor tissue than in normal tissue groups. The CBS gene is an independent risk factor for poor prognosis in stem cell carcinoma. The cytochrome P450 is the signaling pathway most closely related to the CBS and CTH genes.
Keywords: Liver cancer, Bioinformatics, Data-mining, Cystathionine ß-synthase, Cystathionine γ-lyase
肝癌在所有癌症死亡中位列第4位，其发病率位列第6位。尽管治疗手段层出不穷，肝癌的5年生存率仅为18%[1]。近些年研究结果显示气体信号分子一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化碳（carbon monoxide，CO）和硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）对多种哺乳动物生理及病理功能具有调节功能。越来越多的证据表明H2S与许多心血管系统、呼吸系统及风湿免疫性疾病有关[2, 3, 4]。在哺乳动物中，H2S由转硫基反应通过胱硫醚β-合成酶（cystathionine β-synthase，CBS）将同型半胱氨酸转化为胱硫醚。胱硫醚再通过胱硫醚γ-裂解酶（cystathionine-gamma-lyase，CTH）转化为L-半胱胺酸和2-丁酮酸。CBS及CTH基因在哺乳动物产生H2S和含硫氨基酸代谢中起重要作用[5]。最近一些证据表明H2S在肝癌中起双刃剑的作用。通过不同的信号通路，H2S既可以促进肝癌细胞的增殖，也可以促进肝癌细胞的自噬[6, 7, 8]。H2S在肝癌细胞中扮演的角色目前仍旧不十分明了。本研究旨在通过下载GEO（gene expression omnibus）与TCGA（the cancer genome atlas）公共数据库的数据，对其中肝癌组织与正常组织中CBS及CTH基因表达进行比较，并对肝癌的分期及预后与CBS及CTH基因表达进行分析。此外，通过GSEA（gene set enrichment analysis）富集分析对CBS与CTH基因相关的信号通路进行研究，以此探索其潜在的机制。并通过免疫印迹法比较了人肝永生化细胞系HL-7702与HLE和Hep3B细胞等肝细胞癌细胞系中CTH下游蛋白CSE的表达量。
材料与方法
1.数据来源：GEO数据集GSE76427、GSE74656、GSE84402、GSE89377、GSE99807、GSE101685、GSE107170、GSE112790、GSE121248中癌组织及癌旁组织的表达信息被下载并进行了分析（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。截至2021年12月份，所有TCGA官方数据库中关于肝癌的RNA测序信息被下载，其中包含386个肿瘤标本及38个癌旁标本（https://cancergenome.nih.gov/）。应用4.0.3版本的R软件，对GEO及TCGA数据库中肿瘤与非肿瘤的CBS及CTH的mRNA表达差异进行Wilcoxon检验，并应用beeswarm程序包进行可视化（0.4.0版本）。如果原始数据未进行log2处理，用R语言Limma程序包（3.50.1版本）进行log2处理，并对重复的探针对应的表达量取平均值。其中，P值≤0.05，倍数值≥2被认定为具有统计学意义。TCGA数据库中患者的临床信息被下载下来并应用Perl软件（5.32版本）与患者基因表达量进行匹配。在删除了缺失的数据后，CBS及CTH基因的表达量被从高往低进行排序，并以中位数作为截点分为高表达组与低表达组，并对死亡这一终点应用log-rank检验进行Kaplan-Meier生存分析。logistics回归分析用来分析CBS和CTH表达与肝癌分期的关系。Cox回归分析用来分析肝癌预后的独立危险因素。所有肿瘤分期与分期均参照第8版AJCC肿瘤分级手册胰腺与肝胆肿瘤分册[9]。采用双侧P值，P＜0.05为差异有统计学意义。为了明确导致CBS及CTH在肝癌细胞中高低表达差异的信号通路及相关基因，进一步进行GSEA富集分析（4.2.0版本），以P值5%及Q值25%作为阈值。
2.细胞培养：人正常肝细胞系HL-7702和两种肝细胞癌细胞系PLE和Hep3B均获自北京肝病研究所。使用添加了10%FBS的DMEM在37℃的5℃CO2培养箱中培养细胞系。
3.免疫印迹：细胞在低温下RIPA裂解缓冲液中用蛋白酶抑制剂裂解，使用12 % SDS-PAGE分离40μg细胞蛋白，然后转移到硝酸纤维素膜上。将膜与针对GAPDH（#2118，CST公司，美国）或CSE（12217-1-AP，proteintech公司，美国）的第一抗体在4℃下孵育过夜（稀释比1:1000）。随后在封闭后将膜与第二抗体在室温下孵育1h。通过与增强的化学发光系统（T4580，Thermo Scientific公司，美国）一起孵育，可以看到目标蛋白信号。
结果
1.肝癌与癌旁组织中CBS基因及CTH基因表达比较：所分析的GEO数据集资料见表1。GEO数据集GSE74627、GSE74656、GSE84402、GSE101685、GSE107170、GSE112790、GSE121248及TCGA数据库肝癌子库中CBS及CTH基因表达显著低于癌旁组织，而在数据集GSE89377和GSE99807中则没有差异，见图1，图2。
表1. GEO数据集相关信息.
| GEO数据集 | 提供者，年份 | 肿瘤组织（个） | 癌旁组织（个） | 测序平台 |
|---|---|---|---|---|
| GSE76427 | Grinchuk OV，2017 | 117 | 50 | Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip |
| GSE74656 | Tao Y，2015 | 10 | 5 | GeneChip® PrimeViewTM Human Gene Expression Array（with External spike-in RNAs） |
| GSE84402 | Wang H，2017 | 14 | 14 | [HG-U133 Plus 2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array |
| GSE89377 | Eun J，2017 | 94 | 13 | Illumina HumanHT-12 V3.0 expression beadchip |
| GSE99807 | Wu J，2020 | 4 | 4 | [HG-U133 Plus 2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array |
| GSE101685 | Sen-Yung H，2019 | 22 | 10 | [HG-U133 Plus 2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array |
| GSE107170 | Diaz G，2018 | 159 | 120 | [HG-U133 Plus 2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array |
| GSE112790 | Shimada S，2019 | 183 | 15 | [HG-U133 Plus 2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array |
| GSE121248 | Hui KM，2018 | 70 | 37 | [HG-U133 Plus 2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array |
图1. GEO及TCGA数据集中CBS基因在癌组织及癌旁组织的表达比较.
注：Normal：癌旁组织；Tumor：癌组织；expression：表达；CBS：胱硫醚β-合成酶
图2. GEO及TCGA数据集中CTH基因在癌组织及癌旁组织的表达比较.
注：Normal：癌旁组织；Tumor：癌组织；expression：表达；CTH：胱硫醚γ-裂解酶
2.CBS与CTH基因与肝癌预后的生存分析：CTH及CBS基因高低表达组与肝癌预后的生存分析曲线存在交叉，为了进一步研究CBS基因与CTH基因表达与肝癌预后的关系，应用Cox回归进一步分析肝癌的独立危险因素，见图3。Cox回归结果显示，CBS基因低表达是肝癌患者死亡的独立危险因素（图4）。
图3. 以CBS及CTH基因高低表达分组对肝癌死亡进行生存分析.
注：CBS：胱硫醚β-合成酶；CTH：胱硫醚γ-裂解酶
图4. 肝癌死亡因素的多因素Cox回归分析.
注：CBS：胱硫醚β-合成酶；CTH：胱硫醚γ-裂解酶
3.CBS及CTH表达与临床信息之间的相关性分析：结果显示肝癌TNM分期II期比I期（P = 0.01，OR = 0.50），III期比I期（P = 0.03，OR = 0.56），T分期T2期比T1期（P＜0.01，OR = 0.43），T3期比T1期（P = 0.02，OR = 0.54）CBS基因显著降低。肝癌TNM分期III期比I期（P = 0.01，OR = 0.50），Edmondson分期II期比I期（P = 0.03，OR = 0.48），III期比I期（P＜0.01，OR = 0.30），IV期比I期（P = 0.03，OR = 0.22）和T分期T3比T1期（P = 0.01，OR = 0.49）CTH基因显著降低。
4.GSEA富集分析：CBS及CTH基因高表达被用来进行肝癌GSEA富集分析。以P值为5 %，Q值为0.25时，与肝癌CBS及CTH基因表达关联性排名前10的KEGG通路结果见表3、表4。与CTH及CBS基因联系最紧密的信号通路为细胞色素P450通路，它随着CBS及CTH的上调而上调，（FDR Q值＜0.01，FWER P值＜0.01）（图5）。
表3. 肝癌CBS基因GSEA富集分析.
| KEGG信号通路 | ES | NES | FDR Q值 | FWER P值 |
|---|---|---|---|---|
| KEGG药物代谢细胞色素P450 | 0.78 | 2.38 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG维生素A代谢 | 0.78 | 2.31 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG甘氨酸丝氨酸和苏氨酸代谢 | 0.85 | 2.27 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG色氨酸代谢 | 0.78 | 2.25 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG通过细胞色素P450代谢外源物 | 0.72 | 2.22 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG过氧物酶体 | 0.71 | 2.19 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG精氨酸和脯氨酸代谢 | 0.65 | 2.18 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG脂肪酸代谢 | 0.87 | 2.17 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG缬氨酸亮氨酸和异亮氨酸降解 | 0.88 | 2.17 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG丙酸盐代谢 | 0.83 | 2.12 | ＜0.01 | ＜0.01 |
注：CBS：胱硫醚β-合成酶
表4. CTH基因的GSEA富集分析.
| KEGG信号通路 | ES | NES | FDR Q值 | FWER P值 |
|---|---|---|---|---|
| KEGG药物代谢细胞色素P450 | 0.78 | 2.32 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG维生素A代谢 | 0.78 | 2.26 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG甘氨酸丝氨酸和苏氨酸代谢 | 0.85 | 2.24 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG通过细胞色素P450代谢外源物 | 0.72 | 2.18 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG色氨酸代谢 | 0.78 | 2.14 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG精氨酸和脯氨酸代谢 | 0.65 | 2.13 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG过氧物酶体 | 0.71 | 2.10 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG缬氨酸亮氨酸和异亮氨酸降解 | 0.88 | 2.07 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG脂肪酸代谢 | 0.87 | 2.07 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| KEGG丙酸盐代谢 | 0.83 | 2.06 | ＜0.01 | ＜0.01 |
注：CTH：胱硫醚γ-裂解酶
图5. KEGG细胞色素P450与CBS及CTH基因的GSEA富集分析图.
注：红色为正相关，蓝色为负相关；CBS：胱硫醚β-合成酶；CTH：胱硫醚γ-裂解酶
表2. CBS及CTH表达与临床信息之间的相关性分析.
| 变量 | 例数（n） | CBS表达OR值 | CBS表达P值 | CTH表达OR值 | CTH表达P值 |
|---|---|---|---|---|---|
| 年龄 | 376 | 1.01（0.99～1.22） | 0.45 | 1.00（0.98～1.01） | 0.97 |
| Edmondson分期（II比I） | 372 | 0.97（0.52～1.77） | 0.91 | 0.48（0.25～0.91） | 0.03 |
| Edmondson分期（III比I） | 372 | 0.66（0.35～1.25） | 0.21 | 0.30（0.15～0.58） | 0.00 |
| Edmondson分期（IV比I） | 372 | 0.42（0.10～1.49） | 0.19 | 0.22（0.05～0.81） | 0.03 |
| TNM分期（II比I） | 348 | 0.50（0.29～0.84） | 0.01 | 0.71（0.42～1.20） | 0.20 |
| TNM分期（III比I） | 348 | 0.56（0.33～0.95） | 0.03 | 0.50（0.29～0.84） | 0.01 |
| TNM分期（IV比I） | 348 | 0.48（0.06～3.00） | 0.43 | 1.17（0.19～9.07） | 0.86 |
| T分期（T2比T1） | 374 | 0.43（0.26～0.71） | 0.00 | 0.65（0.39～1.08） | 0.10 |
| T分期（T3比T1） | 374 | 0.54（0.31～0.91） | 0.02 | 0.49（0.28～0.83） | 0.01 |
| T分期（T4比T1） | 374 | 0.59（0.18～1.85） | 0.36 | 1.24（0.40～4.24） | 0.72 |
| M分期（M1比M0） | 276 | 0.33（0.02～0.26） | 0.34 | 1.00（0.12～8.43） | 1.00 |
| N分期（N1比N0） | 261 | 1.00（0.12～8.44） | 1.00 | 0.33（0.02～2.60） | 0.34 |
注：CBS：胱硫醚β-合成酶；CTH：胱硫醚γ-裂解酶
5.通过免疫印迹测定肝细胞癌细胞系与对照组CTH下游蛋白CSE表达量免疫印迹结果显示，与人肝永生化细胞系HL-7702相比，HLE和Hep3B细胞等肝细胞癌细胞系中CTH下游蛋白CSE表达降低（P＜0.05，图6）。
图6. 肝细胞癌细胞系与对照组CSE蛋白表达量比较.
讨论
我们发现肿瘤组织中CBS及CTH基因的表达低于非肿瘤组织。Cox回归结果显示低CBS表达是肝癌死亡的独立危险因素。Logistic回归结果显示肿瘤T分期、TNM分期与CBS表达呈负相关，T分期、Edmondson分期和TNM分期与CTH表达呈负相关。GSEA富集分析结果显示与肝癌CBS及CTH基因最紧密的信号通路是细胞色素P450信号通路。免疫印迹结果显示，与人肝永生化细胞系HL-7702相比，HLE和Hep3B细胞等肝细胞癌细胞系中CTH下游蛋白CSE表达降低。
内源性H2S的生成主要通过CBS、CTH及3-巯基丙酮酸硫基转移酶调节。作为肝脏功能的重要调节分子，H2S在众多肝脏疾病如非酒精性脂肪性肝病、肝纤维化、肝脏缺血再灌注损伤及肝癌中发挥重大作用[10]。Zhen等[8]证明，作为一种内源性H2S的供体，硫氢化钠可以通过核因子-κB信号通路促进肝癌的生长。该研究团队后续又发现，外源性H2S可以通过STAT3/COX-2信号通路促进肝癌细胞的增殖与迁移[11]。与之相反，Wang等[6]发现硫氢化钠可以通过减弱PI3K/Akt/mTOR信号通路阻止肝癌细胞迁移和增殖并且促进肝癌细胞自噬。最新研究结果显示，低剂量硫氢化钠刺激肝癌细胞增殖及迁移，而高剂量的硫氢化钠则起相反作用，这提示H2S在肝癌进展中起双刃剑作用[7]。在一项对于人肝癌组织的研究中，Kim等[12]发现CBS基因在肝癌组织中远低于癌旁组织。他们发现低CBS表达与TNM分期、Edmondson分期和甲胎蛋白水平呈正相关。除此之外，他们发现低CBS表达的肝癌患者平均生存期明显较短，这与我们通过TCGA数据库挖掘的结果完全吻合。既往文献报道，尽管CBS及CTH两种酶均存在于肾脏、肝脏、脑、回肠、子宫及胎盘中，CBS在神经系统中占主导作用而CTH则在心血管系统中占主导作用[13]。通过Cox回归的结果，在肝癌患者中，CBS而非CTH通过调节H2S的产生而对预后产生影响，且为预测肝癌预后的独立因素。
GSEA富集分析结果显示，CBS及CTH通过KEGG CYP450通路调节肝癌细胞的生长。H2S与CYP450的关系非常复杂。Tan等[14]发现，在肝硬化小鼠模型中，硫氢化钠可以抑制CYP450的活性，起到抗氧化剂的作用，并进一步保护肝脏细胞免受四氯化碳诱导的急性肝损伤。然而，在一项研究动物空肠的研究中，在连续暴露于H2S 42 d后，空肠组织中CYP450基因表达明显增加，伴随着细胞氧化应激、炎症及凋亡等现象[15]。在肝癌中，合成CYP450和H2S也有积极影响。在一项离体的研究中，硫氢化钠对于CYP450高表达的人类肝癌细胞系HepG2相较于无CYP450表达的有更高的细胞毒性。其机制是通过铁依赖的氧化应激及脂质过氧化调节的，它可以杀伤肝癌细胞并延长患者的生存期[16]。进一步来说，CYP450本身也是重要的代谢酶并在肝癌的进展中起关键作用。Jiang等[17]发现肝癌细胞中CYP450表达明显下调。低CYP450表达与病理分期较差、肝脏炎症较重、血管转移、感染及预后较差呈正相关。低CYP450表达与选择性激活巨噬细胞极化与损伤巨噬细胞成熟和吞噬作用相关。Yu等[18]发现CYP450在肝癌组织中呈明显的“沉默”状态，且高CYP450表达与甲胎蛋白较低、血管浸润较少和长生存周期有关。过表达的CYP450可以抑制肝癌细胞的活性和形成集落的能力，减低肝癌细胞的迁移和浸润能力、降低致瘤性，而敲除CYP450则有相反作用。其机制主要涉及干细胞生长因子及缺氧诱导因子1α表达有关。
本研究存在一些不足。一方面，GEO数据库上关于肝癌的数据集较多，我们无法下载所有数据并进行分析，所以有可能产生一定程度的选择偏倚。另一方面，我们没有进行更多的实验如实时定量PCR及免疫组织化学等对数据挖掘的结果进行验证。尽管有这些缺陷，研究肝癌细胞调节H2S生成的酶的生物信息学研究仍然较为罕见。
综上所述，通过挖掘GEO及TCGA数据库发现，CBS及CTH基因表达在肿瘤组织中明显降低，低CBS基因表达提示肝癌预后不良。与CTH及CBS在肝癌中表达最密切的信号通路为细胞色素P450通路，需要未来研究进一步探索其具体机制。
引用本文：
刘子衿，马亚楠.应用生物信息学数据挖掘探究胱硫醚β-合成酶和胱硫醚γ-裂解酶基因表达在肝癌不良预后中的预测价值[J].中华肝脏病杂志，2023，31（11）: 1169-1175.DOI: 10.3760/cma.j.cn501113-20220529-00290.
利益冲突
所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献声明
刘子衿：研究设计，实施研究、数据分析、文章撰写；马亚楠：细胞实验及实验室检测
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