Abstract
30只小鼠采用盲肠结扎穿刺法制作脓毒症模型，腹腔注射15mg/kg亚甲蓝或等渗盐水。观察肝组织病理改变，检测肝巨噬细胞频数变化和肝M1、M2型炎症因子表达情况，检测脂多糖刺激后巨噬细胞炎症因子表达水平。结果显示MB组小鼠的肝病理学损伤明显减轻（P＜0.05）；肝巨噬细胞频数变化差异无统计学意义（P＞0.05）；MB促进肝M2型炎症因子表达升高（P＜0.05）、巨噬细胞M2型炎症因子表达增多（P＜0.05）。MB可通过诱导巨噬细胞向M2型极化从而发挥预防脓毒症肝损伤的作用。
Keywords: 亚甲蓝, 脓毒症, 肝损伤, 巨噬细胞
Abstract
Thirty mice were used to establish a sepsis model with cecalligation and puncture. 15 mg/kg methylene blue or isotonic saline were injected intraperitoneally to observe liver tissue pathological changes. Changes in macrophage frequency and expressional condition of M1 and M2-type hepatic inflammatory factors were detected. After LPS stimulation,the expression level of macrophage inflammatory factor were detected. The results showedtha the pathologicalliver injury was significantly reduced in the MB mice group (P＜0.05), and the frequency of liver macrophage was not statistically significantly different (P＞0.05). MB elevation had promoted the expression of M2-type hepatic inflammatory factor (P＜0.05) and macrophage inflammatory factor (P＜0.05). MB can play a role in preventing septic liver injury by inducing macrophages polarization to M2-type.
Keywords: Methylene blue, Sepsis, Liver injury, Macrophage
脓毒症被定义为机体对感染反应失调所致的危及生命的器官功能障碍[[1]，是重症患者死亡的主要原因，脓毒症病死率高[2]，治疗困难。肝脏作为人体最大的解毒器官，参与机体对感染反应的免疫调节，保护机体免受过度炎症反应的损伤。脓毒症时，肝脏的上述作用受到抑制，出现脓毒症肝损伤（sepsis-associated liver injury，SALI）,SALI的发病率高达34.7%[3]。肝损伤会严重影响脓毒症的预后，肝功能障碍和肝衰竭可直接导致脓毒症进展和患者死亡，即肝脏在脓毒症病程中发挥至关重要的作用[4]，因此，减轻SALI有助于降低脓毒症患者的病死率、改善患者的预后。
巨噬细胞作为宿主免疫防御的第一道防线，在SALI期间对机体损伤迅速作出反应，如分泌促炎因子肿瘤坏死因子（TNF）-α以及抑炎因子白细胞介素（IL）-10等。SALI伴有进行性胆汁淤积，其严重程度与过度炎症反应有关，在其病理生理过程中，巨噬细胞与胆汁淤积和肝衰竭的发病机制密切相关[5]。因此，巨噬细胞在SALI过程中发挥关键作用。
亚甲蓝（methylene blue, MB）是一种无味、水溶性、深蓝绿色结晶粉末[6]，1876年MB作为纺织染料首次合成，1891年开始作为药物应用，之后被广泛用于临床，近期研究表明，MB可用于心脏手术中治疗围手术期出现的难治性低血压[7]，可通过其血管活性调节作用改善脓毒性休克[8]。MB还可保护小鼠对抗药物引起的肝损伤[9]，改善肝肺综合征。总之，MB能有效改善脓毒性休克患者的血流动力学紊乱和肝脏微循环。因此，MB对SALI可能具有潜在的治疗作用。本研究旨在通过体内外实验观察MB对脓毒症肝脏病理损伤及肝脏免疫炎症反应产生的影响，探讨MB在SALI中发挥的作用及其可能机制，为SALI的有效治疗提供思路和理论依据。
一、材料与方法
1.实验动物和细胞：选用8～10周C57BL/6野生型雄性小鼠（22～25g），在无特定病原体级环境中饲养。小鼠巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海生命科学研究院。所有动物实验均依从实验动物使用及饲养指南进行，并符合南通大学附属第三人民医院医学伦理委员会审核批件。
2.实验方法：（1）动物实验：30只小鼠随机分为2组：脓毒症组（CLP组）和亚甲蓝（MB）组，采用盲肠结扎穿刺法（CLP）制作脓毒症模型。MB组于CLP术前1h和术后6h分别经腹腔注射亚甲蓝15mg/kg，CLP组注射等量的等渗盐水。术后12h处死小鼠收集肝脏标本，分离肝脏单个核细胞，通过流式细胞仪技术检测肝脏单细胞悬液中CD11b+和F4/80+细胞频数变化，实时荧光定量PCR技术（q RT-PCR）检测肝组织的M1型炎症因子诱导型一氧化氮合酶（i NOS）、TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和M2型炎症因子精氨酸酶-1（ARG-1）、IL-10、IL-34的表达水平，肝组织用苏木精-伊红（HE）染色观察病理改变。（2）细胞实验：设空白（CON）组、脂多糖（LPS）组和亚甲蓝（MB）组，MB组巨噬细胞在亚甲蓝预处理后用含100ng/ml LPS+3μmol/L MB的培养基培养，CON组和LPS组用完全培养基预处理，LPS组用含100ng/ml LPS的培养基培养，12h后提取m RNA，q RT-PCR检测细胞炎症因子表达情况。
3.统计学方法：数据以均数±标准差（
±s）表示，组间比较采用t检验。所有统计分析均使用Graph Pad Prism 8.0进行。P＜0.05为差异有统计学意义。
二、结果
1.亚甲蓝对脓毒症小鼠肝脏病理改变的影响：CLP组小鼠肝组织HE染色可见中央静脉有充血、出血现象，大量炎症细胞浸润，大片空泡样变性及肝细胞坏死；而MB组炎症细胞浸润减少，充血、出血减轻，且空泡样变性显著减少，肝血窦的形态结构较CLP组清晰规则（图1）。病理评分结果提示MB组小鼠肝脏炎症细胞数较CLP组减少，坏死程度显著降低（表1）。上述结果表明，亚甲蓝能够有效改善脓毒症小鼠的肝损伤。
图1. 两组小鼠肝组织病理学检查结果.
注：A、C为脓毒症组小鼠肝组织HE染色结果；B、D为亚甲蓝组肝HE染色结果；放大倍数：A、B：×200；C、D：×400
表1. 小鼠肝脏损伤的病理评分（±s).
| 组别 | 动物数（只） | 炎症细胞数（细胞数/视野） | 坏死（程度评分） |
|---|---|---|---|
| 脓毒症组 | 15 | 170.29±34.02 | 1.50±0.62 |
| 亚甲蓝组 | 15 | 116.67±26.10a | 0.36±0.51b |
注：a： P < 0.05；b： P < 0.001
2.亚甲蓝对脓毒症小鼠肝组织巨噬细胞频数的影响：分离小鼠肝脏单个核细胞，检测两组小鼠肝脏单细胞悬液中巨噬细胞（CD11b+和F4/80+）的频数变化，发现两组小鼠肝巨噬细胞频数差异无统计学意义（P＞0.05），由此可得，MB改善SALI不是通过改变巨噬细胞频数变化来实现的（图2）。
图2. 两组小鼠巨噬细胞频数的变化差异无统计学意义.
注：CLP：脓毒症组；MB：亚甲蓝组；A：CLP组频数；B：MB组频数；C：两组比较
3.亚甲蓝对脓毒症小鼠肝组织炎症因子表达的影响：与CLP组相比，MB组小鼠肝脏M2型炎症因子ARG-1、IL-10、IL-34的m RNA表达水平显著升高（P＜0.05），并且MB组的M2/M1比率较CLP组显著增大（P＜0.05）。而上述结果已表明，亚甲蓝并不改变巨噬细胞的频数变化，因此，亚甲蓝可能通过诱导巨噬细胞向M2型极化从而促进肝组织M2型炎症因子的表达（图3）。
图3. 脓毒症组和亚甲蓝组小鼠炎症因子m RNA表达的比较.
注：1～3：为M2型炎症因子精氨酸酶-1、白细胞介素-10、白细胞介素-34的表达水平；5～7：为M1型炎症因子一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子-α、单核细胞趋化蛋白-1表达水平；9：M2/M1（白细胞介素-10/一氧化氮合酶）；a：P＜0.05；b：P＜0.01；c：P＜0.001；d：P＜0.0001
4.亚甲蓝对巨噬细胞炎症因子表达的影响：MB组的抑炎因子ARG-1、IL-10、IL-34的表达水平显著高于LPS组（P＜0.05），并且同样地，MB组的M2/M1比率较LPS组显著增大（P＜0.05），提示亚甲蓝可通过诱导巨噬细胞向M2型极化从而上调抑炎因子的表达（图4）。
图4. 脂多糖组和亚甲蓝组小鼠炎症因子m RNA表达的比较.
注：A：M1型炎症因子表达水平；B：M2型炎症因子表达水平；C：M2/M1表达比率；LPS：脂多糖组；MB：亚甲蓝组；i NOS：一氧化氮合酶；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；MCP-1：单核细胞趋化蛋白-1；ARG-1：精氨酸酶-1；IL：白细胞介素；a：P＜0.05；b：P＜0.01
三、讨论
脓毒症是全球重症医学的研究热点，其病理生理学机制复杂、治疗难度高，寻求新的有效治疗药物或靶点十分必要。而越来越多的证据显示，SALI可直接导致脓毒症的病情进展、病死率增加，脓毒症患者的早期肝功能障碍是导致患者死亡的一项独立危险因素[10]。因此能够有效减轻SALI的药物对于降低脓毒症患者的病死率和改善患者的预后十分有益。
亚甲蓝是一个具有重新利用潜力的“希望”药物。本研究也证实了亚甲蓝对SALI的保护作用。机制方面，有学者提出，亚甲蓝可通过抑制诱导型i NOS和可溶性鸟苷酸环化酶（s GC）的活化影响一氧化氮的合成[11]，从而起到收缩血管、增加循环阻力、提高平均动脉压的作用；还能通过作用于一氧化氮/环磷酸鸟苷（NO/c GMP）通路改善脓毒性休克患者的血流动力学紊乱[6]；Donati等[12]证明了脓毒性休克期间亚甲蓝可发挥快速收缩血管和正性肌力作用；并且亚甲蓝能通过抑制脓毒症小鼠早期肝脏i NOS的转录和表达来改善肝脏微循环。而本研究中发现亚甲蓝可通过诱导巨噬细胞向M2型极化来促进M2型炎症因子表达，从而发挥抑炎作用，改善SALI。
巨噬细胞在SALI的发病机制中起关键作用。巨噬细胞可分为M1型（经典活化的巨噬细胞）和M2型（替代性活化的巨噬细胞），它们代表不同的免疫代谢状态，发挥不同的功能。M1型巨噬细胞通过分泌促炎性因子，参与正向免疫应答；M2型巨噬细胞通过分泌抑炎性因子IL-10等下调免疫应答，在免疫调节中发挥重要作用。有研究表明，IL-10由于其免疫抑制效应在脓毒症期间发挥保护机体的作用，并且IL-10的免疫抑制作用与巨噬细胞的免疫代谢状态由促炎性M1型巨噬细胞转化为抑炎性M2型巨噬细胞有关[13]。M2型巨噬细胞在抗炎和促进组织修复方面发挥重要作用。在脓毒症早期，巨噬细胞向M1型分化，产生促炎性介质，而后期阶段，M1型巨噬细胞向M2型转化，发挥免疫抑制作用，促进组织修复。由于免疫炎症反应在脓毒症的发病过程中起至关重要的作用，因此对抗炎症反应可有效减轻肝损伤并降低脓毒症患者的病死率[14]。本研究中发现亚甲蓝可促进脓毒症小鼠肝组织和巨噬细胞M2型炎症因子的表达，我们提出MB可能通过诱导巨噬细胞向M2型极化从而上调抑炎因子的表达，发挥保护SALI的作用。
综上所述，本研究结果证实了亚甲蓝可通过诱导巨噬细胞向M2型极化从而发挥预防SALI的作用。SALI期间巨噬细胞的免疫代谢状态可以直接影响其结局。因此，详细研究巨噬细胞的免疫代谢及其对SALI发病机制的影响，将有很大的潜力去设计和开发新的治疗方案来治疗SALI。最后，本研究中对于巨噬细胞如何向M2型极化的具体触发因素尚不明确，因此，未来在机制方面有待进一步研究。
作者贡献声明
李晗：酝酿和设计实验，实施研究，采集数据，分析/解释数据，起草文章，统计分析；田李均：酝酿和设计实验，实施研究，分析/解释数据，对文章的知识性内容作批评性审阅，统计分析，行政、技术或材料支持，指导；卞兆连、韩旭东：酝酿和设计实验，分析/解释数据，对文章的知识性内容作批评性审阅，统计分析，获取研究经费，行政、技术或材料支持，指导，支持性贡献；陈强、施玲灵：酝酿和设计实验，采集数据，分析/解释数据，统计分析
利益冲突
所有作者均声明不存在利益冲突
Funding Statement
基金项目：南通市卫健委市级重点学科支持项目（wx2017002）;南通市科技计划项目（JC2020054、MS12018040、MS22018007）;南通市卫健委科研课题（QA2019033、MA2020017）
Fund program: The support Project of Nantong Key Discipline (wx2017002);Science and Technology Program of Nantong (JC2020054, MS12018040, MS22018007);The Scientific Research Project of Nantong Health Commission (QA2019033, MA2020017)
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