替诺福韦酯挽救治疗核苷（酸）类药物多重耐药慢性乙型肝炎患者的疗效观察

核苷（酸）类药物（NAs）抗乙型肝炎病毒（HBV）长期治疗可发生病毒耐药变异，部分患者经换（或）加药优化治疗仍应答不佳。替诺福韦酯（TDF）是无环NAs、是替诺福韦前药，具高效抗HBV活性及高耐药基因屏障，在美国和欧洲是抗HBV一线用药^[1]。我们对TDF单药挽救多重NAs治疗失败的慢性乙型肝炎（CHB）患者进行了为期12个月临床治疗观察，现报道如下。

一、资料与方法

1.研究对象：2009年2月至2013年8月在浙江省人民医院、浙江大学附属第一医院就诊患者，其中CHB患者29例，肝硬化患者2例，诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》^[2]标准，所有病例对2种或以上NAs应答不佳或耐药：（1）HBV DNA较基线下降≤2 log₁₀拷贝/ml（部分病毒学应答），或HBV DNA载量下降＜1 log₁₀拷贝/ml（无病毒学应答）；（2）获得部分或完全病毒学应答后，再次出现HBV DNA较最低上升1 log₁₀拷贝/ml^[3]。排除标准：（1）同时感染人类免疫缺陷病毒及甲、丙、丁、戊型肝炎病毒；（2）自身免疫性肝病或伴有其他严重肝病；（3）中断服药；（4）酗酒；（5）使用肝损害药物；（5）有心、脑、肾疾病，糖尿病，神经及精神病史者；（6）6个月内接受过干扰素、免疫调节剂、细胞毒性药物治疗者。

2.救援治疗方案：在所有患者知情同意的基础上，换用TDF（美国吉利德公司）单药治疗，300mg/d，每晚10时空腹口服，共12个月。

3.观察指标：治疗前及治疗后3、6、9、12个月检测肝肾功能、血磷、钙、血糖、HBV DNA、乙型肝炎标志物等。实时荧光定量PCR检测HBV DNA（罗氏Lightcycle检测仪，试剂购自深圳匹基生物工程有限公司），最低检测限为10³拷贝/ml。化学发光法检测乙型肝炎标志物（Abbott试剂盒）。HBV P基因耐药变异位点由全自动测序仪直接测序，PCR上、下游引物序列分别为5′-CTCCAATCACTCACCAAC-3′、5′-GGGTTTAAATGTATACCCA-3′；测序引物序列为5′-GTAATTCCCATCCC-3′。Mega BACE^TM500测序仪购自美国Amersham Bioscience公司，ET末端荧光标记测序试剂盒为配套产品。

4.疗效判断标准：完全病毒学应答（CVR）为HBV DNA水平低于10³拷贝/ml，生物化学应答为ALT复常，血清学应答为HBe Ag转阴。治疗期间行药物安全性及耐受性评价。

5.统计学方法：用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，CVR累积发生率用Kaplan-Meier评估，单药序贯组与非单药序贯组结果比较用Log-rank检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.患者基线情况：31例患者中男性26例，女性5例，年龄18～57岁，平均（34.16±8.27）岁。TDF治疗前ALT水平（129.26±47.8）U/L，HBV DNA水平（5.83±1.31）log₁₀拷贝/ml，HBe Ag阳性28例，NAs治疗时间8～96个月，平均（33.05±18.35）个月。

2.TDF治疗前方案演变：（1）16例初始单用拉米夫定（LAM），LAM耐药后，13例序贯阿德福韦酯（ADV）应答不佳，再改用LAM联合ADV或ADV联合恩替卡韦（ETV）；2例序贯替比夫定（LDT）治疗；1例序贯ETV治疗。（2）5例初始单用ADV，耐药后2例联合LDT，3例联合LAM。（3）3例初始单用LDT，2例单用ETV，耐药后均加ADV联合治疗。（4）5例初始联合治疗，其中4例为LAM+ADV，1例为ADV+LDT，耐药后改为ETV+ADV联合治疗。

3.HBV变异情况：16例rt M204V/I,3例rt N236T, 2例rt M204V/I+rt N236T,2例N236T+N181T,1例rt M204V/I+rt L236T+rt V173L,1例rt N236T+rt N181T+ rt M204V,6例rt M204V/I+rt L180T。

4.TDF治疗后血清和病毒学应答结果：TDF治疗后3、6、9、12个月的CVR累积发生率分别为58.07%（18/31）、80.65%（25/31）、90.32%（28/31）、96.77%（30/31）。1例HBV DNA未转阴患者临床资料为：男性，48岁，乙型肝炎家族史，TDF治疗前HBV DNA＞10⁸拷贝/ml，先后用LAM、ADV、ETV序贯治疗，发生rt M204V/I+t L236T+V173L联合变异。2例ADV耐药患者TDF治疗后3个月HBV DNA低于10³拷贝/ml，6个月后再次上升为10⁴拷贝/ml，未发现与TDF相关的rt A194T位点变异，存在A181T/V和N236T突变，改用特鲁瓦达（truvada，替诺福韦加恩曲他滨合剂），3个月后再次获CVR。

5.单药序贯治疗与非单药序贯治疗者的病毒学应答比较：16例患者经历2个或以上NAs单药序贯治疗，为单药序贯治疗组，换用TDF治疗后3、6、9、12个月的CVR率分别为3.75%（6/16）、62.5%（11/16）、87.50%（14/16）、93.75%（15/16）。15例无2个或以上NAs单药序贯治疗史，包括单药与联合治疗序贯10例和联合治疗序贯5例，为非单药序贯治疗组，TDF治疗后3、6、9、12个月的CVR率分别为73.77%（12/15）、93.33%（14/15）、93.33%（14/15）、100.00%（15/15）。单药序贯治疗组CVR累积发生率低于非单药序贯治疗组（x²=4.43,P＜0.05）。

6.TDF治疗后ALT复常及HBe Ag转阴结果：TDF治疗前的ALT复常率为9.68%（3/31），TDF挽救治疗后3、6、9、12个月的ALT复常率分别为41.94%（13/31）、61.29%（19/31）、83.87%（26/31）、96.77%（30/31）。TDF挽救治疗后6、12个月的HBe Ag转阴率分别为3.57%（1/28）、7.14%（2/28），与治疗前比较，差异无统计学差异（P＞0.05）。

7.安全性和耐受性评价：治疗期间，所有患者显示出良好药物耐受性，未发生血清ALT反跳，血清肌酐、血磷水平保持正常范围。仅2例患者在治疗期间出现口腔溃疡，经相关治疗后恢复；2例出现乏力症状。

三、讨论

NAs抗HBV治疗耐药后，采取不规范治疗如单药序贯、短期内频繁换药或加药等因素可使患者发生HBV多重耐药突变而致治疗失败^[4]。TDF有较强抑制HBV作用，对HBV野毒株、LAM及ADV诱导的耐药株均有效^[5]。TDF单药挽救多重NAs治疗失败CHB的疗效与安全性报道较少。

本研究结果显示，TDF挽救治疗后，患者CVR累积发生率随治疗时间延长而升高，治疗后12个月达96.77%，ALT水平随HBV DNA下降而恢复。HBe Ag转阴率低，治疗后12个月仅7.14%（2/28）。以上结果提示，对于多重NAs治疗失败患者，TDF原发耐药发生的可能性较低，TDF单药挽救治疗12个月有较好的CVR率及安全性，结果与Kim等^[6]的报道相似。2例ADV耐药患者在TDF治疗期间发生病毒学反弹，可见A181T/V和N236T联合突变可降低HBV对TDF的应答，虽改用truvada后再次转阴，他们是否会获得持久病毒学应答值得长期观察。1例患者TDF治疗12个月应答不佳，是否与乙型肝炎家族史、高病毒载量、多个单药序贯治疗有关，还有待于扩大样本深入研究。

NAs单药序贯抗病毒治疗有筛选多药耐药株风险，尤其是低耐药基因屏障药物，如LAM耐药换ADV单药治疗后，LAM和ADV多重耐药概率明显增加。本研究结果显示，16例患者经历2个或以上NAs单药序贯治疗史，使用TDF治疗后CVR率低于非序贯治疗组。选择加用无交叉耐药药物挽救治疗虽可降低多药耐药风险，但随着联合治疗药物增多，多重耐药联合突变株也将增加，如Sayan等^[7]报道，加药与转换药物的两组患者，耐药突变频率和模式相似。本研究中，15例患者有联合治疗经历，TDF挽救治疗后HBV DNA下降显著，应答水平优于单药序贯组，提示TDF对联合治疗后应答不佳亦有效。

这些多重耐药患者在TDF长期治疗过程中，是否会筛选出新耐药位点，如与TDF耐药相关A194T突变及降低TDF活性的V214A、Q215S变异，尚需要我们长期随访观察。