脂肪滋养蛋白I148M基因多态性与肝细胞癌关系的研究进展

肝细胞性肝癌（HCC）是临床常见的恶性肿瘤之一，位于全球恶性肿瘤死因的第3位^[1]。慢性病毒感染、酒精性肝病、年龄、性别、糖尿病、家族史和种族等均与其发生和发展相关，是多因素、多基因突变的复杂病变过程。HCC早期诊断困难，生存期短，在美国和欧洲国家，其发病率增加很大程度上是由当前流行的丙型肝炎病毒感染所致；在日本，丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒是HCC的主要病因^[2]。另外，最近的统计显示，肥胖导致的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是西方国家和日本癌症发病的第二大原因^[3]。西方国家所有肝癌病例的25%，日本肝癌病例的8%～15%，均来自于非酒精性脂肪肝^[4]。相似危险因素的个体之间，HCC的发病率差异较大，疾病进程亦不尽相同，提示遗传因素及基因多态性与HCC的发病及进展可能有关。这里我们关注脂肪滋养蛋白（patatin-like phospholipase domain-containing 3,PNPLA3）基因rs738409[C/G]多态性（编码I148M）在HCC易感性的遗传因素方面的作用，综述PNPLA3 I148M基因多态性与HCC发生及进展的关系。

一、PNPLA3的发现与结构特征

2001年，Baulande等^[5]在3T3-L1向脂肪细胞分化的过程中发现了一种新的m RNA表达，由于它的脂肪特异性及营养调节特性，被命名为“adiponutrin”。随后，Jenkins等^[6]克隆出了人类i PLA2亚家族的三位成员：i PLA2ε、i PLA2ζ和i PLA2η，其中的i PLA2ε被认为是adiponutrin的人类同源体。Wilson等^[7]鉴定出了人类基因编码的PNPLA家族的10个成员，依次命名为PNPLA1到PNPLA10。此后，PNPLA3被广泛认可。

PNPLA3基因位于人类第22号染色体的长臂13带，包含9个外显子，转录产物有2805个碱基，可翻译出一条包含481个氨基酸残基的跨膜多链。PNPLA3蛋白N末端含有一个高度保守序列Gly-X-Ser-X-Gly（Gly45-Gly49），PNPLA3的活性中心丝氨酸（Ser47）主要位于该序列内，使其在体内外都具有脂肪水解和合成功能。第148位的异亮氨酸（IIe148），位于两端保守序列之间，并在大部分物种中高度保守（图1）。PNPLA3 I148M基因多态性指的是148位鸟替换为胞 从而导致异亮氨酸被蛋氨酸（Met148）替代，蛋氨酸的残基侧链延伸到了催化的部位，掩盖了底物与丝氨酸侧链连接的入口，致使其失去水解酶的活性，增加了脂肪聚集的风险。基因的多态性影响了PNPLA3的表型，从而影响了蛋白的功能，导致能量代谢的紊乱，引起疾病。

图1. PNPLA3的结构示意图.

二、PNPLA3的生物学特征

1.PNPLA3功能的体外研究：对PNPLA3的酶学功能的研究提示它具有分解甘油三 的活性。Western blot检测结果显示大部分PNPLA3分布在细胞的生物膜上，但是细胞质中的PNPLA3具有更强的分解甘油三 的能力^[6]；证实PNPLA3存在于细胞的膜成分中。在3T3-L1向脂肪细胞转化的过程当中，PNPLA3 m RNA的水平从第2天开始迅速升高，到第8天时达到高峰^[5]；提示其在成熟脂肪细胞中是一种不可缺少的m RNA。将细胞培养于无血清和无糖的培养液中时，PNPLA3 m RNA的水平明显下降，将葡萄糖加入培养液中，PNPLA3 m RNA的表达升高了7倍^[5]。

在小鼠原代肝细胞中，过表达鼠PNPLA3增加了细胞内甘油三 的含量。敲除PNPLA3基因后，小鼠肝细胞内脂质聚积减少^[8]。在稳定表达重组PNPLA3的人肝癌细胞中，脂肪酸可以引起PNPLA3蛋白表达的升高，却没有改变PNPLA3 m RNA的水平。PNPLA3的水平随油酸的增加呈剂量依赖性，油酸处理使PNPLA3的半衰期延长了2倍^[9]；提示PNPLA3可能在转录后水平上受脂肪酸调控，调控通过前馈调节来实现。上述发现提示PNPLA3参与了细胞内的能量生成和脂质的代谢。

2.PNPLA3的功能在动物体内的研究：PNPLA3在小鼠体内主要在脂肪组织中表达，基因分析证实PNPLA3在脂肪组织表达比肝脏中高出100到1000倍^[10]。动物实验表明，PNPLA3 m RNA在小鼠白色脂肪和棕色脂肪中高表达，19h的禁食使其降到了几乎检测不到的水平，8h的复饲使其恢复到初始水平。遗传性肥胖的fa/fa大鼠体内脂肪组织的PNPLA3 m RNA的水平较对照组升高了30～50倍，而在瘦素缺乏的肥胖ob/ob小鼠体内的脂肪组织中，PNPLA3 m RNA的表达下调。除了脂肪组织外，肝脏也是一个进行脂肪合成和分解的主要器官。在瘦素缺乏的肥胖ob/ob小鼠的肝脏内，PNPLA3表达约增加22倍^[10]。在小鼠肝脏内过表达PNPLA3可引起血清甘油三含量升高，提示了PNPLA3在肝脏脂肪合成中起了作用^[8]。

在敲除PNPLA3小鼠模型中，脂肪组织、肾上腺和肝脏这些与新陈代谢相关且可正常表达PNPLA3基因的组织中，PNPLA3m RNA表达减少。过表达PNPLA3会扰乱糖耐量，在db/db小鼠肝脏内敲除PNPLA3提高了糖耐量。但敲除小鼠的PNPLA3基因没有引起能量、葡萄糖、脂质代谢的紊乱，也没有引起肝脏脂肪变性或损伤。增加PNPLA3表达的措施也没有改变上述代谢表型^[10]。

3.PNPLA3的功能在人体的研究：在人类，PNPLA3在肝脏中表达量最高。2004年，Liu等^[11]探索了肥胖患者中PNPLA3基因表达的调控。研究发现，PNPLA3m RNA水平在肥胖和非肥胖女性患者中并没有差异。短期或长期极低热量的饮食显著降低了PNPLA3 m RNA的表达，重新进食使PNPLA3m RNA恢复到了正常水平。PNPLA3 m RNA水平与空腹血糖水平呈反比，与胰岛素敏感性呈正比。进食引导的PNPLA3表达的上调提示PNPLA3更多地参与到了脂肪合成过程中。PNPLA3 m RNA的表达受到葡萄糖和胰岛素的严格调控。

美国学者Romeo等^[12]通过GWAS研究筛查了9229个多态性位点，发现22号染色体上PNPLA3rs738409[G]（I148M）单核 酸多态性与肝脏脂肪含量的水平增加显著相关（P=5.9×10^-10）。在调整了种族、体质量指数、乙醇摄入和糖尿病等各项混杂因素后仍相关（P=7.0×10^-4）。Valenti等^[13]进行全基因组关联研究，纳入了7176例受试者，也证实了PNPLA3 rs738409[G]（I148M）基因多态性与肝脏脂肪含量升高密切相关。有研究发现，PNPLA3的表达与肝脏脂肪含量成正比^[14]。这一正比关系在体质量指数＜40kg/m²的受试者中明显，在体质量指数＞40kg/m²的受试者中没有发现。

三、PNPLA3 I148M基因多态性与HCC的相关性

HCC主要好发于慢性肝脏疾病所致的肝硬化患者当中，一些研究已经表明基因多态性在HCC易感性当中的作用^[15,16]。临床研究的证据也支持PNPLA3 I148M基因多态性和HCC的关系（表1）^{[17,18,19,20,21,22,23,24,25,26]}。

表1. PNPLA3基因多态性与HCC关系.

文献来源	发表年份	种族	病因	与HCC的关系
Valenti等[17]	2011	欧洲意大利受试者	慢性丙型肝炎	148M纯合子患H C C的风险增高
Corradini等[18]	2011	欧洲意大利高加索受试者	慢性丙型肝炎相关性肝硬化	148M纯合子是HCC发生的独立危险因素
Falleti等[19]	2011	欧洲	慢性丙型肝炎相关性肝硬化	rs738409多态性是预测H C C发生的独立危险因素
		意大利高加索受试者	慢性乙型肝炎相关性肝硬化
				酒精性肝硬化，代谢性肝硬化
Trepo等[20]	2012	欧洲此利时、法国高加索受试者	酒精性肝硬化	酒精性肝病患者148M纯合子患H C C风险增高
Nischalke等[21]	2011	欧洲意大利高加索受试者	酒精性肝硬化	148M/M纯合子的酒精性肝硬化患者患H C C的风险增高
Burza等[22]	2012	欧洲瑞典受试者	严重肥胖	肥胖受试者中H C C的发病率较高，148M纯合子患HCC的风险增高
Guyot等[23]	2013	欧洲	酒精性肝硬化	rs738409（GG）基因型是酒精性肝硬化患者发生HCC的独立危险因素
Takeuchi等[24]	2013	法国受试者	慢性丙型肝炎相关性肝硬化
Liu等[25]	2013	亚洲	乙型肝炎，丙型肝炎	非乙型非丙型病炎相关HCC患者中rs738409（GG）基因型分布率更高
		日本受试者	非乙型非丙型肝炎
Hassan等[26]	2013	欧洲意大利高加索受试者	非酒精性脂肪性肝炎	携带rs738409（G）基因会增加患HCC的风险
		美国受试者	慢性丙型肝炎，慢性乙型肝炎	rs738409（GG）基因型比CC或CG型患HCC的风险更高
		酒精性肝病，糖尿病	rs738409（GG）基因型是独立的死亡危险因素

注：HCC：肝细胞癌

PNPLA3基因有130个单核 酸多态性位点，有些与肥胖有关，有些与2型糖尿病有关。PNPLA3 I148M多态性（rs738409）的三种基因型分别为CC（野生型纯合子）、GG（突变型纯合子）和CG（突变型杂合子），见表2。这种基因多态性可以影响肝纤维化的进展，进而有导致HCC的风险。

表2. PNPLA3 rs738409[G]（I148M）基因型.

项目	PNPLA3 rs738409[G]（I148M）基因型
	野生型纯合子	突变型纯合子	突变型杂合子
基因位点	CC	GG	CG
氨基酸序列	Ⅱ	MM	IM

人类基因组计划在肝脏疾病方面的两项研究，分别研究了肝甘油三 和转氨酶水平，同时指出PNPLA3 I148M基因多态性在这些共同特征中的影响^[12,27]。欧洲血统的人中有突变基因纯合子的状态（I148M）占5%～8%。PNPLA3 148M等位基因与许多肝脏疾病相关，其中包括肝脂肪含量变化、转氨酶水平上升、晚期的肝纤维化或肝硬化等^[12,17,27]。PNPLA3 I148M为纯合子的长期的慢性肝病和肝硬化的患者，患HCC的风险增加2～16倍^{[17,18,19,20,21,22,23,24,25,26]}。

1.PNPLA3 I148M基因多态性与病毒相关性HCC的相关性：2011年，Valenti等^[17]首次评估了PNPLA3 148M等位基因对慢性丙型肝炎患者肝脏脂肪变性、肝纤维化及HCC的影响。他们对意大利北部两组独立的各包括325例和494例的慢性丙型肝炎患者进行了回顾性分析，应用实时荧光定量PCR检测rs738409基因型，发现10%的患者中检测出rs738409GG基因型，其与脂肪肝相关（OR=1.90, 95%CI:1.4～2.7；P＜0.001），且独立于年龄、性别、体质量指数、糖尿病、酒精摄入和病毒基因型。148M等位基因的纯合子患HCC的风险增高2.2倍，且独立于其他危险因素（OR=2.16,95%CI:1.33～3.59;P=0.002）。

这一研究结果在Corradini等^[18]设计的一项221例意大利高加索人慢性丙型肝炎相关性肝硬化患者的回顾性研究中得到了证实，他们同样发现，相比于其他基因型，148M等位基因的纯合子是HCC发生的独立危险因素（OR=2.23, 95%CI:1.60～3.50;P=0.008）。

2.PNPLA3 I148M基因多态性与酒精性肝病相关性HCC的相关性：在一项高加索人的病例对照研究中，Nischalke等^[21]选取了80例和81例年龄性别匹配无并发症的酒精性肝硬化和丙型肝炎后肝硬化的患者，经多元回归分析证实148M/M纯合子的酒精性肝硬化患者患HCC的风险高2.8倍，（OR=2.8,95%CI:1.24～6.42;P=0.013），而丙肝肝硬化只有HCV基因型1被证实为HCC的危险因素（OR=4.2,95%CI:1.50～11.52,P=0.006）。

同年，Falleti等^[19]对483例意大利高加索肝硬化受试者进行了研究，其中病因为丙型肝炎209例，乙型肝炎76例，酒精性166例，代谢性32例。同时选取428例健康人作为对照组，多变量分析显示，PNPLA3 rs738409多态性被证实是预测HCC发生的独立危险因素（OR=1.76,95%CI:1.06～2.92,P＜0.05）。rs738409多态性的基因型频率分布在肝硬化患者不同，携带G/G基因型者95例，健康对照组中为35例。在肝硬化的病因中，与病毒性肝病相比，G等位基因在酒精性/代谢性肝病患者中过表达（P＜0.001）。相比于其他患者，肝硬化并发HCC患者更容易携带G/G纯合子基因型（P＜0.02）。携带G/G基因型的男性患者HCC发病率最高（43.1%），携带C/C或C/G基因型的女性患者HCC发病率最低（11.2%），携带G/G基因型的女性患者和携带C/C或C/G基因型的男性患者HCC发病率居中（32.9%,P＜0.001）。

Trepo等^[20]也测试了酒精性肝硬化患者PNPLA3rs738409和HCC之间的联系，研究包括了325例比利时高加索患者和246例法国高加索患者，比利时组HCC患者基因型分布为CC 9%，CG 10%，GG 25%；法国组HCC患者基因型分布为CC 28%，CG 41%，GG 78%。等位基因频率在比利时和法国间无统计学意义（分别为36.8%和39.8%，P=0.296）。调整年龄、性别、体质量指数、糖尿病等因素后发现，两个组的隐性遗传模型rs738409与HCC明显相关，酒精性肝病患者PNPLA3 148M纯合子基因患HCC风险高4.7倍。

这一结果在另一项前瞻性研究中也得到了证实。Guyot等^[23]提供了关键数据，确认rs738409（GG）基因型影响酒精性肝硬化患者肝癌的发生。他们评估了法国的279例酒精性肝硬化和253例丙型肝炎后肝硬化患者的PNPLA3 rs738409基因型。使用Kaplan-Meier方法，根据多变量Cox模型，对这些患者随访和筛查后发现，丙型肝炎后肝硬化患者，rs738409基因型没有引起HCC（log-rank=0.7）或死亡（log-rank=0.2）的风险。而酒精性肝硬化患者，rs738409（GG）基因型是HCC发生的一个独立的危险因素（OR=1.72,95%CI:1.21～2.45,log-rank=0.002），同时，老年男性和体质量指数升高也会增加患HCC的风险。

3.PNPLA3 I148M基因多态性与肥胖相关性HCC的相关性：瑞典的一项专门针对肥胖受试者的前瞻性研究于2012年首次研究报道了严重肥胖的人群中PNPLA3 I148M基因突变和HCC的关系，受试者接受减肥手术或常规治疗，平均随访15年。结果显示在肥胖受试者中，HCC的发生率较高，I148M纯合子患HCC的风险高出16倍^[22]。

Takeuchi等^[24]分析了638例在2001年到2010年之间新诊断为HCC的日本患者，其中乙型肝炎72例、丙型肝炎462例、非乙型非丙型肝炎104例。研究显示，非乙型非丙型肝炎相关HCC患者中HCC诊断的TNM分期更晚，预后更差，这些患者中PNPLA3 rs738409G/G基因型分布率更高（P＜0.001），且体质量指数和肝纤维化有关，这些基因型可能影响酒精性肝病相关HCC患者的预后。

4.PNPLA3 I148M基因多态性与非酒精性脂肪肝相关性HCC的相关性：随着非酒精性脂肪肝的发病率的上升，许多国家HCC的发病率也显著提高。HCC发病率在脂肪变性中为0.5%，在非酒精性脂肪肝中为2.8%^[28]。已有研究证实PNPLA3 148M等位基因独立于其他危险因素易诱发非酒精性脂肪肝炎、肝纤维化，肝损伤持续加重，导致晚期肝脏疾病^[12,27]。

Liu等^[25]选取了100例NAFLD相关HCC的欧洲高加索患者与275例NAFLD做对照，研究发现，两组基因型分布频率显著不同，NAFLD相关HCC组CC 28例，CG 43例，GG 29例，NAFLD对照组CC 125例，CG 117例，GG 33例（P=0.0001）。多变量分析调整年龄、性别、糖尿病、体R质量指数、以及有无肝硬化等因素后发现，携带rs738409[G]等位基因会增加患HCC的风险（调整后的OR=2.26，95%CI:1.23～4.14，P=0.0082），GG纯合子是CC基因型的5倍，（95%CI：1.47～17.29;P=0.01）。与1476例英国健康人群相比，风险度更明显（GC/CC:未经调整的OR=2.52，95%CI：1.55～4.10，P=0.0002;GG/CC:OR=12.19，95%CI=6.89-21.58，P＜0.0001）。这些结果提示PNPLA3rs738409[G]多态性不仅增加脂肪性肝炎和肝纤维化的风险，也增加患HCC的风险。

Singal等^[29]纳入24个研究，包括9915例患者的Meta分析显示，PNPLA3与肝纤维化严重程度相关（OR=1.32, 95%CI:1.20～1.45），其中包含的9个研究2937例患者中，PNPLA3与已患有肝硬化的患者发生HCC的风险相关（OR=1.40,95%CI:1.12～1.75）。亚组分析显示，在非酒精性脂肪性肝炎或酒精性肝硬化患者中，PNPLA3是发生HCC的一个独立的危险因素（OR=1.67,95%CI:1.27～2.21），与其他病因引起的肝硬化无关（OR=1.33, 95%CI:0.96～1.82）。

5.PNPLA3 I148M基因多态性与HCC预后：Hassan等^[26]对PNPLA3遗传变异（rs738409C＞G）患HCC风险和预后进行了评估，他们招募了257例新诊断的美国HCC患者，多元回归分析显示，GG基因型纯合子比CC或CG基因型患HCC的风险更高（调整后的OR=3.21，95%CI:1.68～6.41）。PNPLA3GG基因型与患肝硬化的HCC患者显著相关（OR=2.48，95%CI:1.05～5.87）。此外，与CC和CG基因型相比，GG基因是一个独立的死亡危险因素（调整后的OR=2.11，95%CI:1.26～3.52）。PNPLA3遗传变异（rs738409C＞G）可能决定HCC的发展和疾病的预后。

四、总结和展望

综上所述，上述研究提示PNPLA3 I148M基因多态性给慢性肝病患者带来更高的患HCC的风险，虽然与慢性病毒性肝炎和肝硬化等致癌因素相比，特异性相对较差，但由于基因检测的无创性和可操作性，使基因检测具有较广泛的应用前景。PNPLA3基因变异的具体作用机制尚需大样本及不同种族的进一步研究探讨。随着基因研究技术的逐渐成熟，其作用机制会进一步明确，这将有助于筛查早期肝损伤患者患HCC的风险，对研究治疗靶点改善患者的预后有重要的学术价值。