慢加急性肝衰竭患者外周血CD8⁺T淋巴细胞功能障碍与程序性死亡受体1表达的关系

Abstract

Objective

To explore whether peripheralblood CD8⁺T lymphocyte dysfunction is correlated with the programmed death receptor-1 (PD-1) expression in patients with acute-on-chronic liver failure (HBV-ACLF).

Methods

Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were collected from patients with HBV-ACLF and healthy controls. CD8⁺T lymphocytes number and PD-1 expression condition in CD8⁺T lymphocytes were detected by flow cytometry. CD8⁺T lymphocytes isolated from peripheral blood of HBV-ACLF patients were further cultured in vitro. One group was added with PD-L1-IgG fusion protein (ACLF+PD-1 group), and the other group was added with IgG fusion protein (ACLF group). Proliferation ability (ki67), cell viability (CD69), and secretion ability of effector cytokines (IL-2, IFN-γ, TNF-α) were analyzed.

Results

30 cases with HBV-ACLF and healthy controls were enrolled. CD8⁺T lymphocytes absolute number was significantly lower in the peripheral blood of patients with ACLF group (333.88±147.74)/μl than healthy controls (872.50±206.64)/μl (P＜0.001). PD-1 expression in peripheral blood CD8⁺T lymphocytes were significantly increased in ACLF group (13.33%±2.52%), (P＝0.027) than healthy controls (7.02%±2.12%). In in vitro culture, compared with healthy controls, the peripheral blood CD8⁺T lymphocytes cell viability (CD69), proliferation ability (ki67) (all P＜0.001), and the level of cytokine production (IL-2, IFN-γ, TNF-α) (all P＜0.05) were equally weakened in patients with ACLF group. Compared with ACLF group, CD8⁺T cell viability (CD69), proliferation ability (KI67) (all P＜0.05), and the level of cytokine production were weakened in ACLF+PD-1 group (all P＜0.05).

Conclusion

HBV-ACLF patients have CD8⁺T lymphocyte dysfunction. Therefore, PD-1 may have correlation in the regulation of CD8⁺T lymphocyte dysfunction in ACLF patients.

乙型肝炎病毒（HBV）感染诱发的慢加急性肝衰竭（acute and chronic liver failure，ACLF）是我国临床常见的危重肝病症候群，往往病情进展迅速，病死率高^[1]。ACLF患者常伴有免疫功能障碍，从而增加患者继发感染的风险。继发感染是ACLF患者主要死亡原因之一，因此，探讨ACLF患者的免疫功能障碍机制对于临床治疗有重要意义。

程序性死亡分子1（programmed death molecule 1，PD-1）属于CD28超家族，主要诱导性表达于活化的CD8⁺T淋巴细胞，其配体为PD-L1和PD-L2^[2]。研究表明，PD-1/PD-L共刺激信号通路在T细胞活化、增值和细胞因子分泌等各个过程中均发挥重要的负性调节作用^[3]。研究表明，在人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV），丙型肝炎病毒（HCV），以及乙型肝炎病毒（HBV）等慢性病毒感染性中也相继发现PD-1/PD-L通路参与病毒特异性CD8⁺T细胞的功能衰竭的调节^[2]。因此，本研究将探索PD-1是否参与HBV-ACLF患者外周血CD8⁺T淋巴细胞功能障碍。

材料与方法

1.研究对象：选择山西白求恩医院消化科30例HBV-ACLF患者作为研究对象，同时选择30例健康体检患者作为对照组。（1）所有ACLF患者乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳或HBV DNA阳性；（2）符合中国《肝衰竭诊治指南诊断（2018年版）》标准^[4]。

排除条件：（1）合并酒精性、药物性或其他病毒性肝炎者；（2）合并肿瘤患者。该研究通过山西白求恩医院伦理委员会审批（批件号：2017LL039）。

2.ACLF患者及健康对照者外周血CD8+T淋巴细胞亚群表达水平检测：采用EDTA-K2抗凝管收集ACLF患者及健康对照者外周血来检测外周血CD8⁺T淋巴细胞绝对数。（1）取100μl全血，加入有标准微球的试管中，加入CD3-PC5及CD8-PE标记的单克隆抗体试剂10μl，充分混匀，常温孵育20～30min；（2）再加入2ml溶红细胞液，充分混匀，常温孵育10min；（3）1500prm离心5min，弃上清液；（4）加入生理盐水2ml，1500prm离心5min，弃上清液；（5）加入1ml生理盐水，混匀细胞，上机检测。

2.测定免疫磁珠分选CD8⁺T淋巴细胞：收集制备的外周血单个核细胞（PBMC），应用Miltenyi细胞分选磁珠分选人CD8⁺T淋巴细胞。采用阳性选择。加入CD8⁺的磁珠抗体20μl，4℃孵育15min，再加入磁珠缓冲液500μl，洗涤3次后，细胞混悬液过磁柱；CD8⁺细胞留在细胞柱内，以压力压出，整个过程在无菌条件下操作。生理盐水洗涤两次，洗去磁珠。取少量细胞加入CD8-FITC标记的抗体后，上流式细胞仪检测分选的CD8⁺T淋巴细胞的纯度，＞99%纯度为符合实验要求。

4.通过流式细胞分析方法评估PD-1表达水平：分选的CD8⁺T淋巴细胞，用2%磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，FITC偶联抗PD-1抗体染色。将小鼠IgG2b作为同型对照。冰上孵育30min，用2%PBS洗2遍，然后利用流式细胞仪检测PD-1染色情况，最后利用Flow Jo软件进行数据分析。

5.体外培养：采用既往研究使用的方法^[5]，经CD8⁺T细胞纯化柱纯化的细胞，在体外培养48h。健康者分选的CD8⁺T细胞抗人CD28（0.5μg/ml）以及抗人CD3（20U/ml）。ACLF患者的外周血分选的CD8⁺T细胞，一组加入抗人CD28（0.5μg/ml）以及抗人CD3（20U/ml）+PD-L1-IgG融合蛋白（EBioscience，16-9989-82，10μg/ml）（ACLF+PD-1组），一组加入抗人CD28（0.5μg/ml）以及抗人CD3（20U/ml）+IgG（EBioscience，16-4714-82）（ACLF组）。

6.CD8⁺T淋巴细胞增殖能力（ki67）和细胞活力（CD69）和分泌细胞因子[白细胞介素2（IL-2）、干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）]检测：经CD8⁺T细胞纯化柱纯化的细胞，在体外CD3/CD28以及IL-12刺激处理。增殖能力（ki67）和细胞活力（CD69）检测，首先2%PBS重悬，加入ki67（美国BDPharmingen公司，558616）和CD69抗体（美国Bio Legend公司，310904），冰上孵育30min，用2%PBS洗2遍，然后利用流式细胞仪检测。分泌细胞因子IL-2（美国Bio Legend公司）、IFN-γ（美国Bio Legend公司）、TNF-α（美国BDPharmingen公司）的检测需要同时加入PMAphorbolmyristate acetate）（美国Enzo公司）和ionomycin（离子霉素）（美国Enzo公司）培养5h，其加入PMA和ionomycin后3h加入蛋白转运抑制剂Monesin 3μmol/L（美国BD Biosciences公司），离心洗涤后，给予固定、破膜剂处理，加入荧光标记的抗体共同孵育30min，然后流式检测。细胞流式检测采用BD FACS Calibur（美国BD Biosciences公司），采用平均荧光强度（MFI）表示，利用Flow Jo软件进行数据分析。

7.统计学方法：所有统计分析使用SPSS19.0统计软件进行。计量资料以均数±标准差（±s）或中位数表示结果。采用独立样本t检验比较HBV-ACLF患者与健康对照组CD8⁺T淋巴细胞、PD-1、CD69、ki67、IL-2、IFN-γ、TNF-α水平。体外比较ACLF组与ACLF+PD-1组，采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.健康者和HBV-ACLF患者外周血CD8⁺T细胞绝对数和PD-1表达状况：入组ACLF患者包含前期3例，中晚期患者27例。ACLF患者外周血CD8⁺T细胞绝对数（333.88±147.74）明显低于健康对照者（872.50±206.64）个/μl（F＝2.760，P＜0.001）。同时进一步检测PD-1的表达状况，结果发现，相对于健康者（7.02%±2.12%），ACLF患者外周血的CD8⁺T淋巴细胞PD-1表达明显升高（13.33%±2.52%），F＝0.203，P＝0.027，差异有统计学意义。

图1. 健康对照者（HC）与慢加急性肝衰竭患者（ACLF）外周血CD8⁺T细胞所占比例及绝对数（n＝30）.

图2. 健康对照者（HC）与慢加急性肝衰竭患者（ACLF）外周血CD8⁺T细胞PD-1表达状况（n＝30）.

2.健康者和HBV-ACLF患者外周血CD8⁺T淋巴细胞功能的差异分析：在体外培养，相对于健康者，慢加急性肝衰竭患者外周血CD8⁺T细胞处于免疫麻痹状态，其细胞活力（CD69）和增殖能力（ki67）均减弱（均P＜0.001）；产生IL-2、IFN-γ、TNF-α水平减弱（均P＜0.001）（图3）。

图3. 体外培养中，健康组（HC）和慢加急性肝衰竭患者（ACLF）患者组外周血CD8⁺T功能的差异分析.

注：Isotype：同型对照；A：相对于HC组，患者组CD8⁺T细胞活力明显下降（CD69MFI值：3017.4±132.1对比1722.9±142.5，P＜0.001）；B：增殖能力明显下降（ki67MFI值：2603.4±172.8对比1737.2±139.3，P＜0.001）；C：分泌能力明显下降（IL-2 MFI值：330067.2±10033.3对比i50586.9±9157.2，P＜0.001；D：IFN-γMFI值：2423.2±115.6对比1737.4±161.2，P＜0.001；E：TNF-αMFI值：10947.5±819.3对比4049.6±241.5，P＜0.001；流式细胞术检测各因子表达量，计算平均荧光强度MFI值，n＝3。

3.体外培养中PD-1对ACLF患者外周血CD8⁺T细胞的功能的影响：在体外培养，ACLF+PD-1组中PD-1/PD-L1通路激活。相对于ACLF组，ACLF+PD-1组CD8⁺T淋巴细胞其增殖能力（ki67）和细胞活力（CD69）进一步减弱（均P＜0.05）；产生IL-2、IFN-γ、TNF-α水平进一步降低（均P＜0.05）（图4）。

图4. 体外培养中PD-1对ACLF患者CD8⁺T细胞的分泌能力的影响.

注：ACLF：慢加急性肝衰竭；PD-1：程序性死亡分子1；IFN-γ：干扰素γ；TNF-α：肿瘤坏死因子α；Isotype：同型对照；A：检测ACLF组和ACLF+PD-1组细胞活力；B：检测ACLF组和ACLF+PD-1组增殖能力；C：检测ACLF组和ACLF+PD-1组分泌能力；D：检测ACLF组和ACLF+PD-1组IFN-γ MFI值；E：检测ACLF组和ACLF+PD-1组TNF-α MFI值（流式细胞术检测各因子表达量，计算平均荧光强度MFI值，n＝3）

讨论

临床实践中，ACLF患者中后期机体常处于持续的免疫抑制状态，易引发继发感染及相关并发症，增加死亡率。类似固有免疫细胞功能障碍，T细胞功能障碍同样是ACLF免疫抑制的重要机制^[6,7,8]。本研究结果显示，ACLF患者的外周血的CD8⁺T细胞的数量、增殖能力及细胞因子分泌能力均低于健康对照者。进一步研究发现，ACLF患者的外周血中CD8⁺T细胞中PD-1表达增高，体外研究中激活PD-1/PD-L1信号，降低CD8⁺T细胞增殖能力及细胞因子分泌能力。因此，PD-1可能参与调控ACLF患者的CD8⁺T淋巴细胞功能障碍。

ACLF发病过程存在类似脓毒症的免疫耗竭现象，Li等^[6]研究表明类似于脓毒症患者，美国肝病学会诊断标准入组的ACLF患者存在适应性免疫功能障碍，表现为外周血CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞数量显著降低。同样，我们在研究中发现，ACLF患者外周血中CD8⁺T细胞绝对数明显低于健康对照者。PD-1是T淋巴细胞负性功能调控的重要分子。研究表明，PD-1表达上调是T细胞免疫功能障碍的重要机制^[9]。在急性HBV感染的早期阶段，外周血CD8⁺T细胞上PD-1表达上调有助于降低CD8⁺T细胞对肝脏的损伤^[10]。同样，HBV-ACLF常常合并免疫耗竭现象，研究表明HBV-ACLF的肝组织中，PD-1表达上调的免疫细胞数量高于慢性乙型肝炎患者及健康对照者^[11]。同样，有研究表明，在HBV-ACLF患者外周血CD8⁺T细胞上PD-1表达上调，且与病情严重程度呈正比^[12]。

在本研究中，我们发现HBV-ACLF患者外周血CD8⁺T细胞PD-1表达明显高于健康者，同时CD8⁺T细胞的增殖分泌细胞因子的能力低于健康者。因此，这些结果均提示PD-1可能参与HBV-ACLF中CD8⁺T细胞功能障碍或耗竭过程。

相对于效应CD8⁺T细胞，功能障碍或耗竭的CD8⁺T细胞常常表现为细胞增殖能力下降及分泌效应细胞因子（IL-2、IFN-γ、TNF-α）水平下降^[13]。本研究进一步发现，相对于健康者，ACLF患者外周血CD8⁺T细胞的细胞活力（CD69）和增殖能力（ki67）都减弱；产生IL-2、IFN-γ、TNF-α水平减弱。同时，为了进一步探讨PD-1/PD-L1信号在CD8⁺T细胞功能的作用，在体外培养基中加入PD-L1，激活PD-1/PD-L1信号，CD8⁺T细胞的增殖及分泌细胞因子的能力均下降。进一步表明，PD-1/PD-L1信号通路参与ACLF患者CD8⁺T淋巴细胞的功能障碍。

因此，本研究表明，免疫细胞的负性调控因子PD-1可能参与ACLF时CD8⁺T淋巴细胞功能障碍。本研究结果将有助于明确PD-1在ACLF免疫抑制发生过程中的作用，为防治ACLF患者免疫功能障碍提供新的潜在有效的靶点分子，为疾病防治提供新的理论依据。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明

常乐：酝酿和设计实验，起草文章，统计分析；张鑫、张彦萍、秦东媛、刘文娟：实验操作采集数据，柴宝和姚佳：对文章的知识性内容作批评性审阅，支持性贡献

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金青年基金（81700562）;山西省优秀青年基金项目（201801D211009）;山西省136兴医工程（普外科部分2021YZ13）;山西省博士后专项补助经费

Fund program: National Natural Science Foundation of China (81700562);Shanxi Outstanding Youth Fund Project (201801D211009);Shanxi Province 136 Revitalization Medical Project (General Surgery Department, 2021YZ13);Postdoctoral Special Subsidy of Shanxi Province